許明，林世強(qiáng)，倪冬昕，伊恒杰，劉江洪，楊志堅(jiān)，鄭金貴

藤茶查爾酮合成酶基因的克隆及功能鑒定

許明，林世強(qiáng)，倪冬昕，伊恒杰，劉江洪，楊志堅(jiān)，鄭金貴

（福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)學(xué)院/作物生物技術(shù)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/作物遺傳育種與綜合利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350002）

【】查爾酮合成酶（chalcone synthase，CHS）是植物類黃酮生物合成的第一個(gè)關(guān)鍵酶，從藤茶中克隆，分析其序列特征及其在藤茶中的組織表達(dá)特異性，通過(guò)體外酶活性檢測(cè)和煙草遺傳轉(zhuǎn)化對(duì)其功能進(jìn)行鑒定，為進(jìn)一步研究藤茶類黃酮累積的調(diào)控機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。根據(jù)藤茶轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)引物，以藤茶葉片cDNA和基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增得到。利用生物信息學(xué)方法分析該基因的序列特征，使用MEGA6和DNAMAN軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)獲得的重組蛋白，分析該重組蛋白對(duì)底物的催化活性，并通過(guò)高效液相色譜-質(zhì)譜（HPLC-MS）對(duì)酶促反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)在藤茶不同器官的表達(dá)水平進(jìn)行分析，并采用硝酸鋁比色法測(cè)定相應(yīng)的總黃酮含量變化。構(gòu)建植物過(guò)量表達(dá)載體，通過(guò)葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因后代，對(duì)T2代株系花瓣中的花青素和黃酮醇含量進(jìn)行檢測(cè)。的ORF長(zhǎng)1 182 bp，編碼393個(gè)氨基酸，基因組序列長(zhǎng)1 315 bp，含2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子。生物信息學(xué)分析表明，AgCHS1為穩(wěn)定的親水蛋白。通過(guò)與其他物種的CHS蛋白多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，AgCHS1含有查爾酮合成酶家族的特征序列和活性位點(diǎn)殘基，包括丙二酰CoA結(jié)合位點(diǎn)和三聯(lián)活性中心位點(diǎn)，與其他物種的CHS序列一致性較高。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，AgCHS1與葡萄、山葡萄的CHS處于同一進(jìn)化分支，親緣關(guān)系最近。熒光定量PCR結(jié)果表明，在成熟葉和花中的表達(dá)量最高，在老葉中的表達(dá)量最低。藤茶不同器官的總黃酮含量與表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)。體外酶活性分析顯示，重組的AgCHS1蛋白可以催化底物對(duì)-香豆酰輔酶A和丙二酰輔酶A生成柚皮素，說(shuō)明該蛋白具有查爾酮合成酶活性。獲得5株煙草轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系，其中2株的花瓣顏色明顯加深；與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)基因株系OE3、OE4花瓣中的花青素含量分別提高56.6%和25.3%，OE3的黃酮醇含量沒(méi)有顯著差異，OE4的黃酮醇含量提高39.1%。AgCHS1是藤茶中催化合成查爾酮的關(guān)鍵酶，過(guò)量表達(dá)可以提高轉(zhuǎn)基因植物中花青素和黃酮醇的含量。

