衛(wèi)瑩，魏紅燕，張蕊萌，沈明花

(延邊大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，吉林 延吉，133000)

急性肺損傷(acute lung injury, ALI)屬于一種病理性損傷，是急性呼吸衰竭最常見的病因，表現(xiàn)為炎癥因子釋放、炎癥細(xì)胞遷移以及肺間質(zhì)水腫[1-2]。然而，目前ALI的有效治療藥物很少。因此，我們不得不重視研究其可能的分子機(jī)制以及更有效的治療方法。病理狀態(tài)下，內(nèi)毒素可誘導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng)的發(fā)生，其中脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)作為其有效成分起主要作用。在ALI的一些動物模型中，LPS常被用來誘發(fā)肺部炎癥，通過結(jié)合膜表面Toll樣受體4(toll-like receptor 4，TLR4)在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用[3]。因此，本研究選用LPS誘導(dǎo)大鼠ALI模型。LPS可通過細(xì)胞膜表面TLR4受體，激活PI3K/Akt及NF-κB信號通路，最終促進(jìn)炎癥相關(guān)因子(如TNF-α、IL-1β以及IL-6等)的釋放，參與ALI過程[4-5]。

榛蘑，學(xué)名蜜環(huán)菌(Armillariamellea)，屬擔(dān)子菌亞門、白蘑科、蜜環(huán)菌屬，主要分布于我國東北地區(qū)，其具有食用性以及多種藥理活性，包括抗凋亡[6]，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞[7]、抗血栓[8]、抗炎[9]、抗氧化[10]等功能。本研究以LPS作為誘導(dǎo)劑，建立大鼠ALI模型，探討榛蘑粗多糖對于LPS造成的ALI的抑制作用及其機(jī)制，為闡明其抗炎機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥材與試劑

榛蘑于長白山采集，而榛蘑粗多糖為提取物；烏拉坦(麻醉劑)，購于Gibco公司；p-PI3K抗體、p-Akt抗體、p-NF-κB p65抗體和Lamin B抗體，購自美國Abcam公司；I-κB抗體，購自美國CST公司；LPS、β-actin 抗體、二抗(羊抗鼠IgG-HRP)、二抗(羊抗兔 IgG-HRP)，購自美國Sigma公司；內(nèi)皮素-1(endothelin-1, ET-1)、血栓調(diào)節(jié)蛋白(thrombomodulin, TM)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)以及腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)試劑盒，購自上海研謹(jǐn)生物科技有限公司；核蛋白提取試劑盒與全蛋白提取試劑盒，購于Solarbio公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

SD大鼠(清潔級)35只，體重范圍為(200±20)g，其合格證書編號為SCXK(吉)2011-0007，本校實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.3 儀器與設(shè)備

RT-2100型酶標(biāo)儀，購自美國Bio-Tek公司；GelDoc XR凝膠成像儀，購自美國Bio-Rad公司；BX53F顯微鏡，購自日本OLYMPUS 株式會社。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 榛蘑粗多糖的制備

野生棒蘑被烘干后，使用熱水浴浸提，過濾殘?jiān)?，將殘?jiān)跓崴≈屑訜釢饪s，加入無水乙醇使其完全沉淀，反復(fù)洗滌，最終干燥后得到榛蘑粗多糖，產(chǎn)率為2.2%[11]。

1.4.2 動物分組及處理

本實(shí)驗(yàn)將大鼠隨機(jī)分組，共5組，分別為正常對照組、模型組(LPS 20 mg/kg)、陽性對照組(LPS+地塞米松5 mg/kg)、榛蘑粗多糖低、高劑量組(200、400 mg/kg)。榛蘑粗多糖組分別按200、400 mg/kg體質(zhì)量灌胃，其余3組均以等體積的生理鹽水灌胃。第10天，將鼠禁食24 h。次日，將陽性對照組的大鼠以5 mg/kg體質(zhì)量腹腔注射地塞米松，2 h后，除正常對照組，其他各組大鼠以20 mg/kg體質(zhì)量注射LPS誘導(dǎo)ALI，正常對照組以等體積的生理鹽水注射。LPS損傷6 h后，將大鼠用20%烏拉坦麻醉，仰臥位固定，采血并取出肺組織，用于血清學(xué)指標(biāo)檢測、Western bolt實(shí)驗(yàn)以及肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察。

1.4.3 肺組織形態(tài)學(xué)觀察

使用4%多聚甲醛固定大鼠肺組織，經(jīng)無水乙醇脫水、石蠟包埋和切片等操作步驟后，使用蘇木素-伊紅(HE)染色。于顯微鏡下觀察其結(jié)構(gòu)變化。

