王銳，蔣丁勝，魏翔

主動脈夾層是一種發(fā)病急、進展快、病情兇險、致死率高的心血管病急癥，若未經(jīng)治療，發(fā)病24 h內(nèi)的死亡率約為50%，30 d死亡率可達90%[1]。有資料顯示發(fā)病率約為30/100萬人·年，且近年來呈上升趨勢[2]。對于其發(fā)病機制，目前比較公認的是，主動脈壁中血管平滑肌細胞外基質(zhì)降解導致膠原及彈力纖維蛋白退行性病變，血流沖擊或直接創(chuàng)傷等導致內(nèi)皮細胞損傷，在血管內(nèi)膜上形成破口，高壓血流穿透血管壁中層使其分離形成夾層[3]。但平滑肌細胞外基質(zhì)降解的具體分子機制尚未完全闡明。YWHAZ是一種廣泛表達的酸性銜接蛋白，分子量約28-33kDa，屬于14-3-3蛋白家族，其主要分布于細胞質(zhì)，自然狀態(tài)下以同源二聚體或異源二聚體的形式存在[4]，通過特異性識別底物上的磷酸化基序RSXpSXP或RXXXpSXP而與該底物結(jié)合，發(fā)揮調(diào)控信號傳導、影響細胞周期、抑制細胞凋亡等多種生物學功能[5]。有研究顯示YWHAZ在腫瘤組織中高表達，有促進腫瘤細胞遷移的作用[6,7]，但其是否能調(diào)控主動脈平滑肌細胞的功能，以及是否參與主動脈夾層的發(fā)生發(fā)展目前尚未見報道。

1 資料與方法

1.1 研究對象及分組本研究納入華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院心臟大血管外科在2017年1月1日至2018年12月31日期間收治的13例經(jīng)CTA檢查確診患有Stanford A型主動脈夾層的患者為研究對象。同時納入11例在本院接受心臟移植且無任何主動脈及相關(guān)疾病的患者為對照組。合并馬凡氏綜合征、創(chuàng)傷性夾層、腫瘤、自身免疫系統(tǒng)疾病以及艾滋、梅毒等高傳染性疾病患者不納入本研究。本研究經(jīng)華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院倫理委員會批準，符合醫(yī)學倫理學規(guī)定，并取得了所有受試者的知情同意，嚴格按照實驗規(guī)范實施。

1.2 研究方法將主動脈壁組織經(jīng)福爾馬林溶液充分固定后脫水、包埋并切片，隨后組織切片分別按照標準流程進行HE和EVG染色，使用二甲苯對切片脫蠟透明化，然后依次放入100%、95%、85%、70%乙醇以及純水中各浸泡5 min充分水化，水化后的切片分別進行HE和EVG染色，再依次用80%、90%、100%乙醇進行脫水，二甲苯浸泡2次后用中性樹脂封片，在顯微鏡下觀察拍照。

按照標準流程進行免疫組化染色，即將石蠟切片放于烘箱中烤片60 min，使組織貼附更牢靠，二甲苯脫蠟3次，每次5 min，依次用100%、95%、70%乙醇以及ddH2O浸洗切片各5 min進行充分水合，利用檸檬酸鹽進行抗原修復，濾紙吸干切片周圍水分后滴加3%的H2O2放于濕盒中在37℃下孵育20 min，PBS洗滌3遍后加8%羊血清室溫封閉60 min，隨后加入YWHAZ特異性一抗（GeneTex，GTX101075，1:200稀釋）4℃下孵育過夜，次日用PBS洗滌切片3次，每次5 min，二抗孵育60 min， PBS洗滌4次后滴加DAB工作液進行顯色，顯微鏡下觀察控制顯色時間，用ddH2O浸洗3次，蘇木素復染1 s，自來水沖洗10 min返藍，再依次放入70%、95%、100%乙醇中浸片各5 min進行脫水，二甲苯透明，最后用中性樹脂進行封片后于顯微鏡下觀察拍照。

每個樣品剪取約30～40 mg凍存的主動脈壁組織，在液氮冷凍條件下將組織研磨碎后收集至EP管中，每10 mg組織加入100 μl裂解液，于冰浴中靜置裂解10 min，隨后使用超聲破碎儀進一步破碎，然后在4℃下12 000 rpm離心30 min，轉(zhuǎn)移上清至新的EP管中。使用BCA蛋白定量法測定蛋白濃度，加入適量5×SDS上樣緩沖液。95℃水浴15 min進行蛋白變性，冷卻后低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

將變性后的蛋白樣品通過SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜，隨后用5%脫脂牛奶封閉1 h，TBST清洗PVDF膜3遍后，進行YWHAZ一抗（1:1000稀釋）孵育，4℃下?lián)u床孵育過夜。次日用TBST洗膜3次，每次5 min，孵育二抗，TBST洗滌3次，最后加入用ECL顯影液充分浸濕PVDF膜后，于ChemiDocTMXRS+成像系統(tǒng)（Bio-Rad）中檢測蛋白信號。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組比較采用獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)及百分比表示，采用卡方檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 患者一般臨床資料本研究中夾層組共納入Stanford A型主動脈夾層患者13名，全部為男性患者，平均年齡為（50.1±7.53）歲，對照組納入心臟移植患者11例，其中男性9例，女性2例，平均年齡（50.2±11.5）歲，兩組間性別及年齡均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），同時兩組間的飲酒、吸煙、糖尿病、舒張壓、心率等均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），說明兩組納入患者基線均衡，具有可比性（表1）。因?qū)φ战M為接受心臟移植的患者，故術(shù)前未做CTA檢查。

