朱明利，唐 碧，康品方，張先林

NFATc基因起源于脊椎動物，參與脊椎動物特有的功能，例如復雜的神經系統(tǒng)、重組免疫系統(tǒng)和具有復雜心臟的血管系統(tǒng)[1]。心肌的生理和病理生長通常由膜結合受體啟動，該膜結合受體通過多種GTP酶蛋白、激酶和磷酸酶促進細胞內信號傳導[2]。近期研究結果表明，細胞內持續(xù)升高Ca2+激活鈣調磷酸酶(CaN)使活化的T淋巴細胞的核因子(NFAT)去磷酸化，促進其向核內轉運，從而參與T淋巴細胞中各種免疫應答基因以及其他細胞類型中具有多種功能的基因的轉錄誘導。CaN調節(jié)的NFAT轉錄因子有4種：NFATc1、NFATc2、NFATc3、NFATc4，各自在心肌中表達[3]。Ca2+/CaN/NFATc信號通路在心血管疾病的發(fā)生中起重要的作用，認識該信號通路作用機制將為心血管疾病的診療提供新的依據。

1 Ca2+

Ca2+是所有真核細胞類型中普遍存在的關鍵信號傳導元素，能調節(jié)各種基本的生理過程，例如細胞分化、增殖和運動、凋亡、分泌、興奮、收縮和神經元可塑性。在心臟中，Ca2+最明顯的關鍵作用是其參與電活動和心臟收縮，除了直接參與興奮收縮(excitation contraction，EC)耦合外，還是各種信號級聯(lián)中的重要元素，調節(jié)各種下游效應子的活性[4-5]。因此，Ca2+不但可以發(fā)揮急性作用，還可以參與基因表達的調控，稱為激發(fā)轉錄(excitation transcription，ET)耦合。這些ET偶聯(lián)途徑不僅能夠維持心臟動態(tài)平衡而且在心臟病的發(fā)展中都起著至關重要的作用[6]。

2 CaN

CaN是由催化亞基A(CnA)和調節(jié)性亞基B(CnB)組成。CnA包含1個磷酸酶催化結構域、1個CnB結合結構域、1個鈣調蛋白結合結構域和羧基末端自動抑制結構域(AID)?；罨癄顟B(tài)下，細胞質Ca2+濃度的升高有助于鈣調蛋白取代AID，并通過激活CnB中的Ca2+結合EF-手基序來促進CnB與CnA的結合，從而導致CaN的活化[7]。活化的CaN使NFAT同源區(qū)域(NHR)中的多個磷酸殘基去磷酸化，從而導致NFAT胞質-核轉運并與內皮轉錄因子-4(GATA4)協(xié)同作用[8]。因此，鈣調神經磷酸酶在NFAT脫磷酸作用中起關鍵作用。

3 NFATc

NFAT的轉錄因子NFATc家族，有5個亞型：NFAT1(NFATc2)、NFAT2(NFATc1)、NFAT3(NFATc4)、NFAT4(NFATc3)及NFAT5(NFATL1)[2]。NFAT1-4是由NHR、Rel同源區(qū)域(RHR)和C端結構組成。NHR包含1個N末端反式激活結構域(TAD)即CaN結合位點，核定位序列(NLS)和核輸出信號(NES)，此外其帶有SRR1、SRR2、SP1、SP2和SP3富含絲氨酸的基序；RHR包含DNA結合域和具有其他轉錄結合伴侶(例如Fos和Jun)的識別點[9]。因此，Ca2+/CaN途徑調節(jié)NFAT1-4，但不能激活NFAT5，因為其缺乏NHR。靜息狀態(tài)下，NFAT位于細胞核中，當NHR絲氨酸基序去磷酸化時，NFAT中的核定位序列(NLS)暴露，導致NFAT蛋白從細胞核轉到細胞質[10-11]。

4 Ca2+/CaN/NFATc信號通路的激活

NFAT的顯著特征是受Ca2+/CaN途徑的調節(jié)。NFAT蛋白被磷酸化并駐留在靜息細胞的細胞質中，細胞表面的受體與配體結合可誘導磷脂酶C(PLCy)的活化并水解成二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)、二?；视?DAG)和肌醇三磷酸(IP3)[12]。IP3與內質網(ER)膜上的Ca2+滲透性IP3受體(IP3R)結合，并刺激Ca2+從存儲區(qū)釋放到細胞質中，NFAT蛋白受到刺激后，被鈣調神經磷酸酶去磷酸化，易位從細胞質轉移至細胞核，并具有轉錄活性。同時細胞質Ca2+的增加導致Ca2+傳感器鈣調蛋白(CaM)的激活，而CaM進一步激活CaN[13]。因此，細胞內Ca2+/CaN/NFATc信號傳導與基因表達之間具有直接聯(lián)系。

