徐明媛，溫見燕，劉 鵬*

（1．北京大學醫(yī)學部中日友好臨床醫(yī)學院，北京 100029；2．中日友好醫(yī)院 心臟血管外科，北京 100029）

下肢靜脈性潰瘍（venous leg ulcers，VLU）常由慢性靜脈疾?。╟hronic venous disease，CVD）引起，是下肢慢性靜脈功能不全（chronic venous insufficiency，CVI）嚴重和難治的表現。2014年，血管外科協(xié)會和美國靜脈論壇發(fā)布了相關臨床實踐指南，將VLU 定義為發(fā)生在靜脈高壓影響區(qū)域的腿部或足部開放性皮膚病變[1]。其表現通常為位于足靴區(qū)的單發(fā)或多發(fā)的淺表潰瘍，邊緣形狀不規(guī)則，滲出液為黃白色，可見纖維及肉芽組織，壞死組織很少，伴有不同程度的疼痛、下肢浮腫、濕疹及瘙癢[2]。VLU 約占所有下肢潰瘍的70%，每年新發(fā)病率約為1.5%，是最常見的下肢潰瘍類型[3]。研究報告顯示，靜脈潰瘍平均需要6～12 個月的時間才能完全治愈，其中70%可能在閉合5年內復發(fā)。近年研究人員對間充質干細胞 （mesenchymal stem cells，MSCs） 治療皮膚損傷進行了廣泛的研究并觀察到有益的效果。但這些研究主要集中于缺血性傷口、糖尿病傷口和輻照傷口，現就MSCs 治療VLU 其臨床應用和機制做一綜述。

1 VLU 的病理過程概述

VLU 其發(fā)病的中心環(huán)節(jié)是靜脈高壓的形成。CVD 導致局部靜脈曲張，中膜結構受到嚴重破壞，平滑肌細胞（smooth muscle cells，SMCs）失去收縮功能，并向分泌表型轉變，細胞外基質（extracellular matrix，ECM）中膠原蛋白水平增加，彈性蛋白水平降低，降低了靜脈收縮功能；內皮的損傷和瓣膜破壞進一步抑制了靜脈正常收縮的能力。靜脈收縮不良會導致靜脈纖維化，加之小腿肌肉泵功能不足最終形成靜脈高壓[4]，影響淺靜脈、深靜脈和介于兩者之間的穿支靜脈系統(tǒng)。

正常傷口愈合分為止血、炎癥、增殖、重塑4 個連續(xù)階段。VLU 的特征性階段為炎癥持續(xù)狀態(tài)，涉及白細胞（特別是巨噬細胞）以及多種趨化因子、細胞因子、生長因子、金屬蛋白酶的活化和表達。在微循環(huán)中，血管內皮細胞功能障礙，表面糖萼受到剪切應力損傷，激活趨化因子（MCP-1和MIP-1）、黏附分子（ICAM-1、VCAM-1 和選擇素）、內皮調節(jié)因子（NO）等，可誘導白細胞遷移[5]；靜脈高壓導致毛細血管床擴張，內皮窗孔擴大，纖維蛋白原和紅細胞外溢，由于血液和組織液中的纖維蛋白溶解活性不足，纖維蛋白原形成大分子纖維蛋白沉積在毛細血管周圍，阻礙氧氣和其他營養(yǎng)物質通過；同時紅細胞被降解，鐵離子冗余沉積在真皮間質中，紅細胞降解產物、血紅蛋白中的鐵與間質中的蛋白共同作為炎癥介質傳導慢性炎癥信號，吸引巨噬細胞和肥大細胞游走出血管；這些過程促進炎癥級聯(lián)反應，轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGFβ1）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-1（interleukin-1，IL-1）等細胞因子產生增多，以及基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）的表達增加。毛細血管、毛細血管后小靜脈、間質和淋巴管等微循環(huán)結構可對過度反應的炎癥途徑和細胞因子、趨化因子、MMPs、鐵自由基等物質作出反應[2]，導致皮膚和真皮損害。

2 VLU 的壓力治療和外科治療

VLU 的治療主要針對慢性潰瘍和慢性靜脈功能不全2 方面。對不伴發(fā)動脈疾病的靜脈性潰瘍患者，壓力治療是初始和長期治療的標準治療方式。給予潰瘍的靜脈外部壓力可以使液體從組織間隙進入血管和淋巴腔，并增強小腿肌肉泵的活動能力，能夠減輕局部水腫和疼痛、改善靜脈回流、促進愈合和防止復發(fā)[6]。用于壓力治療的裝置分為靜態(tài)壓縮、動態(tài)壓縮和混合壓縮，壓力范圍分為輕度（＜20mmHg）、中度（20～40mmHg）、強（40～60mmHg）、極強（＞60mmHg）[7]，壓力治療6 個月后約有30%～75%的VLU 會愈合[1，3]。但壓力治療易致患者依從性不佳，使用不合規(guī)及隨訪頻率低，限制臨床醫(yī)生對癥狀惡化患者進行干預。對于患有靜脈功能不全但不伴深靜脈阻塞的患者，可選用外科治療手段，包括開放式手術、腔內治療及微創(chuàng)手術等，淺靜脈反流可選擇高位結扎、剝脫或射頻消融[8]；若伴有穿支反流，則需要結扎功能不全的穿通靜脈。盡管進行了適當的治療，VLU 仍有漫長的愈合過程，并可多次復發(fā)，對于復發(fā)性潰瘍的處理需開發(fā)新的治療方式。

