劉旭幫，張朝華，魏娟玲，趙信科

慢性心力衰竭（CHF）是血流動(dòng)力學(xué)負(fù)荷過重、心肌病及心肌梗死等多種心血管疾病的終末階段，療效差，死亡率高，嚴(yán)重威脅人類健康[1]。有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球有2250萬CHF患者，且仍以每年200萬速度增長(zhǎng)；而我國(guó)作為人口大國(guó)，且老年人口占比大，CHF患者人數(shù)已接近400萬，死亡人數(shù)高達(dá)60萬[2]。近年，醫(yī)學(xué)技術(shù)發(fā)展迅速，CHF診斷方法也由最初的X線檢查（心胸比）到血清N末端腦鈉肽前體（NT-proBNP）及彩色多普勒心臟超聲儀檢測(cè)，其靈敏度和精確度均有所升高，但其治療方式仍以改善癥狀為主，對(duì)預(yù)后仍無明顯價(jià)值，故認(rèn)為尋找特異性和靈敏性更高的血液指標(biāo)以盡早明確診斷并精確評(píng)估CHF患者狀態(tài)，甚至逆轉(zhuǎn)心臟重構(gòu)是未來幾年甚至幾十年所有心血管學(xué)者們的主要研究方向[3-6]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（LncRNA）是一種長(zhǎng)度超過200nt但不編碼蛋白的RNA，起初多被認(rèn)為是基因組轉(zhuǎn)錄“垃圾”，是RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄副產(chǎn)物，不具備生物學(xué)功能；后來隨著研究的不斷深入，其功能逐漸清晰，與表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)密切相關(guān)，在人類疾病發(fā)生發(fā)展過程中占重要地位[7,8]。目前，關(guān)于LncRNA與腫瘤發(fā)生發(fā)展的研究較多且具有一定價(jià)值，但與心血管疾病較少，有待挖掘，為心血管患者診療提供更多可能[9,10]。本研究前期通過基因芯片發(fā)現(xiàn)CHF患者血清中長(zhǎng)鏈非編碼RNA-XIST（LncRNA-XIST）高表達(dá)，提示其可能參與CHF發(fā)生發(fā)展。本研究選取2016年6月～2018年6月于鄭州人民醫(yī)院診治的108例CHF患者和50例健康體檢者作為研究對(duì)象，探討血清長(zhǎng)鏈非編碼RNA-XIST（LncRNAXIST）在CHF中的表達(dá)情況，分析其臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象選取2016年6月～2018年6月于鄭州人民醫(yī)院診治的108例CHF患者作為研究對(duì)象，命名為CHF組，其中男性62例，女性46例；年齡40～70歲，平均（60.14±5.38）歲；病程1～6年，平均（4.28±1.62）年；根據(jù)美國(guó)紐約心臟協(xié)會(huì)（NYHA）心功能分級(jí)：NYHA Ⅰ級(jí)32例、NYHA Ⅱ級(jí)34例、NYHA Ⅲ級(jí)22例和NYHA Ⅳ級(jí)20例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床表現(xiàn)及輔助檢查符合《中國(guó)心力衰竭診斷和治療指南2014》[11]中CHF診斷者；②NYHA Ⅰ～Ⅳ級(jí)；③依從性良好者；排除標(biāo)準(zhǔn)：①心肌梗死、急性感染、創(chuàng)傷等所致急性心力衰竭者；②合并惡性腫瘤者；③合并嚴(yán)重肝腎功能損傷及代謝性疾病者。選取同期50例健康體檢者作為對(duì)照，命名為對(duì)照組，其中男性28例，女性22例，年齡42～68歲，平均年齡（59.54±5.17）歲。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書，并通過倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。兩組在性別及年齡等一般資料上，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.028，P=0.868；t=0.660，P=0.510），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集抽取兩組患者入組第1 d空腹靜脈血5 ml于黃色血清管中，充分混勻，靜置10 min，4000 r/min離心5 min，留取上清液，-80℃冰箱保存，待檢測(cè)。

1.2.2 血清LncRNA-XIST檢測(cè)本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（FQ-PCR）進(jìn)行檢測(cè)，具體步驟如下：嚴(yán)格參照試劑盒說明書完成總RNA的提取和cDNA合成，后進(jìn)行FQ-PCR檢測(cè)：以適量cDNA作模板，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作內(nèi)參，配置PCR反應(yīng)體系，在美國(guó)ABI公司實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)儀上進(jìn)行檢測(cè)及分析，LncRNAXIST相對(duì)表達(dá)水平以2-△△Ct表示，其中△△Ct=△CtCHF組-平均△Ct對(duì)照組，△Ct=目的基因（LncRNAXIST）Ct值-內(nèi)參基因（GAPDH）Ct值。XIST引物序列：F：GCATGGGTGACCACCAGAAA（5’-3’）；R：AGCAACCAACTCCCCAGTTT（5’-3’）。