5 Ca2+/CaN/NFATc信號通路與心血管疾病

5.1 Ca2+/CaN/NFATc信號通路與原發(fā)性高血壓 原發(fā)性高血壓是最常見的心血管疾病之一，也是心血管疾病的主要危險因素。原發(fā)性高血壓的發(fā)病機制包括遺傳、飲食、心理因素以及神經內分泌機制。研究表明，淋巴細胞，特別是T淋巴細胞參與高血壓的發(fā)生、發(fā)展和血管重塑。NFAT的核因子在許多免疫細胞中表達，包括T淋巴細胞、B淋巴細胞、自然殺傷細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞和單核細胞[14]。NFAT鉀通道可增強鉀離子外排，從而增加細胞膜兩側的電勢梯度，產生超極化作用以促進Ca2+流入，引起Ca2+濃度的瞬時增加，以及隨后CaN介導的NFAT去磷酸化和NFAT信號通路激活[15]。激活NFAT信號通路并導致進一步的淋巴細胞激活，活化的淋巴細胞產生其他炎性細胞因子，例如白細胞介素(IL)-17，并促進血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)釋放。這種包括IL-6、IL-17和AngⅡ在內的炎性環(huán)境以及其他細胞因子會促進鈉在腎臟系統(tǒng)和血管中的滯留，導致血管收縮和血管重塑，最終導致高血壓[16]。

5.2 Ca2+/CaN/NFATc信號通路與冠心病 冠心病是一種以動脈粥樣硬化為基本病變的心血管疾病。轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)信號分子家族在心外膜途徑控制的冠狀動脈發(fā)育中起著重要作用[17]。CaN-NFAT通過激活Smad 2的表達，以控制TGF-β/活化素受體樣激酶5(Alk5)信號轉導對冠狀動脈的發(fā)育。有研究通過在小鼠心肌實驗發(fā)現CaN-NFATc3/c4信號通路通過抑制不同血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)配體與受體的結合來控制冠狀血管的發(fā)育[18]。血管鈣化是動脈粥樣硬化的主要特征，是一個復雜的過程，與骨骼鈣化有許多相似之處。目前研究顯示許多因素參與血管鈣化，氧化低密度脂蛋白(oxLDL)是最主要的因素，其既可以促進動脈粥樣斑塊的形成又可促進血管鈣化[19]。Brown等[20]在研究主動脈平滑肌細胞(BASMC)原代培養(yǎng)中成骨細胞分化的機制發(fā)現oxLDL通過增強β-甘油磷酸酯激活Smad 1、Smad 5、Smad 8信號分子促進Runx2、 Osterix(Osx)成骨細胞轉錄因子表達和血管鈣化的形成。有研究發(fā)現NFAT信號可以介導oxLDL損傷血管平滑肌，從而誘導血管平滑肌鈣化和向成骨細胞分化[21]。

5.3 Ca2+/CaN/NFATc信號通路與心肌肥大 心肌肥大對心室壁張力的增加或神經體液刺激的適應性反應起初有益，但持續(xù)的心肌肥大可導致心力衰竭和其他不良心血管事件的發(fā)生。目前認為CaN/NFAT信號傳導可作為介導多種形式病理性心肌肥大的關鍵控制點，但該途徑需要與其他信號傳導效應因子協(xié)同作用[22]。已證明有絲分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)影響CaN，NFAT信號傳導也受其影響。MAPK信號通路通常分為3個主要分支，包括p38激酶、c-Jun N末端激酶(JNK)和細胞外信號調節(jié)激酶(ERK)，一旦激活，p38、JNK和ERK就會磷酸化一系列細胞內靶標，其中包括許多轉錄因子，導致心臟基因表達重新編程為肥大性程序的一部分[23-24]。有研究顯示，無論在細胞培養(yǎng)還是整個動物研究發(fā)現Ras直接激活Raf-1激酶，從而激活促分裂原激活的蛋白激酶(MEK1)-ERK1/2信號增強NFAT轉錄活性[1]。此外，顯性負性MEK1突變體可以阻斷T淋巴細胞中的NFAT活化，即ERK1可以通過一種涉及NFAT蛋白N端調節(jié)域內直接磷酸化的機制直接拮抗COS細胞中NFATc1的核輸入。這類似于糖原合酶激酶3(GSK3)、JNK1/2、p38、蛋白激酶A(PKA)和酪蛋白激酶1(CK1)這5個激酶直接磷酸化多個NFAT因子中的N末端調節(jié)域，從而拮抗CsN介導的去磷酸化和隨后的NFAT核易位[25]。