藤茶；查爾酮合成酶；酶活性；花青素；黃酮醇

0 引言

【研究意義】藤茶學(xué)名為顯齒蛇葡萄（W.T.Wan），屬于葡萄科蛇葡萄屬藤本植物，主要分布在中國(guó)福建、云南、廣東、廣西、貴州和湖南等長(zhǎng)江以南的山區(qū)，民間將其作為茶藥兩用植物應(yīng)用已有數(shù)百年的歷史[1]。藤茶的主要有效成分是以二氫楊梅素為主的黃酮類化合物，具有抗氧化、保肝護(hù)肝、降血壓和抗腫瘤等多種功效[1-3]。研究表明，品種、季節(jié)和栽培條件等多種因素都會(huì)造成藤茶黃酮含量出現(xiàn)較大差異，從而影響藤茶產(chǎn)品的質(zhì)量甚至療效[3-5]。因此，開(kāi)展藤茶黃酮類化合物合成關(guān)鍵基因的克隆、功能鑒定及其調(diào)控機(jī)制研究，對(duì)藤茶藥用品質(zhì)提升及其資源持續(xù)高效利用具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】黃酮類化合物（又稱類黃酮）的生物合成途徑在國(guó)內(nèi)外已有了較為廣泛地研究，其合成途徑的主要步驟已基本探明[6]。查爾酮合成酶（chalcone synthase，CHS）屬于III型聚酮合成酶（polyketide synthase，PKS）家族，是類黃酮合成途徑中的第1個(gè)關(guān)鍵結(jié)構(gòu)酶，負(fù)責(zé)催化3分子丙二酰CoA與1分子的對(duì)-香豆酰輔酶A縮合形成柚皮素查爾酮，并進(jìn)一步生成黃酮醇、異黃酮和花青素等各類黃酮類化合物[7]。廣泛存在于高等植物中，目前已經(jīng)在煙草[8]、虎杖[9]、蘋果[10]、桑樹(shù)[11]、雪蓮[12]、地錢[13]、香雪蘭[14]等多種植物中被克隆，并明確了其功能。主要以多基因家族形式存在[15]，不同植物中數(shù)目不等，例如在水稻中可能有27個(gè)[16]，煙草中至少有5個(gè)成員[8]，而金魚(yú)草中只有1個(gè)[17]。近期Li等[18]利用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，注釋了多條與藤茶相關(guān)的unigene，暗示在藤茶中也是以多基因家族形式存在。對(duì)不同植物的分子系統(tǒng)進(jìn)化研究發(fā)現(xiàn)，超基因家族的起源較早，但在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，家族成員內(nèi)部發(fā)生了多樣的遺傳改變，使其功能上可能各有分工[7]。典型的CHS催化生成查爾酮，進(jìn)入花青素合成途徑，而其他成員則催化生成一些與植物抗逆相關(guān)的產(chǎn)物[15]。增強(qiáng)或抑制不同植物的表達(dá)，能改變植物花色或抗逆能力[14,19-20]。此外，的表達(dá)受發(fā)育階段和環(huán)境因子的影響，在不同組織和器官中的表達(dá)模式也存在差異[21-22]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】前期研究已從藤茶中克隆和注釋了一部分，并對(duì)其序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析[18,23]，但對(duì)其功能的研究尚未見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序基礎(chǔ)，從藤茶中克隆得到1條的編碼區(qū)序列，命名為，通過(guò)生物信息學(xué)分析、組織表達(dá)特異性分析、體外酶活性檢測(cè)和煙草遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，探討該基因在藤茶類黃酮生物合成過(guò)程中的作用，為進(jìn)一步研究藤茶類黃酮高效累積的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2017年9月至2020年5月在福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)學(xué)院作物生物技術(shù)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 植物材料與試劑

藤茶引自福建尤溪縣下村林場(chǎng)，經(jīng)福建農(nóng)林大學(xué)植物學(xué)教研室鑒定為葡萄科蛇葡萄屬顯齒蛇葡萄。在同一植株上分別采集幼葉、成熟葉、老葉、莖、花和根，液氮速凍后研磨成粉末，然后分成2份，一部分用于總RNA提取，另一部分凍干后貯存于-80℃冰箱，用于總黃酮的提取與含量測(cè)定。

植物總RNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取DNA和膠回收試劑盒購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司。限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、克隆載體pMD-18T、原核表達(dá)載體pET28a-pGTf2、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞（DH5α）、ExTaq DNA聚合酶購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒和Sybr Green qPCR Master Mix購(gòu)自BBI生命科學(xué)有限公司。二氫楊梅素、槲皮素對(duì)照品購(gòu)自上海同田生物技術(shù)股份有限公司，丙二酰輔酶A、柚皮素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，對(duì)-香豆酰輔酶A購(gòu)自德國(guó)MicroCombiChem公司。引物合成和測(cè)序均由上海生工有限公司合成。

