吳曼穎，熊興耀

張家界大葉黃楊炭疽病的病原菌鑒定

吳曼穎1，熊興耀2*

(1.吉首大學土木工程與建筑學院，湖南 張家界 427000；2.中國農業(yè)科學研究院農業(yè)基因組研究所，廣東 深圳 518000)

對從湖南省張家界市永定區(qū)采集的疑似炭疽病的大葉黃楊病葉進行分離培養(yǎng)，獲得1類純化菌株，挑選代表菌株進行致病性測定，通過柯赫氏法則確定其為致病菌。依據菌落特征、分生孢子的形態(tài)特征，結合多基因的系統(tǒng)發(fā)育分析，代表分離菌株與暹羅炭疽菌()聚為一支。

大葉黃楊；炭疽??；形態(tài)鑒定；分子鑒定；張家界

大葉黃楊(Thumb)又名冬青衛(wèi)矛、正木，為衛(wèi)矛科(Celastraceae)衛(wèi)矛屬(L)常綠灌木或小喬木，在生長發(fā)育過程中主要受炭疽病、白粉病、褐斑病和瘡痂病的危害，其中炭疽病發(fā)病率較高，病害多發(fā)生于葉部，嚴重時導致植株死亡。大葉黃楊作為園林觀賞植物在湖南省大面積種植。已有的研究發(fā)現，中國浙江省[1]、四川省[2]、江蘇省[3]大葉黃楊炭疽病的病原菌為，而韓國科學家LEE[4]則認為是大葉黃楊炭疽病的病原體。2019年筆者在湖南省張家界市對大葉黃楊真菌性病害調查時，在永定區(qū)大庸橋公園發(fā)現大葉黃楊葉片發(fā)生類似炭疽病的癥狀。為查明病因，采集了發(fā)病的大葉黃楊病葉樣，對病原菌進行分離，并進行形態(tài)學觀察、構建多基因系統(tǒng)發(fā)育樹，以及柯赫氏法則驗證，旨在為準確鑒定和及時有效防治該病害提供依據。

1　材料與方法

1.1　材料

2019年8—9月，在湖南省張家界市永定區(qū)大庸橋公園，發(fā)現大葉黃楊葉片出現類似炭疽病癥狀，遂采集大葉黃楊疑似炭疽病病葉。

1.2　方法

1.2.1病原菌的分離純化及形態(tài)學鑒定

觀察記錄發(fā)病部位、發(fā)病癥狀，并進行病原菌分離和純化。洗凈病葉，用0.5%NaClO浸泡1 min后，用75%乙醇漂洗30 s，再用無菌水漂洗3次，取無菌濾紙吸干葉片表面水分。將病樣剪成0.2～0.3 cm大小的方塊，接種在PDA培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)箱中26 ℃培養(yǎng)(暗培養(yǎng))3 d后進行純化，純化培養(yǎng)物于26 ℃暗培養(yǎng)，定時觀察記錄菌落形態(tài)。

將分離得到的菌株接種在PDA培養(yǎng)基上，觀察記錄菌落的形態(tài)、色澤，并利用顯微鏡觀察菌株孢子的形態(tài)特征。

1.2.2分離菌株的致病力檢測

參照文獻[5]的方法，以孢子懸浮液為接種體，選用健康葉片，用砂紙擦拭方法接種。于26 ℃恒溫箱中保濕培養(yǎng)。接種后，每天觀察記錄發(fā)病情況。葉片發(fā)病后，從病部分離菌株，完成柯赫氏法則驗證。

1.2.3多基因聯合鑒定

菌落于PDA培養(yǎng)皿中長滿后，挑取菌核，按照“DNAsecure Plant Kit”說明書提取菌株DNA，進行rDNA-ITS(ITS)[6]、部分肌動蛋白(ACT)基因[7]、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因、部分β-微管蛋白(TUB2)[8]基因組區(qū)域、鈣調蛋白(CAL)基因[9]、幾丁質合酶(CHS-1)基因[10]的分析。

使用引物(表1)進行PCR擴增。每個反應體系包括25 μL Premix酶，上、下游引物各1 μL，1 μL DNA模板和22 μL水，總體積為50 μL。PCR擴增條件：94 °C預變性10 min；94 °C變性30 s，退火45 s，72 °C延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。將PCR擴增產物進行電泳檢測，并送湖南省擎科生物技術有限公司進行雙向測序。所產生的序列保存在NCBI基因庫中。利用數據庫已發(fā)表的序列與測序結果進行同源性對比分析。采用軟件(MEGA 6)的最大似然法構建系統(tǒng)進化樹，以確定病原菌的分類地位。

表1　引物序列及其退火溫度

2　結果與分析

2.1　供試大葉黃楊病葉的病害癥狀與病原菌形態(tài)

大葉黃楊葉片出現的疑似炭疽病癥狀(圖1-1、圖1-2)，發(fā)病初期，葉片的正面出現一些不規(guī)則的褪綠斑點(直徑0.3~1.2 mm、平均0.7 mm)，這些斑點擴大并聚結形成大的、規(guī)則的或不規(guī)則的褪綠到壞死斑點(圖1-3)。大多數斑點最后會形成褐色或深褐色病斑(圖1-4、圖1-5)。病斑上有許多小黑點(分生孢子盤，圖1-6)，嚴重時病斑連片，葉片脫落。