5.4 Ca2+/CaN/NFATc信號通路與心肌纖維化 心肌纖維化是心臟病理性重塑的標志性特征，其病理機制是細胞外基質(ECM)的過量沉積和成纖維細胞(CF)的不斷增生，導致心臟僵硬度增加、心臟收縮和舒張功能降低，心臟的正常電生理結構改變會誘發(fā)心律失常，甚至猝死[26]。大量證據表明，Ca2+是一種通用的細胞內信使，參與了心臟纖維化。存儲的Ca2+(SOCE)是細胞外Ca2+進入細胞的重要機制，基質相互作用分子1(STIM1)和鈣釋放激活鈣通道蛋白1(Orai1)是SOCE的兩個主參與者。心肌受到刺激后，成纖維細胞中的Ang Ⅱ激活導致STIM1與細胞內的Orai1和Ca2+相互作用從而引發(fā)心肌纖維化級聯(lián)反應。NFAT途徑響應Ca2+信號傳導途徑，參與纖維形成過程[27]。TGF-β/ Smad途徑也是與纖維化相關的重要信號途徑，Ang Ⅱ的激活顯著上調了轉化生長因子-β1(TGF-β1)的mRNA，并增加了TGF-β下游信號標記的磷酸化。研究表明，Ca2+內流激活Smad 2、Smad 3依賴性TGF-β信號傳導，從而促進平滑肌肌動蛋白(a-SMA)和膠原蛋白的表達上調，因此，推測Ang Ⅱ刺激通過SOCE誘導了連續(xù)的Ca2+流入，隨著胞質Ca2+濃度升高這足以激活CaN/NFAT信號通路以啟動轉化生長因子(TGF)/Smad途徑，最終導致心肌纖維化[20]。

6 Ca2+/CaN/NFATc信號通路抑制劑

CaN-NFAT信號已成為調節(jié)心肌和血管平滑肌細胞(VSMC)炎癥和增生的關鍵治療靶標。目前，臨床常用鈣信號特異性阻斷藥免疫抑制劑CsA和FK506通過形成CsA-親環(huán)蛋白或FK506-FKBP12復合物而破壞了CaN的活性。盡管已被證明有效，但在破壞CaN活性的同時也影響了CaN下游信號通路的轉導，對機體產生不可避免的副作用和毒性[28]。針對于此開發(fā)出針對CaN下游信號NFAT選擇性更強、毒性更小的免疫抑制劑VIVIT，其通過阻止CaN和NFAT的蛋白質-蛋白質相互作用來選擇性抑制NFAT活化，但不會影響CaN的活性。與傳統(tǒng)的鈣信號抑制劑CsA和FK506相比，VIVIT顯示出更高的選擇性，VIVIT可以有效抑制鈣調蛋白激活的NFATc1、NFATc2和NFATc3的去磷酸化和NFATc2的核轉運，阻斷了NFAT介導IL-2、IL-3、IL-13、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)的活性，但不會影響NFAT和促分裂原激活的MEK-ERK通路協(xié)同觸發(fā)VSMC增殖的作用[29]。因此，VIVIT作為選擇性NFAT抑制劑是進一步研究的首選。

7 小 結

Ca2+/CaN/NFATc信號通路在心血管疾病(高血壓、冠心病、心肌肥大，心肌纖維化)發(fā)病機制中涉及的信號通路非常復雜，具體的機制還需進一步探究。目前，開發(fā)出的以CaN底物NFAT為靶點的VIVIT免疫抑制劑在體外和體內試驗中顯示出了無數的前景，其不僅是探索CaN-NFAT信號傳導的有用工具，而且還為治療心血管疾病的新型療法開辟了道路。