1.2 基因組DNA、總RNA的提取和第一鏈cDNA合成

采用CTAB法提取藤茶葉片基因組DNA。藤茶不同組織RNA的提取參照筆者實(shí)驗(yàn)室前期建立的方法[24]進(jìn)行，煙草總RNA的提取參考植物RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA和總RNA的完整性，用Nanodrop 2000分光光度計(jì)測(cè)定樣品濃度和純度。利用PrimeScript? RT reagent試劑盒（Takara）將總RNA反轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA。

1.3 AgCHS1的克隆與序列分析

根據(jù)前期藤茶葉片轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序結(jié)果（NCBI登錄號(hào)：SRP241021），設(shè)計(jì)5′端分別帶H I和I酶切位點(diǎn)的特異性引物AgCHS1-F/R（表1），分別以藤茶葉片DNA和cDNA為模板，利用ExTaq DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 60 S，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后回收目的片段，將回收產(chǎn)物與pMD18-T載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。

表1 本試驗(yàn)中所用的引物序列

將測(cè)序所得序列在NCBI上進(jìn)行同源性比對(duì)（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），借助ProtParam（http://www.expasy.ch/tools/protparam.html）分析編碼蛋白質(zhì)的氨基酸組成、等電點(diǎn)和相對(duì)分子質(zhì)量。使用CDD（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）分析其保守結(jié)構(gòu)域。采用DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸的多重比對(duì)分析。使用MEGA 6軟件構(gòu)建不同物種CHS蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.4 AgCHS1重組蛋白原核表達(dá)及純化

用HⅠ和Ⅰ雙酶切含有的pMD-18T載體，回收片段，連接到用相同內(nèi)切酶消化的pET28a-pGTf2載體上，將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)中，鑒定出陽(yáng)性單菌落并測(cè)序。確定序列及載體組裝無(wú)誤后，使用0.4 mmol?L-1IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，誘導(dǎo)表達(dá)條件及步驟參照LIN等[25]的方法。采用Bradford法測(cè)定蛋白濃度。

1.5 AgCHS1體外酶活性試驗(yàn)

AgCHS1酶活性測(cè)定參照YAHYAA等[10]的方法并略作修改，250 μL反應(yīng)體系包括15 μmol·L-1的對(duì)-香豆酰輔酶A、56 μmol·L-1的丙二酰輔酶A、0.1 mol·L-1磷酸鉀緩沖液（pH 7.0）以及2.0 μg純化的AgCHS1。將上述反應(yīng)體系置于35℃下反應(yīng)30 min后，加入等體積乙酸乙酯抽提2次，于12 000 r/min離心10 min；取上清液真空干燥后，加入250 μL 50%（v/v）的甲醇水溶液溶解殘留。通過(guò)UPLC（Waters，2695）對(duì)酶促反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行初步分析，再利用HPLC-MS（Thermo Fisher，LCQ Fleet）對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。液相條件：液相柱BEH C18，粒徑1.7 μm, 2.1 mm×100 mm；柱溫35℃；進(jìn)樣量2 μL。A相：1.0%乙酸；B相：100%乙腈；流速：0.3 mL?min-1。質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧（ESI-），毛細(xì)管溫度300℃，鞘氣（N2）15 arb，噴霧電壓-4.47 kV，檢測(cè)電壓1.5 kV，時(shí)間100 ms，碰撞氣體He，母離子選擇寬度：3 u，采集范圍100—600 m/z。

1.6 基因表達(dá)分析

根據(jù)所獲得的序列，采用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物（表1）。藤茶的內(nèi)參基因?yàn)閇26]，煙草的內(nèi)參基因?yàn)?。熒光定量反?yīng)體系為：SybrGreen qPCR Master Mix（2×）10 μL，10 μmol·L–1上、下游引物各0.4 μL，cDNA 2 μL，加ddH2O至終體積20 μL。反應(yīng)在ABI StepOne型熒光定量PCR儀上進(jìn)行，程序?yàn)?5℃變性3 min，95℃變性5 s，60℃退火延伸30 s，45個(gè)循環(huán)，于60℃收集熒光，反應(yīng)結(jié)束后分析熒光值變化曲線和熔解曲線，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次，采用2?ΔΔCt算法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.7 植物表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因煙草的獲得