1.4.4 血清學(xué)指標(biāo)檢測

全血置于常溫30 min以上，以4 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，按ELISA試劑盒操作步驟進(jìn)行ET-1、TM、IL-6以及TNF-α水平的檢測。

1.4.5 Western bolt法

提取肺組織總蛋白，作為檢測p-PI3K、p-Akt以及I-κB指標(biāo)的樣品；提取肺組織核蛋白，用于檢測p-NF-κB p65 表達(dá)水平。

將上述2種蛋白分別進(jìn)行BCA蛋白定量。在5×上樣緩沖液中95 ℃煮沸10 min后，取50 μg蛋白質(zhì)樣品分別進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，隨后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。將轉(zhuǎn)膜后的PVDF以5%脫脂牛奶封閉液封閉 1 h，1 h后用TBST緩沖液(含有tris-buffered，saline和吐溫20三種物質(zhì))洗滌3次，每次至少5 min，之后以相應(yīng)的一抗在4 ℃孵育過夜。第2天再次用TBST洗滌，二抗于常溫孵育2 h，用凝膠成像儀進(jìn)行分析。

1.4.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±SD)表示，使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05表示差異具有顯著意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠肺組織形態(tài)學(xué)觀察

HE染色法觀察了榛蘑粗多糖對肺組織病理損傷的影響。如圖1所示，正常對照組大鼠肺組織未見微血栓形成，肺泡以及肺間質(zhì)的結(jié)構(gòu)較為完整。經(jīng)LPS損傷后模型組肺泡結(jié)構(gòu)被破壞，肺泡壁充血以及增厚，肺血管周圍可見大量炎癥細(xì)胞浸潤，并觀察到微血栓形成。榛蘑粗多糖高劑量組肺泡和肺間質(zhì)結(jié)構(gòu)趨于恢復(fù)正常，未見炎癥細(xì)胞的過度浸潤和血栓的形成。這就提示，榛蘑粗多糖可以減輕LPS引起的肺組織的病理損傷。

a-正常對照組；b-模型組；c-陰性對照組； d-榛蘑粗多糖高劑量組圖1 大鼠肺組織形態(tài)學(xué)觀察(×100)Fig.1 Morphological observation of lung tissue in rats

2.2 血清中TNF-α與IL-6水平的檢測

與正常對照組相比，模型組中TNF-α和IL-6的含量明顯增多(P<0.01)，說明LPS作用后可引起炎癥因子的釋放。與模型組相比，陽性對照組和榛蘑粗多糖高劑量組中TNF-α和IL-6的含量顯著減少(P<0.05)。這就提示，地塞米松和榛蘑粗多糖可抑制LPS所致的TNF-α和IL-6水平的升高。與陽性對照組相比，榛蘑粗多糖低劑量組中TNF-α和IL-6的含量有顯著差異(P<0.05)，見表1。

2.3 血清中TM與ET-1水平的檢測

如表2所示，與正常對照組相比，模型組中血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)和內(nèi)皮素-1(ET-1)明顯增多(P<0.01)，說明LPS作用后引起內(nèi)皮細(xì)胞的損傷；與模型組相比，陽性對照組和榛蘑粗多糖低、高劑量組中TM和ET-1的水平顯著下降(P<0.05)，這就說明地塞米松和榛蘑粗多糖可以減少LPS對內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。與陽性對照組相比，榛蘑粗多糖低劑量組中TM和ET-1的含量有顯著差異(P<0.05)

表2 血清中TM與ET-1水平的檢測Table 2 Detection of TM and ET-1 in serum

2.4 大鼠肺組織中I-κB蛋白表達(dá)以及p-PI3K與p-Akt蛋白水平的檢測

為了分析榛蘑粗多糖對LPS所致的ALI的作用機(jī)制，我們觀察了其對p-PI3K、p-Akt以及I-κB水平的影響。如圖2所示，與正常對照組相比，模型組中p-PI3K和p-Akt水平明顯升高，I-κB蛋白的表達(dá)顯著減少(P<0.01)，說明LPS作用后可引起PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白的激活；與模型組相比，榛蘑粗多糖低劑量組中p-Akt蛋白水平明顯降低，I-κB蛋白的表達(dá)明顯增多(P<0.01)，陽性對照組和榛蘑粗多糖高劑量組中p-PI3K和p-Akt水平顯著降低，I-κB蛋白的表達(dá)明顯增多(P<0.01)。這就說明，地塞米松和榛蘑粗多糖抑制了LPS所致的PI3K/Akt信號通路的激活。與陽性對照組相比，榛蘑粗多糖低劑量組中p-PI3K、p-Akt以及I-κB的水平有顯著差異(P<0.05)。