1.2.3 其它檢測(cè)本研究采用化學(xué)發(fā)光免疫法進(jìn)行檢測(cè)血清NT-proBNP，具體參照美國(guó)雅培公司i2000全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套試劑進(jìn)行檢測(cè)。采用荷蘭飛利浦公司IE33彩色多普勒超聲儀檢測(cè)CHF患者心臟左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）和左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）。

1.3 隨訪CHF患者出院（標(biāo)準(zhǔn)：NYHA心功能分級(jí)為Ⅰ～Ⅱ級(jí)或LVEF＞35%）后隨訪1年，截止日期2019年6月，期間每3個(gè)月復(fù)診1次，須重新評(píng)估NYHA心功能和行心臟彩超檢查等，以判斷心臟事件發(fā)生情況。其中心臟事件是指心力衰竭進(jìn)展（NYHA心功能分級(jí)進(jìn)展為Ⅲ～Ⅳ級(jí)或LVEF＜35%）、心力衰竭急性加重再次住院及心源性死亡者等，心臟事件發(fā)生即為隨訪中斷。隨訪期間仍須參照《中國(guó)心力衰竭診斷和治療指南2014》規(guī)律用藥。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法本研究所有數(shù)據(jù)均用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，其中計(jì)量資料用（±s）表示，用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較；用受試者工作特征（ROC）曲線分析血清LncRNA-XIST對(duì)CHF的診斷價(jià)值；用Pearson法分析LncRNA-XIST與NTproBNP、LVEF和LVEDD之間的關(guān)系；用logistic回歸法探討影響CHF預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清LncRNA-XIST水平比較CHF組和對(duì)照組血清LncRNA-XIST水平分別為5.52±1.25和1.24±0.18，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=24.056，P=0.000）。

2.2 血清LncRNA-XIST對(duì)CHF的診斷價(jià)值采用ROC曲線圖分析血清LncRNA-XIST診斷CHF的敏感性及特異性，其中ROC曲線下面積為0.925（0.814～1.000），其截?cái)嘀禐?.92，此時(shí)敏感性為80.0%，特異性為92.0%，圖1。

2.3 CHF患者血清LncRNA-XIST與NYHA心功能分級(jí)的關(guān)系在CHF患者中，NYHA心功能（Ⅲ+Ⅳ級(jí)）者血清LncRNA-XIST高于NYHA心功能（Ⅰ+Ⅱ級(jí)）者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.871，P=0.000），表1。

圖1 血清LncRNA-XIST診斷CHF的ROC曲線圖

表1 CHF患者血清LncRNA-XIST與NYHA心功能分級(jí)的關(guān)系（±s）

表1 CHF患者血清LncRNA-XIST與NYHA心功能分級(jí)的關(guān)系（±s）

NYHA心功能分級(jí) 例數(shù) LncRNA-XISTⅠ+Ⅱ級(jí) 66 3.78±1.16Ⅲ+Ⅳ級(jí) 42 6.05±1.84 t值 - 7.871 P值 - 0.000

2.4 CHF患者血清LncRNA-XIST與NT-proBNP、LVEF和LVEDD之間的關(guān)系經(jīng)Pearson法分析得知，CHF患者血清LncRNA-XIST與NT-proBNP和LVEDD呈明顯正相關(guān)（r=0.785，P=0.001；r=0.692，P=0.009），而血清LncRNA-XIST與LVEF呈明顯負(fù)相關(guān)（r=-0.576，P=0.016）。

2.5 CHF預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素分析經(jīng)logistic回歸分析得知，病程≥5年、心功能分級(jí)（Ⅲ+Ⅳ級(jí)）和血清LncRNA-XIST≥5.52是導(dǎo)致CHF心臟事件發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05），表2～3。