利用H Ⅰ和I雙酶切pBI121載體，回收載體大片段，與1.3中回收的片段連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)酶切鑒定陽(yáng)性克隆，得到植物表達(dá)載體pBI-35S:AgCHS1，采用凍融法將其導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105中，按照Ning等[27]的方法進(jìn)行煙草遺傳轉(zhuǎn)化。提取T0代抗性植株葉片DNA，用引物AgCHS1-P1/P2進(jìn)行PCR驗(yàn)證，陽(yáng)性植株連續(xù)自交種植2代后獲得T2代植株，用于后續(xù)的檢測(cè)。

1.8 黃酮類物質(zhì)的提取與測(cè)定

藤茶不同器官總黃酮的提取參照Li等[18]介紹的提取方法，然后采用硝酸鋁比色法[28]，檢測(cè)樣品溶液在324 nm波長(zhǎng)的吸收值，通過(guò)二氫楊梅素的標(biāo)準(zhǔn)曲線換算樣品中的總黃酮含量。煙草花瓣花青素的提取與測(cè)定按照Wang等[29]的方法，并略作修改。取50 mg野生型和轉(zhuǎn)基因煙草的花瓣（鮮重，M），加入1 mL酸化甲醇（含1% HCl（v/v）），黑暗條件下提取24 h，10 000 r/min離心10 min，取上清液，用紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)（Thermo Scientific，Evolution 201）測(cè)定530 nm與657 nm處的吸光值（A530和A657）。相對(duì)花青素含量（Q）用公式（Q=（A530-0.25×A 657）M）計(jì)算。煙草花瓣黃酮醇的提取與測(cè)定參照TIRUMALAI等[30]的方法進(jìn)行，并略作修改。取100 mg新鮮的煙草花瓣在液氮中研磨成粉末，加入2.0 mL 75%乙醇提取3 h，濾液干燥后，溶解于1.0 mL 75%乙醇中。取0.1 mL提取液，加入0.5 mL 5% NaNO2，搖勻放置6 min，再加10% Al（NO3）3，搖勻放置6 min，最后加入2.5 mL 1.0 mol·L-1NaOH溶液中止反應(yīng)，放置15 min后，在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光值。按照槲皮素的標(biāo)準(zhǔn)曲線換算樣品中總黃酮醇含量。

2 結(jié)果

2.1 AgCHS1的克隆和生物信息學(xué)分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序信息，設(shè)計(jì)特異性引物，以藤茶葉片cDNA為模板，擴(kuò)增得到的ORF序列（GenBank登錄號(hào)為MT316507）長(zhǎng)度為1 182 bp，編碼393個(gè)氨基酸。以基因組DNA為模板，擴(kuò)增得到的gDNA序列（GenBank登錄號(hào)為MT316508）長(zhǎng)度為1 315 bp（圖1-A），與ORF序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，具有一個(gè)內(nèi)含子（133 bp），外顯子1為178 bp，外顯子2為1 004 bp，內(nèi)含子遵循GT/AG規(guī)則（圖1-B）。

通過(guò)ProtParam在線分析AgCHS1蛋白理化性質(zhì)，其理論分子量為42.8 kD，理論等電點(diǎn)（pI）為6.15，分子式為C1908H3059N513O565S19，帶負(fù)電荷的氨基酸（Asp+Glu）為48個(gè)，帶正電荷的氨基酸（Arg+Lys）為43個(gè)，不穩(wěn)定系數(shù)為34.71，屬于穩(wěn)定性蛋白。平均親水性（GRAVY）為-0.045<0，表明AgCHS1屬于親水性蛋白。

A：AgCHS1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，M：DL5000；1：ORF擴(kuò)增產(chǎn)物；2：基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物。B：AgCHS1的結(jié)構(gòu)

利用DNAMAN軟件將AgCHS1與葡萄、水稻、擬南芥、煙草等常見(jiàn)植物的CHS進(jìn)行序列多重比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該蛋白與葡萄CHS的氨基酸序列相似度最高，達(dá)到96.7%，與陸地棉、水稻、擬南芥、煙草的相似度分別為89.1%、82.2%、84.5%和86.5%，與付明等[23]報(bào)道的藤茶CHS氨基酸序列存在較大差異，二者相似度為88.1%。AgCHS1含有查爾酮合成酶家族典型的Cys-His-Asn三聯(lián)活性中心位點(diǎn)和2個(gè)高度保守的苯丙氨酸殘基Phe215和Phe265（圖2），這些位點(diǎn)與查爾酮合成酶底物特異性相關(guān)[29]。此外，AgCHS1還具有丙二酰輔酶A結(jié)合位點(diǎn)和2個(gè)高度保守的CHS特征序列RLMMYQQGCFAGGTVLR和GVLFGFGPGL（圖2）。進(jìn)一步說(shuō)明本研究所克隆的序列為藤茶的序列。

