高春林 許永峰 劉立軍 黃洪斌 王金海 袁博 盧立軍

骨質(zhì)疏松是老年人常見(jiàn)的疾病,會(huì)導(dǎo)致腰背痛、活動(dòng)能力下降等影響日常生活的癥狀,嚴(yán)重的會(huì)出現(xiàn)骨質(zhì)疏松骨折如髖部骨折、脊椎骨折、腕部骨折等并發(fā)癥,嚴(yán)重影響老年患者的生活質(zhì)量［1］。骨質(zhì)疏松的發(fā)生與骨吸收/骨形成之間平衡失調(diào)有關(guān),在骨吸收/骨形成的平衡調(diào)節(jié)中,外泌體中的miRNA 起著重要的作用［2］。外泌體是一類(lèi)能與細(xì)胞膜結(jié)合的納米囊泡(直徑30～100 nm),研究表明,外泌體內(nèi)的多種成分如蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA 等信號(hào)分子在細(xì)胞間信息傳遞中起重要作用［3］。miRNA 通過(guò)與轉(zhuǎn)錄本的相互作用,關(guān)閉或者抑制基因的表達(dá),在調(diào)節(jié)骨穩(wěn)態(tài)中具有重要作用。目前骨質(zhì)疏松的診斷主要依據(jù)影像學(xué)診斷,如X 線片和骨密度檢查等,目前尚無(wú)敏感度高的生物學(xué)指標(biāo)。本研究對(duì)比分析骨密度正常的老年人和嚴(yán)重骨質(zhì)疏松骨折的老年患者血清外泌體中miRNA,獲得差異化表達(dá)的miRNA,為進(jìn)一步研究骨質(zhì)疏松骨折風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)價(jià)指標(biāo)和治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018 年6～12 月于本院骨科門(mén)診及病房診治的年齡>65 歲明確診斷為嚴(yán)重骨質(zhì)疏松骨折的老年患者8 例作為A 組,選取同期年齡>65 歲的正常老年人8 例作為B 組。16 例研究對(duì)象的平均年齡為(68±6.83)歲。A 組的平均年齡為(67±7.3)歲,B 組的平均年齡為(69±5.1)歲。兩組的年齡比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。其中,A 組除特征性的髖部、腕部、肱骨近端、胸腰椎骨折外,骨密度的診斷標(biāo)準(zhǔn)為WHO 推薦的診斷標(biāo)準(zhǔn)：雙能X 線吸收測(cè)定的骨密度T 值<-2.5 SD,B 組的骨密度T 值：-2.5 SD

1.2 方法

1.2.1 外泌體提取 藍(lán)帽采血管采集受試者的空腹靜脈血10 ml,靜置后,2000 r/min,離心15 min,留取血清后裝入EP 管,置入-80℃的冰箱中冷凍備用。每組隨機(jī)選取3 例受試者的血清,3000 r/min,離心15 min 后,取上清,加入63 μl ExoQuicktm precipitation 外泌體提取試劑(4∶1),混合均勻后,4℃條件下放置30 min,將孵育好的樣品室溫下1500 r/min,離心30 min,棄上清,沉淀以100 μl PBS 重懸,即可獲得血清外泌體懸液,分裝,備用樣品于置入-80℃保存［4］。

1.2.2 miRNA 的提取和識(shí)別 使用TRIzol 試劑提取外泌體中的miRNA,用ND-1000nanodrop 進(jìn)行樣品的質(zhì)檢,通過(guò)質(zhì)檢的樣品進(jìn)行小RNA 文庫(kù)構(gòu)建和序列分析(Yingbio 公司)［5］。將結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析后檢測(cè)其外泌體中的miRNA 表達(dá)情況,兩組間進(jìn)行對(duì)比,得到差異較大且表達(dá)量較高的miRNA。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,采用t 檢驗(yàn)。用log2Ratio 方法定量分析兩組間差異表達(dá)的miRNA。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

兩組有表達(dá)的miRNA 共728 個(gè),其中有顯著差異的miRNA 共29 個(gè)。篩選出兩組表達(dá)差異倍數(shù)較大、表達(dá)量較高的miRNA 共17 個(gè),其中上調(diào)的miRNA 共12 個(gè),下調(diào)的miRNA 共5 個(gè)。見(jiàn)表1。