3 細胞療法——MSCs 的治療潛力及應用

MSCs 作為一種具備自我更新和多向分化能力的特殊細胞，其來源豐富，免疫原性低，能夠分化為多個譜系細胞，有潛力應用于皮膚缺損的治療[9]。國際間充質干細胞與組織干細胞委員會提出了用于實驗室科學研究的MSCs最低標準：（1） 在標準培養(yǎng)條件下時，MSCs 能貼壁生長；（2）MSCs 必須表達基質細胞相關抗原CD105、CD73 和CD90，并且不表達淋巴造血細胞相關抗原CD45、CD34、CD14/CD11b、CD79α 或CD19 和HLA-DR；3）MSCs 在 體外條件下可以誘導分化為成骨細胞，脂肪細胞和軟骨細胞。目前多項研究已證實MSCs 的應用是治療VLU 較為理想的方案。

3.1 MSCs 在VLU 中的應用

3.1.1 骨髓來源的細胞（bone marrow-derived cells，BMDCs）在VLU 中的應用

骨髓是MSCs 的主要來源之一，在VLU 的治療中有一定的應用。直接將骨髓抽吸物涂抹在潰瘍表面及注入其周圍，可觀察到真皮重建及潰瘍完全閉合；從骨髓抽吸物中分離出MSCs，在體外擴增后將其以纖維蛋白噴霧的形式表達在潰瘍周圍，也可加速皮膚愈合；將骨髓浸潤的膠原蛋白基質覆蓋于潰瘍表面，可誘導出新鮮健康的肉芽組織；以上均表明BMDCs 在促進潰瘍愈合中的有益作用。將處理過的自體BMDCs 多次注射到難治性潰瘍周圍中，可以觀察到潰瘍面積縮小和疼痛感降低，表明自體BMDCs療法安全可行有效[10]。

3.1.2 脂肪來源的基質細胞 （adipose-derived stromal cells，ADSCs）在VLU 中的應用

脂肪組織和骨髓組織一樣，均來自于中胚層，含有大量的細胞基質成分。1964年Rodbell 采用蛋白酶消化和梯度離心的方法，由脂肪組織中分離得到富含細胞成分，并將其命名為基質血管成分（stromal vascular fraction，SVF）。2001年，Zuk 等通過系列研究證實，SVF 中的細胞成分具有多細胞系分化能力。ADSCs 也是多能干細胞，具有與骨髓間充質干細胞相似的特性，它們能表達相同的表面標志物，具有相似的基因表達譜和相似的分化潛能。ADSCs 在脂肪組織中大量存在，且易于分離和擴增，可以替代骨髓來源的干細胞。

Maslowski 等[11]將富含ADSCs 的細胞濃縮物皮下植入到傷口及傷口周圍，進而評估自體ADSCs 移植治療慢性靜脈淤積性潰瘍的安全性和潛在療效。他們觀察到75%的潰瘍有所改善，傷口大小與傷口愈合程度之間呈高度負相關性，且潰瘍愈合與評估的其它參數沒有相關性，治療過程中也沒有觀察到嚴重的副作用，表明ADSCs 的自體移植可能是一種安全且有希望的治療慢性靜脈潰瘍的方法。Zollino 等[12]的研究表明，SVF 中CD34+/CD45-非造血細胞的百分比與愈合時間呈負相關，可能是治療的預測指標。Kavala 等人[13]的研究納入了31 例接受了外科手術而6 個月后未顯示潰瘍治療獲益的患者，將自體SVF 注入到潰瘍及其周圍，并加用彈性繃帶治療，能夠降低一年復發(fā)率。Larsen 等[14]將富含自體ADSCs 的高密度脂肪抽吸物置于OASIS 傷口基質敷料上，每日局部滴入噻嗎洛爾，聯(lián)合壓力治療，使30年VLU 患者的潰瘍完全上皮化，并持續(xù)愈合了15 個月以上；進一步研究證明，噻嗎洛爾能降低局部微生物感染誘導ADSCs 產生IL-6、IL-8 的水平。也有個例研究證明MSCs 移植產生的免疫排斥反應較小。