采用MEGA 6軟件鄰接法（Neighbor-Joining，NJ），對(duì)包括藤茶在內(nèi)的14種植物的CHS蛋白序列進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果顯示，藤茶AgCHS1與同科的葡萄、山葡萄進(jìn)化關(guān)系最近，與圓葉葡萄、茶樹(shù)、陸地棉的進(jìn)化關(guān)系也較近，而與白鮮、甜橙等進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)（圖3）。

2.2 藤茶不同器官AgCHS1的表達(dá)及總黃酮含量

對(duì)在藤茶幼葉、成熟葉、老葉、莖、花和根中的表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，在藤茶所有器官中均有表達(dá)。其中，成熟葉和花中的表達(dá)量最高，在老葉中的表達(dá)量最低。在葉片3個(gè)不同發(fā)育時(shí)期，的表達(dá)水平呈先升后降的趨勢(shì)?？傸S酮含量變化趨勢(shì)與的表達(dá)變化基本一致（圖4），二者在0.05水平上呈顯著正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)為0.9224），說(shuō)明的表達(dá)在藤茶總黃酮積累過(guò)程中可能發(fā)揮著重要作用。

2.3 AgCHS1的原核表達(dá)、純化與酶活性測(cè)定

將重組質(zhì)粒pET28a-AgCHS1/pGTf2轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，超聲裂解和Ni親和層析柱純化，得到純化的AgCHS1重組蛋白。經(jīng)SDS-PAGE確定其分子量約為43 kD（包括His標(biāo)簽），與預(yù)期分子量大小一致（圖5）。通過(guò)Bradford法測(cè)定AgCHS1蛋白含量為0.75 mg?mL-1。

在體外酶促反應(yīng)中，當(dāng)以對(duì)-香豆酰輔酶A與丙二酰輔酶A為底物時(shí)，AgCHS1能有效催化柚皮素查爾酮合成，然后柚皮素查爾酮自發(fā)異構(gòu)化為柚皮素。HPLC-MS結(jié)果顯示，AgCHS1酶促反應(yīng)產(chǎn)物色譜峰的保留時(shí)間出現(xiàn)在6.8 min，與柚皮素標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間一致（圖6-A、B），而空載蛋白對(duì)照組未觀察到目標(biāo)峰（圖6-C）。柚皮素標(biāo)準(zhǔn)品二級(jí)質(zhì)譜中母離子峰的質(zhì)荷比（m/z）為271，其子離子峰m/z為151和177（圖6-D、E），通過(guò)文獻(xiàn)檢索和標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)，確定酶促反應(yīng)產(chǎn)物二級(jí)質(zhì)譜中具有相應(yīng)的特征離子峰（圖6-F、G）。說(shuō)明AgCHS1編碼的蛋白具有查爾酮合成酶活性，在體外能夠催化對(duì)-香豆酰輔酶A生成柚皮素。