3 討論

隨著核酸測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,目前出現(xiàn)了大量關(guān)于非編碼小RNA 的研究,尤其是關(guān)于miRNA 的研究。miRNA 被認(rèn)為是許多嚴(yán)重疾病如惡性腫瘤、慢性代謝性疾病等基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中重要調(diào)節(jié)因子。許多研究表明,miRNA 或許可作為許多疾病如惡性腫瘤的診斷標(biāo)志物［3］。外泌體是細(xì)胞間信息傳遞的重要形式,它可以在細(xì)胞間傳遞蛋白、DNA 和各種非編碼小RNA,如miRNA、tRNA 來(lái)源的小片段RNA(transfer RNAderived fragments,tRF)等,這類(lèi)非編碼小RNA 作為細(xì)胞代謝調(diào)控的重要分子被廣泛研究［5］。

骨質(zhì)疏松是老年人的常見(jiàn)病,輕則可以導(dǎo)致腰背部慢性疼痛,重則可以誘發(fā)骨質(zhì)疏松骨折如脊椎壓縮骨折、髖部骨折等,嚴(yán)重影響老年人的生活質(zhì)量［1］。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSC)、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞都可以分泌外泌體［2］,同時(shí)這些細(xì)胞膜上也都有外泌體的受體,外泌體中包含的miRNA 對(duì)成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞活性的調(diào)節(jié)起重要作用。唐煜等［6］發(fā)現(xiàn)血清外泌體包含的miR-214-3p 和切除卵巢小鼠的骨形成減少有關(guān)。來(lái)源于礦化階段的MC3T3-E1 細(xì)胞外泌體中多種miRNAs 水平升高,如miR-30d-5p、miR-133b-3p 和miR-140-3,他們可能通過(guò)多種途徑(如Wnt、insulin、TFG-B、鈣離子信號(hào)通路)影響成骨細(xì)胞的分化和功能。miR-199b、miR-221 和miR-885-5p 可通過(guò)RUNX2 來(lái)調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的分化。骨細(xì)胞外泌體來(lái)源的miR-218 可以通過(guò)激活Wnt 信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)成骨分化［7-9］。

關(guān)于循環(huán)miRNA 與骨質(zhì)疏松的研究近年來(lái)逐漸增多。黃大耿等［10］對(duì)比分析了骨質(zhì)疏松骨折組和非骨質(zhì)疏松組,發(fā)現(xiàn)其中83 種miRNA 有差異,9 種miRNA(miR-21、miR-23a、miR-24、miR-93、miR-100、miR-122a、miR-124a、miR-125b、miR-148a)在 骨 質(zhì)疏松骨折患者的血清表達(dá)明顯增高,有可能作為嚴(yán)重骨質(zhì)疏松的診斷標(biāo)志物。陳逸青等［2］對(duì)比分析骨質(zhì)疏松患者和非骨質(zhì)疏松患者的血清,發(fā)現(xiàn)3 種miRNA(miR-122-5p、miR-125b-5p、miR-21-5p 表達(dá)顯著上升,miR-21-5p 的表達(dá)和骨吸收標(biāo)志物CTx 相一致,提示miR-21-5p 可作為骨折生物標(biāo)志物。miRNA 作為疾病的診斷物具有如下特點(diǎn)：①miRNA 具有高度的保守性,在同一物種內(nèi)表達(dá)較為穩(wěn)定,發(fā)揮其生物學(xué)功能,當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)異常變化時(shí),相對(duì)保守的miRNA 的表達(dá)亦出現(xiàn)顯著變化。②外周血中循環(huán)miRNAs 可因疾病的變化而變化,這樣miRNA 在一定程度上能反應(yīng)疾病的輕重程度。③miRNA 發(fā)揮作用的機(jī)制為網(wǎng)狀調(diào)節(jié),即一個(gè)miRNA 可同時(shí)影響多個(gè)靶基因,而一個(gè)靶基因也可能被多個(gè)miRNA 影響,這種網(wǎng)絡(luò)化的作用使得由多個(gè)miRNA 構(gòu)成的miRNA 組合與疾病關(guān)聯(lián)的可能性增大。④miRNA 具有組織或(和)細(xì)胞特異性,有的miRNA僅在某種特定的細(xì)胞或組織中表達(dá),有的miRNA 可出現(xiàn)在外周血當(dāng)中。此外,外泌體來(lái)源的miRNA 還具有以下特點(diǎn):①外泌體內(nèi)miRNA 受到血漿中成分的影響較少,成分與性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定,這樣分析結(jié)果更精確。②血漿外泌體是細(xì)胞間、組織間通訊重要的介質(zhì),能隨著血流影響到全身各個(gè)器官組織,廣泛地參與機(jī)體各個(gè)病理生理過(guò)程,其調(diào)控范圍更廣,其內(nèi)的miRNA的變化對(duì)各器官組織的影響更大,更具有診斷價(jià)值。③外泌體除了miRNA 外還包含有其他類(lèi)型的信息,如蛋白質(zhì)、脂類(lèi)等,若能聯(lián)合分析miRNA 與外泌體內(nèi)的蛋白質(zhì)組,方便從更多維度的鑒別疾病。④目前已證實(shí),外泌體內(nèi)miRNA 是具有時(shí)間特異性的,是個(gè)體、器官、組織特定階段的特定性標(biāo)志。即特定的外泌體和外泌體內(nèi)miRNA 代表著細(xì)胞、組織特定的狀態(tài),研究外泌體來(lái)源的miRNA 將有助于縮小疾病標(biāo)記物篩查的范圍,并且有助于了解特定細(xì)胞的特定狀態(tài),有助于對(duì)疾病可能機(jī)制的探索。