表2 賦值表

表3 影響CHF預(yù)后獨(dú)立危險(xiǎn)因素的logistic回歸分析

3 討論

近年，隨生活水平不斷提高，人們飲食及生活方式隨之改變，高血壓、冠心病及糖尿病等疾病罹患率明顯升高，而以上疾病進(jìn)展到最后均可發(fā)展成為心力衰竭，住院率及死亡率較高，嚴(yán)重者5年存活率不超過20%，已引起臨床工作者和患者的重視，尋找敏感并且特異有效指標(biāo)迫在眉睫[12,13]。血清NT-proBNP是目前臨床心力衰竭診斷最常見的血液學(xué)檢測(cè)指標(biāo)，易受腎功能影響而出現(xiàn)假性升高，此外，其還可受人口學(xué)特征、藥物、非心力衰竭疾病及心力衰竭并發(fā)癥等影響，敏感性及特異性有待考量[14]。LncRNA是近年研究的熱點(diǎn)之一，在腫瘤中研究較多，且逐步向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化；而其在心血管疾病中的研究則起步較晚，但目前也發(fā)現(xiàn)部分LncRNA與心臟發(fā)育、高血壓、冠心病及心臟衰竭等密切相關(guān)[15,16]。2006年Ishii等[17]研究發(fā)現(xiàn)LncRNA-MIAT可作為心肌梗死的敏感點(diǎn)，在ST段抬高中明顯高于非ST段抬高者。后隨研究深入，Liao等[18]發(fā)現(xiàn)LncRNAMIAT可通過miR-150-5p介導(dǎo)VEGF信號(hào)通路參與心肌梗死的發(fā)生。X-非活性特異轉(zhuǎn)錄物（XIST）是胎盤哺乳動(dòng)物X染色體上的一個(gè)RNA基因，在X失活過程中占主導(dǎo)地位，位于人X染色體q13.2上；目前研究顯示LncRNA-XIST與人類肺癌、肝癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌及宮頸癌等惡性腫瘤相關(guān)，但關(guān)于其在CHF患者血清中的表達(dá)情況及意義目前報(bào)道較少，具有一定創(chuàng)新價(jià)值[19,20]。

本研究采用FQ-PCR檢測(cè)108例CHF患者和50例健康體檢者中血清LncRNA-XIST表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，CHF患者LncRNA-XIST水平高于健康體檢者，提示血清LncRNA-XIST水平與CHF相關(guān)，有可能成為CHF診斷指標(biāo)。與前述研究不同，本研究更重視臨床價(jià)值探討。為此本研究通過繪制ROC曲線進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)血清LncRNA-XIST診斷CHF的ROC曲線下面積為0.925（0.814～1.000），其截?cái)嘀禐?.92，此時(shí)敏感性為80.0%，特異性為92.0%，明確了血清LncRNA-XIST在CHF中的診斷價(jià)值，更加完善了CHF患者診療體系，為本文一重要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)。對(duì)于CHF患者，心功能分級(jí)十分重要，分級(jí)不同，診療及預(yù)后不盡相同。故本研究隨后又比較了不同NYHA分級(jí)患者血清LncRNA-XIS差異發(fā)現(xiàn)心功能Ⅲ～Ⅳ級(jí)患者者血清LncRNA-XIST高于心功能Ⅰ～Ⅱ級(jí)者，說明心功能分級(jí)越高，血清LncRNA-XIST水平越高，提示血清LncRNA-XIST水平對(duì)CHF患者心功能狀態(tài)評(píng)估亦具有一定價(jià)值，提升了其在CHF中的應(yīng)用價(jià)值，以供臨床使用。此后本研究還采用Pearson法探討了血清LncRNA-XIST與NT-proBNP、LVEF和LVEDD之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)血清LncRNA-XIST與NTproBNP和LVEDD呈明顯正相關(guān)，而與LVEF呈明顯負(fù)相關(guān)，說明血清LncRNA-XIST水平越高，其NT-proBNP和LVEDD越高，而LVEF則越低，可間接反映心力衰竭嚴(yán)重程度，但具體作用機(jī)制尚不清楚，有待后續(xù)繼續(xù)探討。最后，本研究還采用logistic回歸分析法探討影響CHF預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素發(fā)現(xiàn)，病程≥5年、心功能分級(jí)（Ⅲ+Ⅳ級(jí)）和血清LncRNA-XIST≥5.52是導(dǎo)致CHF心臟事件發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05），再次突出了LncRNA-XIST對(duì)CHF患者的臨床價(jià)值。

綜上認(rèn)為，血清LncRNA-XIST在CHF患者中高表達(dá)，NYHA心功能分級(jí)越高，其值越大，有望成為CHF診斷及預(yù)后評(píng)估的有效指標(biāo)之一。