3.1.3 胎盤MSCs 在VLU 中的應用

一項前瞻性的單臂研究比較了局部應用冷凍保存的人胎盤組織聯(lián)合標準治療與單純標準治療的差異[15]，結果顯示聯(lián)合治療能夠使53%的標準治療無效的VLU 實現潰瘍完全愈合，80%的VLU 潰瘍面積減少一半，這表明胎盤來源的MSCs 可輔助治療慢性難治性VLU。

3.2 MSCs 的作用機制

在慢性傷口環(huán)境中，MSCs 能通過多種機制減輕炎癥持續(xù)反應： 減少促炎細胞因子IL-1、IL-6 和TNF-α 的分泌，同時增加抗炎細胞因子IL-10 的釋放[16]，具有顯著的抗炎能力；誘導巨噬細胞從有極強促炎活性的M1 型轉變?yōu)镸2 型[17]，后者能促進傷口愈合和ECM 沉積，減輕鐵過載引起的組織破壞；分泌抗炎蛋白TSG-6[18]及激活巨噬細胞產生IL-10[19]等機制來抑制炎癥反應，增強機體的免疫調節(jié)作用。MSCs 還能通過旁分泌機制產生許多組織修復介質[20]，包括堿性成纖維細胞生長因子 （basic fibroblast growth factor，bFGF）、角質形成細胞生長因子（keratinocyte growth factor，KGF）、TGF-β、肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）和血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等，誘導細胞遷移和增殖，促進血管新生，重建正常的血液供應，為表皮和真皮細胞的遷移和增殖提供了有利的微環(huán)境。MSCs 還可通過分泌金屬蛋白酶組織抑制劑 （tissue inhibitors of metalloproteinase，TIMP），抑制MMP-2 和MMP-9，保護ECM 和內皮細胞免受破壞。除了分泌可溶性分子外，MSCs 也能釋放外泌體，參與細胞內通訊[21]，促進表皮細胞的遷移和生長、抑制免疫、促進血管新生、抑制瘢痕形成[22，23]。

3.3 總結

細胞療法在VLU 中的應用目前僅限于對標準治療無反應的患者，可被視為壓力治療和外科治療的補充。MSCs來源廣泛、易于獲取、同種移植免疫排斥很小，相比于其他干細胞，更具有治療潛力。對骨髓而言，隨著年齡的增長，MSCs 的數量和分化潛能下降，且獲取骨髓是有創(chuàng)性操作，會給供者帶來一定的傷害，獲取的骨髓中含有許多造血組織，分離純化困難，造成材料浪費；人類胎盤組織MSCs 制成生物產品價格昂貴，沒有成本-效益分析，可能存在倫理問題，研究和應用尚存在困難；而脂肪來源的MSCs 原料更加廣泛，可多次自體取材，并發(fā)癥少，培養(yǎng)成功率高，集落數量最多，基于其綜合優(yōu)勢，脂肪來源的MSCs 可作為治療VLU 最佳細胞來源。臍帶血MSCs 增殖能力最強、免疫原性低、獲取容易[24]，在皮膚缺陷小鼠模型中減少成纖維細胞的積聚，減輕疤痕形成，但目前尚無治療VLU 的臨床應用證據。MSCs 應用途徑有很多，包括注射、涂抹、噴霧等方式，盡管研究結果提示上述途徑均能夠發(fā)揮治療作用，但因其最終存活的MSCs 數量有限，因此療效并不十分理想。相比之下，干細胞條件培養(yǎng)基能收集MSCs 分泌的大量細胞因子，生物工程支架能補充損傷修所需的基質和營養(yǎng)成分，聯(lián)合使用富血小板血漿[25]、含MMPs 抑制劑的傷口敷料[26]等這些應用途徑能最大限度的發(fā)揮MSCs 的治療作用。另外MSCs 的生物學特性具有可塑性，通過對MSCs 進行低氧預處理、生物活性分子預處理、基因修飾預處理和力學刺激預處理等[27]，使其生物效能增強，功能達到最大化。

4 展望

VLU 的病理生理機制復雜，愈合周期長，復發(fā)率高。MSCs 作為一種具備自我更新和多向分化能力的特殊細胞，多項研究均證實其在傷口修復和組織再生中的重要作用，有潛力應用于治療VLU。MSCs 易于獲取，并發(fā)癥少，在VLU 患者中應用均表現出較好的治療效果。但要將其廣泛地用于VLU 的治療仍有幾個關鍵問題需要解決： ①MSCs治療VLU 的分子機制仍不十分明確，需要進一步探究；②需要進一步研究以確定最佳的MSCs 細胞來源和細胞治療方式；③MSCs 治療下肢靜脈潰瘍的周期和不良反應仍不明確，仍需更多動物實驗以及大樣本人體實驗來驗證；④加用細胞治療的時期仍需進一步實驗確定。