A-正常對照組;B-模型組;C-陽性對照組;D-榛蘑粗多糖低劑量組; E-榛蘑粗多糖高劑量組(下同)圖2 I-κB蛋白表達(dá)以及PI3K和Akt蛋白磷酸化水平Fig.2 The expression of I-κB protein and the phosphorylation level of PI3K and Akt

2.5 大鼠肺組織細(xì)胞核中p-NF-κB p65水平的檢測

如圖3所示：與正常對照組相比，模型組中胞核p-NF-κB p65水平明顯升高(P<0.01)，說明LPS作用后可引起NF-κB p65活化；與模型組相比，陽性對照組和榛蘑粗多糖低、高劑量組中p-NF-κB p65水平明顯降低(P<0.01)。說明地塞米松和榛蘑粗多糖抑制了NF-κB p65的磷酸化水平。與陽性對照組相比，榛蘑粗多糖低劑量組中p-NF-κB p65的水平有顯著差異(P<0.01)。

圖3 胞核NF-κB p65的磷酸化水平Fig.3 The phosphorylation level of NF-κB P65 in nucleus

3 討論與結(jié)論

ALI是一種炎癥反應(yīng)造成的肺組織病理性損傷[12]，其特征為炎癥相關(guān)介質(zhì)的釋放(如TNF-α、IL-1以及IL-6等)、中性粒細(xì)胞過度遷移以及細(xì)胞毒性介質(zhì)的釋放[13]。LPS作為細(xì)菌外膜的重要組成部分，會對宿主造成損害，包括炎癥反應(yīng)和對組織器官的損傷[14-15]。因此，本實(shí)驗(yàn)以LPS作為誘導(dǎo)劑來建立ALI模型。已有研究證明，地塞米松具有明確的抗炎作用，可以改善呼吸氧合功能，減輕LPS引起的大鼠ALI[16]。所以，本實(shí)驗(yàn)選擇地塞米松作為陽性藥物。LPS結(jié)合細(xì)胞膜上的特異受體，如CD14和TLR4，引發(fā)免疫應(yīng)答。這些受體激活后可引起核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB p65活化，而NF-κB p65活化后可進(jìn)一步促進(jìn)炎癥因子(如TNF-α或IL-6)的合成和釋放。研究表明，PI3K/Akt通路可調(diào)節(jié)肺部炎癥中細(xì)胞存活以及氧化應(yīng)激，參與ALI過程[4]。

TNF-α與IL-6是炎癥過程中重要的細(xì)胞因子，參與ALI的炎癥反應(yīng)[17-18]。在LPS誘導(dǎo)的ALI過程中，這些細(xì)胞因子可誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞的浸潤，加速其病理改變并放大炎癥反應(yīng)[19]。ET-1和TM作為內(nèi)皮細(xì)胞損傷的指標(biāo)，在ALI時，其水平顯著增高[20-21]。因此，本實(shí)驗(yàn)中我們同時檢測了ET-1和TM的水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，榛蘑粗多糖抑制了LPS所致的TNF-α、IL-6、TM以及ET-1的合成與釋放，減輕了LPS引起的肺組織的病理損傷。

為了進(jìn)一步探討其作用機(jī)制，我們還檢測了PI3K/Akt信號通路和NF-κB p65。NF-κB p65是基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)因子，它的激活依賴于IKK復(fù)合物。在生理狀態(tài)下，I-κB與NF-κB p50/NF-κB p65結(jié)合，處于非活化狀態(tài)。在多種誘因的作用下IKK復(fù)合物可被激活，促使I-κB發(fā)生磷酸化而被降解，進(jìn)一步促進(jìn)NF-κB p65發(fā)生核轉(zhuǎn)移以及在核內(nèi)的磷酸化，最終促進(jìn)炎癥介質(zhì)的釋放[22-23]。PI3K和Akt是NF-κB上游分子。研究表明，LPS通過TLR4激活PI3K/Akt信號通路，直接誘導(dǎo)原代培養(yǎng)小鼠肺細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[24]。MENG等的研究結(jié)果表明，在大鼠ALI模型中，右美托咪定通過抑制PI3K/Akt信號通路對ALI起保護(hù)作用[4]，這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，榛蘑粗多糖對LPS誘導(dǎo)的大鼠ALI的抑制作用可能與PI3K/Akt信號通路相關(guān)。

綜上所述，榛蘑粗多糖通過對PI3K/Akt信號通路的調(diào)控作用對LPS誘導(dǎo)的ALI起保護(hù)作用。