2.4 AgCHS1在煙草中的過(guò)量表達(dá)

構(gòu)建由組成型啟動(dòng)子CaMV35S調(diào)控表達(dá)的植物表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其轉(zhuǎn)到早花煙草中，獲得5株獨(dú)立的卡那霉素抗性植株。經(jīng)PCR檢測(cè)5株全部呈陽(yáng)性（圖7-A），其中2株（OE3和OE4）的花瓣顏色比野生型對(duì)照明顯加深（圖7-B），且該表型在后代能穩(wěn)定傳遞。花青素含量測(cè)定結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)株系OE3、OE4花瓣中的花青素含量分別比野生型對(duì)照提高56.6%和25.3%（圖7-C，<0.05）。進(jìn)一步通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在株系OE3和OE4花瓣中的轉(zhuǎn)錄水平要遠(yuǎn)高于野生型株系（圖7-D），且其表達(dá)量與花青素含量相一致，說(shuō)明的過(guò)量表達(dá)促進(jìn)了煙草花瓣的花青素生物合成。另外，CHS同時(shí)也是植物黃酮醇合成途徑上游編碼酶基因，其上調(diào)表達(dá)可能影響黃酮醇的累積，因此對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草花瓣的黃酮含量進(jìn)行測(cè)定（圖7-E）。結(jié)果顯示，在上述兩個(gè)過(guò)表達(dá)株系中，雖然OE3的花瓣顏色比對(duì)照加深更明顯，但其黃酮醇含量與野生型對(duì)照沒(méi)有顯著差異，而株系OE4卻比對(duì)照提高了39.1%（<0.05）。

AgCHS1：藤茶Ampelopsis grossedentata；VvCHS：葡萄Vitis vinifera NP_001267879.1；GhCHS1：陸地棉Gossypium hirsutum CV72638；OsCHS：水稻Oryza sativa CAA61955.1；AtCHS：擬南芥Arabidopsis thaliana AAA32771.1；NtCHS：煙草Nicotiana tabacum ANA78328.1?！篊ys-His-Asn三聯(lián)活性中心；★：表示苯丙氨酸殘基Phe215和Phe265；方框?yàn)镃HS高度保守特征序列，下劃線為丙二酰CoA結(jié)合位點(diǎn)▲: Cys-His-Asn triple active center; ★: phenylalanine residues Phe215 and Phe265; the highly conserved CHS signature sequence are boxed with black line; the malonyl-CoA binding site are underlined

圖3 AgCHS1與其他植物CHS蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

不同字母表示在P<0.05水平差異顯著。下同Different letters indicate statistical difference (P<0.05). The same as below

M：蛋白Marker；1：離心后的裂解液上清；2：裂解液上清經(jīng)過(guò)Ni柱的流穿；3：Binding buffer洗脫；4：Binding buffer + 60 mmol?L-1咪唑洗脫；5：Binding buffer + 90 mmol?L-1咪唑洗脫；5：Binding buffer + 250 mmol?L-1咪唑洗脫

3 討論

CHS是高等植物中分布最廣泛的類型III PKS，具有相對(duì)保守的基因結(jié)構(gòu)和較高的序列相似性[31-32]。本研究根據(jù)藤茶葉片轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)引物，克隆獲得，與多數(shù)物種的大小基本一致[8-14]。目前報(bào)道的多數(shù)植物序列只含有1個(gè)內(nèi)含子，但也有少數(shù)例外，比如金魚(yú)草含有2個(gè)內(nèi)含子[17]，紫丁香沒(méi)有內(nèi)含子[29]，而在小立碗蘚（Physcomitrella patens）基因家族的14個(gè)成員中，存在外顯子-內(nèi)含子的多種組合類型[33]。本研究克隆的藤茶基只含有1個(gè)內(nèi)含子，這與多數(shù)報(bào)道[8,13-14,32]的植物結(jié)構(gòu)相類似。序列多重比對(duì)發(fā)現(xiàn)，AgCHS1包含查爾酮合成酶家族的特征序列以及高度保守的活性氨基酸殘基，與葡萄、水稻、擬南芥、煙草等常見(jiàn)植物的CHS氨基酸序列有較高的相似性（82.2%—96.7%），證實(shí)屬于結(jié)構(gòu)保守型CHS基因。另外，AgCHS1與付明等[23]報(bào)道的藤茶CHS上存在一定的序列差異，但它們的特征性保守位點(diǎn)基本相同（結(jié)果未列），據(jù)此判斷它們屬于藤茶CHS家族的不同成員，可能在藤茶類黃酮生物合成過(guò)程中發(fā)揮相似的作用。以上這些結(jié)果說(shuō)明在序列上與其他植物的有諸多相似之處，屬于典型的查爾酮合成酶家族基因。