在作者的研究中,通過(guò)提取正常老年人和骨質(zhì)疏松骨折的老年人體內(nèi)血清中的外泌體并分離出miRNA,利用qt-PCR 的方法擴(kuò)增分離得到miRNA,再通過(guò)測(cè)序和對(duì)比文庫(kù)的方法確定差異化表達(dá)的miRNA 其各自的表達(dá)水平,將兩組間進(jìn)行對(duì)比分析,得到了的這些有差異的miRNA,再結(jié)合既往的文獻(xiàn)進(jìn)行分析,篩選出的骨質(zhì)疏松骨折特征性的miRNA,這些特征性的miRNA有望能作為嚴(yán)重骨質(zhì)疏松特征性標(biāo)志物。通過(guò)對(duì)比分析,作者發(fā)現(xiàn)了17 種miRNA 的表達(dá)有明顯差異,其中在嚴(yán)重骨質(zhì)疏松患者中,12 種的表達(dá)明顯升高,5 種表達(dá)明顯降低,其研究結(jié)果與其他文獻(xiàn)的研究結(jié)果基本一致［8-10］。在差異化最顯著的幾個(gè)miRNA 中,miR-7843-5p 已在前人報(bào)道中發(fā)現(xiàn)了其與骨質(zhì)疏松有關(guān),在去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠模型的骨組織中,miR-7843-5p表達(dá)高于對(duì)照組,miR-7843-5p 通過(guò)作用于RUNX2 基因,負(fù)向調(diào)控成骨細(xì)胞分化［10］。MiR-3605-5p 參與基質(zhì)蛋白酶2(Matrix metalloproteinase-2,MMP-2)的調(diào)控,此蛋白酶與Ⅰ型膠原降解密切相關(guān)。MiR-3605-5p 表達(dá)的降低,可能與巨噬細(xì)胞/破骨細(xì)胞功能激活有關(guān),從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松［9］。miR-6747-3p 參與骨相關(guān)細(xì)胞的分化及功能調(diào)控,miR-6747-3p 可通過(guò)抑制Smadl,從而干擾Smadl/SMad4 介導(dǎo)的基因激活通路,從而抑制軟骨細(xì)胞分化［4］。

本研究對(duì)比分析了骨質(zhì)疏松骨折的患者人群與正常老年人群之間差異化表達(dá)的miRNA,所獲得的miRNA 對(duì)骨質(zhì)疏松骨折具有較好的預(yù)警作用。下一步的研究將從中挑選2～3 個(gè)miRNA 作為重度骨質(zhì)疏松的生物學(xué)診斷指標(biāo)或骨折的預(yù)警指標(biāo)。此外,本研究結(jié)果不可避免的具有一定的局限性：①由于選取的患者均是來(lái)本院治療的患者,樣本的選擇具有一定的偏性。②此研究中作者得到了17 種差異表達(dá)的miRNA 能否作為診斷骨質(zhì)疏松骨折或者作為判斷骨折風(fēng)險(xiǎn)的指標(biāo),需要進(jìn)一步的理論分析、機(jī)制研究和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,這也是下一步的研究方向。