表1 主動脈夾層患者與對照組臨床資料對比

2.2 患者影像學資料及病理組織切片染色納入的夾層組患者均經(jīng)CTA檢查確診為Stanford A型主動脈夾層，并進行了CT三維重建（圖1），破口位于升主動脈，累及腹主動脈。HE染色結(jié)果顯示。與對照組相比，夾層組主動脈壁組織中血管平滑肌細胞排列較為混亂且細胞數(shù)量減少，細胞核明顯縮?。▓D2）。EVG染色結(jié)果可見夾層組主動脈壁彈性纖維斷裂明顯，并彈性纖維含量有所減少（圖2）。

圖1 夾層組患者CTA及三維重建圖

圖2 正常對照組與夾層組患者的主動脈壁組織切片H&E及EVG染色

2.3 YWHAZ在主動脈壁組織中表達量及亞細胞定位為了進一步研究YWHAZ與主動脈夾層的關(guān)系，首先采用免疫組化檢測主動脈壁中YWHAZ的表達及其亞細胞定位情況，陽性面積定量分析顯示：對照組0.58±0.43，夾層組4.54±0.59，P=0.00158，與對照組比較，夾層組主動脈壁組織中YWHAZ蛋白表達量明顯增多，差異具有統(tǒng)計學意義，且大部分位于血管平滑肌細胞質(zhì)中（圖3）。進一步通過western blot檢測YWHAZ的蛋白質(zhì)表達水平，結(jié)果顯示：對照組中可見YWHAZ蛋白的表達，而在夾層組患者主動脈壁中YWHAZ蛋白表達水平有一定程度的升高（圖4A），趨勢與免疫組化一致，檢測蛋白條帶灰度值并進行定量，計算YWHAZ蛋白/總蛋白比值，取對照組平均值為1，可得出相對定量對照組為1.0±0.16，夾層組為1.24±0.31，P=0.0926, 差異無統(tǒng)計學意義（圖4B）。

3 討論

圖3 正常對照組與夾層組患者的主動脈壁組織免疫組化染色

圖4 正常對照組與夾層組患者的主動脈壁組織中YWHAZ蛋白含量

主動脈夾層是一種多因素參與、涉及多個生物學過程的主動脈疾病綜合征。目前的研究結(jié)果提示高血壓、動脈粥樣硬化、遺傳性疾病以及醫(yī)源性損傷等是主動脈夾層的重要危險因素[2]。主動脈夾層的病理學特征主要表現(xiàn)為主動脈中層退變，其中包括平滑肌細胞減少、細胞外基質(zhì)紊亂、彈力纖維斷裂等[8]，但影響主動脈中層退變的分子機制尚未完全明確。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)YWHAZ在主動脈夾層患者主動脈壁中表達量顯著升高，提示其可能參與主動脈中層退變。已有文獻報道Mir-451可抑制YWHAZ/p38 MAPK信號通路抑制血管損傷后平滑肌細胞的遷移以及內(nèi)膜新生[9]。除Mir-451外，YWHAZ還能被多種MirRNA調(diào)控，如在肝癌中Mir-22和Mir-613都能調(diào)控YWHAZ的表達[10,11]，Mir-22被報道能顯著抑制平滑肌由收縮型向合成型轉(zhuǎn)化，抑制平滑肌細胞的增殖和遷移以及血管損傷后的內(nèi)膜新生[12]，同時，Mir-22也能抑制閉塞性動脈硬化癥患者的血管平滑肌細胞的增殖和遷移[13]。此外，YWHAZ還可以調(diào)控多種腫瘤細胞的凋亡以及自噬[14]。在主動脈夾層的病理過程中，平滑肌細胞數(shù)量顯著減少且由收縮型向合成型轉(zhuǎn)化，導致平滑肌細胞數(shù)量減少的機制包括增殖抑制、凋亡增加以及過度自噬等[15,16]。因此，以上的研究成果提示YWHAZ升高可能會促進平滑肌細胞由收縮型向合成型轉(zhuǎn)化，同時，也可能促進平滑肌細胞的凋亡和過度自噬，從而導致主動脈中層退變。

此外炎癥細胞的浸潤以及炎癥因子的分泌對主動脈夾層的發(fā)生至關(guān)重要，有研究結(jié)果表明，血管緊張素Ⅱ以及異丙腎上腺素雖然都能升高小鼠的血壓，但由于異丙腎上腺素并不能誘導炎癥的產(chǎn)生，因此，只有血管緊張素Ⅱ能有效誘發(fā)主動脈夾層的發(fā)生[17]。有研究顯示，Mir-451可通過YWHAZ調(diào)控炎癥因子的產(chǎn)生[18]。因此，YWHAZ的升高可能會激活主動脈壁中的炎癥信號通路，從而募集炎癥細胞浸潤，分泌炎癥因子，促進主動脈夾層的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)YWHAZ在主動脈夾層患者主動脈壁中高表達，其可能通過促進平滑肌細胞的凋亡、過度自噬以及炎癥反應(yīng)從而促進主動脈夾層的發(fā)生發(fā)展。因此，該發(fā)現(xiàn)為主動脈夾層的診斷及治療提供新的思路及分子靶點，但YWHAZ對主動脈夾層的影響以及具體的分子機制還有待進一步研究。