CHS的體外酶活性于1972年首次在歐芹懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物中被檢測(cè)到[34]。本研究通過(guò)原核表達(dá)重組蛋白的方法，對(duì)AgCHS1重組蛋白的體外酶活特性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)該重組蛋白可以催化對(duì)-香豆酰輔酶A與丙二酰輔酶A的縮合反應(yīng)，形成柚皮素，說(shuō)明AgCHS1具有查爾酮合成酶的活性。值得注意的是，酶促產(chǎn)物除了主產(chǎn)物柚皮素之外，還存在少量的副產(chǎn)物（圖6-A），類似的情況也出現(xiàn)在小立碗蘚[35]、地錢[36]等植物CHS的體外酶促反應(yīng)中，推測(cè)該副產(chǎn)物可能是CHS酶促反應(yīng)早期的脫軌產(chǎn)物Bisnoryangonin（BNY）或4-Coumaroyltriaceticacid lactone（CTAL）[37]，有待于進(jìn)一步鑒定。另?yè)?jù)報(bào)道，CHS起始底物較為寬泛，但對(duì)脂肪族?；o酶A和芳香族酰基輔酶A具有明顯偏好性[14,38]。例如，對(duì)小立碗蘚PpCHS的體外活性分析表明，該酶的底物除了對(duì)-香豆酰輔酶A外，還可以是肉桂酰輔酶A或二氫香豆酰輔酶A，但在這些底物中，PpCHS更偏好對(duì)-香豆酰輔酶A[35]。同樣，黃芩CHS的底物特異性分析也表明，CHS可以同時(shí)接受苯甲酰輔酶A、苯乙酰輔酶A、異戊基輔酶A和異丁酰輔酶A等芳香族和脂肪族?；o酶A，生成多種反應(yīng)產(chǎn)物[38]。鑒于上述這些發(fā)現(xiàn)，需要進(jìn)一步研究對(duì)不同底物的催化效率，以明確其體內(nèi)的生理作用底物。

A：轉(zhuǎn)基因煙草的PCR鑒定；B：花瓣表型；C：花瓣表達(dá)量；D：花瓣相對(duì)花青素含量；E：花瓣的相對(duì)黃酮醇含量

M：DL1000 DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量；P：質(zhì)粒對(duì)照，WT：野生型；OE1—OE5：轉(zhuǎn)基因株系。不同字母表示在<0.05水平差異顯著

A: PCR identification of transgenic tobacco; B: Petal phenotypes; C:expression in petal; D: Relative anthocyanin content; E: Relative flavonol content; M: DNA marker DL1000; P: Plasmid control; WT: Wild type; OE1-5: different transgenic lines. Different letters indicate statistical difference (<0.05)

圖7 過(guò)量表達(dá)對(duì)煙草花色、花青素和黃酮醇含量的影響

Fig. 7 Efects of overexpressionon the color, anthocyanin and flavonol content of tobacco

黃酮類物質(zhì)與植物花色關(guān)系密切[39]，作為類黃酮合成途徑的上游編碼酶基因，其基因表達(dá)量的增加或減少都可能導(dǎo)致植物花色的變化。在矮牽牛中過(guò)量表達(dá)小蒼蘭，可顯著增加黃酮醇和花青苷的含量，并使花瓣由原來(lái)的白色變?yōu)榉奂t色[14]。在煙草中過(guò)量表達(dá)紫丁香，可使花瓣顏色明顯加深，花青素含量提高50%以上[29]。相反地，抑制煙草[19]、大麗花[40-41]和三環(huán)草[42]等植物中的表達(dá)，可導(dǎo)致花青素含量降低，花色隨之變淡或出現(xiàn)完全白色的花。本研究將轉(zhuǎn)入野生型煙草中過(guò)表達(dá)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植株花瓣顏色由淡紫色變成紫紅色，花青素含量也相應(yīng)的增加，此結(jié)果與前人報(bào)道的結(jié)果基本一致。值得注意的是，在本研究獲得的2個(gè)煙草過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系中，株系OE3花青素含量的增加幅度大于株系OE4，但其黃酮醇含量卻沒(méi)有增加，而株系OE4卻提高了39.1%，這可能與黃酮醇和花青素合成調(diào)控方式較為復(fù)雜有關(guān)。黃酮醇和花青素處于類黃酮合成途徑不同的代謝分支，它們的合成除了受上游CHS、F3H等酶的影響，還與下游DFR和FLS兩種酶對(duì)分支點(diǎn)中間產(chǎn)物二氫黃酮醇的競(jìng)爭(zhēng)有關(guān)[43]。

4 結(jié)論

從藤茶克隆到查爾酮合成酶基因，該基因編碼蛋白具有典型的CHS家族蛋白保守結(jié)構(gòu)域，在體外能夠催化對(duì)-香豆酰輔酶A生成柚皮素，過(guò)量表達(dá)該基因可以提高煙草的花青素和黃酮醇的含量，說(shuō)明可能在藤茶類黃酮的生物合成中發(fā)揮重要作用。

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Cloning and Function Characterization of Chalcone Synthase Gene

XU Ming, LIN ShiQiang, NI DongXin, YI HenJie, LIU JiangHong, YANG ZhiJian, ZHENG JinGui

(College of Agriculture, Fujian Agriculture and Forestry University/Key Laboratory of Crop Biotechnology in Fujian Province University/Key Laboratory of Ministry of Education for Genetics, Breeding and Multiple Utilization of Crops, Fuzhou 350002)

【】Chalcone synthase(CHS) is the first key enzyme in the biosynthesis of plant flavonoids. In this study, thewascloned from, the gene sequence and tissue specific expression were analyzed, and the gene function was characterized viaenzymatic activity assay and transformation of, aiming to provide a theoretical basis for further elucidating the flavonoid accumulation of the. 【】The primers were designed according to the transcriptome ofand the leaf cDNA and genomic DNA were used as templates to amplify thewith PCR. The sequence features were analyzed with bioinformatic methods. The MEGA6 and DNAMAN were used for multiple sequences alignment and phylogenetic tree construction. The AgCHS1 recombinant protein was obtained via prokaryotic expression, and the enzymatic activities of the protein on substrates were assayed by identifying the catalytic products with HPLC-MS. The expression ofAgCHS1 in different organs was quantified by qRT-PCR, and the content of total flavonoids was determined by Al(NO)colorimetric method. The overexpression vector was constructed and transformed to N. tabacumby using the leaf disk method. The transgenic plants were screened and the contents of anthocyanin and flavonol in the petal of T2strain were measured.【】The ORF ofhad a length of 1 182 bp and encoded 393 amino acids. The genomic DNA spanned 1 315 bp, containing 2 exons and 1 intron. The bioinformatic analysis showed that AgCHS1 was a stable hydrophilic protein. The results of sequence alignments indicated that the AgCHS1 possessed the signature sequence and enzymatic site residues of the chalcone synthase gene superfamily, including the binding site of malonyl-CoA and triple active center, which share a high similarity with the CHS proteins of other species. The phylogenetic analysis showed that AgCHS1 had a close relationship with and was in the same clade with the CHSs ofand. The results of fluorescent qPCR showed thatexpressed highest in the mature leaf and the flower, and lowest in the old leaf. There was a positive correlation between the expression level ofgene and the content of total flavonoids in different organs of. Theenzymatic analysis showed that the recombinant AgCHS1 was able to catalyze the substrates-coumaroyl-CoA and CoA malonyl-CoA to produce naringenin, demonstrating the activity of chalcone synthase. 5 transgeniclines were obtained, 2 of which showed a significant deeper leaf color. The anthocyanin contented of the transgenic lines OE3 and OE4 increased by 56.6% and 25.3%, respectively, compared to the control. The flavonol content of line OE3 showed no significant difference, which of the line OE4 were increased by 39.1%.【】The AgCHS1 was the key enzyme in the flavonoid biosynthesis of, and the overexpression ofincreased the contents of anthocyanin and flavonol in transgenic plants.

; chalcone synthetase; enzyme activity; anthocyanin; flavonol

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.24.012

2020-05-14；

2020-07-15

國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2013BAD01B05）、福建農(nóng)林大學(xué)科技創(chuàng)新專項(xiàng)基金（KFA17424A）

許明，Tel：0591-83789231；E-mail：xmfau@163.com。通信作者鄭金貴，Tel：0591-83789231；E-mail：jgzheng@fafu.edu.cn

（責(zé)任編輯 趙伶俐）