1、2　發(fā)病嚴重的大葉黃楊；3　發(fā)病初期的癥狀；4　發(fā)病中期的癥狀；5　發(fā)病較重的癥狀；6　病斑上形成的小黑點。

將分離的菌株純化后得到一類菌落，代表菌株EJ.W01菌落正面產生白色的氣生菌絲(圖2-1)，背面為淺橙色(圖2-2)，培養(yǎng)10 d左右有少量橙色孢子堆產生。分生孢子單孢，透明，圓柱形，兩端鈍圓(圖2-3)。隨機選取100個分生孢子，測得孢子大小為( 12.3～18.1) μm ×( 3.4～7.2) μm。初步鑒定引起大葉黃楊炭疽病的病原菌為炭疽菌屬真菌(spp.)。

1　菌株EJ.W01培養(yǎng)7 d后正面；2　培養(yǎng)7 d后的背面；3　孢子形態(tài)。

2.2　病原菌的致病性

將分離的代表菌株EJ.W01的孢子懸浮液回接至擦傷的健康大葉黃楊葉片后，置于26 ℃保濕培養(yǎng)。接種5 d后，涂抹EJ.W01的孢子懸浮液的葉片均發(fā)病，病斑形態(tài)與林間發(fā)病癥狀相似，病斑大小無明顯差異(圖3)，對照葉片未發(fā)病。將人工接種感病的葉片進行病原菌的分離，完成柯赫氏法則驗證，原接種病原菌與所得病原菌形態(tài)特征一致，說明EJ.W01為大葉黃楊病葉的病原菌。

1　健康葉片；2　接種后發(fā)病葉片。

2.3　致病菌基因序列分析

以菌株EJ.W01的DNA為模板進行PCR擴增。以為外群構建，運用MEGA6.0進行多基因系統(tǒng)發(fā)育分析，比較來自代表菌株EJ.W01和.復合物的參考菌株的、、、、-和核苷酸序列。結果表明，EJ.W01與暹羅炭疽菌()形成進化支(圖4)，確定病原菌為暹羅炭疽菌()。

圖4　運用MEGA6對分離菌株EJ.W01的多基因聯合序列構建的系統(tǒng)進化樹

3　結論與討論

對湖南省張家界市永定區(qū)大葉黃楊炭疽病的病原菌進行鑒定，確定大葉黃楊葉片炭疽病的病原菌是暹羅炭疽菌()。炭疽病一直存在一病多菌的現象，大葉黃楊生長的環(huán)境不同，患病樣本優(yōu)勢種群存在差異。在張家界采集的大葉黃楊炭疽病葉片中，沒有發(fā)現、，這可能與患病樣本的采集地有關，也可能是因為分離菌株的數量有限。

炭疽屬真菌遺傳多樣性豐富，其分類較混亂。屬于復合物的物種，由至少22種物種組成[11]，僅憑形態(tài)特征和分生孢子并不能區(qū)分這些物種[12]。菌株形態(tài)學特征只能將菌株初步鑒定為炭疽屬真菌。筆者分離純化的菌株EJ.W01在形態(tài)特征上與復合物相似，可以初步判斷屬于炭疽屬真菌。為進一步確認其分類水平，通過多基因位點分析來鑒定該菌株的分類地位。ITS區(qū)域雖然是最常用的區(qū)分真菌的區(qū)域[6]，但普遍認為該序列不能較好地區(qū)分膠胞復合種里的近緣種sp.[11]，而多基因位點分析廣泛應用于炭疽菌(sp.)的分類[13]。筆者選擇了6個基因區(qū)域(ITS，GAPDH，CAL，ACT，CHS-1和TUB2)對分離株進行分類，并成功地將分離株鑒定為。

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Pathogen identification of anthracnose onin Hunan Province

WU Manying1，XIONG Xingyao2*

(1.School of Civil Engineering and Architectural, Jishou University, Zhangjiajie, Hunan 427000, China; 2.Institute of Agricultural Genomics, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Shenzhen, Guangdong 518000, China)

The diseased leaves ofcollected from Yongding District, Zhangjiajie City, Hunan Province were collected, and pathogen isolation and cultivation were conducted. A purified class 1 strain was obtained, and the representative strains were selected for pathogenicity test and identified as pathogenic fungi by Koch’s law. According to the characteristics of colony and conidia morphology,combined with the phylogenetic analysis of polygenes, the representative isolates were clustered withto one branch.

; anthracnose; pathogen identification; molecular identification; Zhangjiajie City

S763.15

A

1007-1032(2020)06-0706-05

吳曼穎，熊興耀．張家界大葉黃楊炭疽病的病原菌鑒定[J]．湖南農業(yè)大學學報(自然科學版)，2020，46(6)：706-710．

WU M Y，XIONG X Y. Pathogen identification of anthracnose onin Hunan Province[J]. Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences), 2020, 46(6): 706-710.

http://xb.hunau.edu.cn

2020-05-26

2020-11-09

湖南省作物種質創(chuàng)新與資源利用重點實驗室開放項目(17KFXM07)

吳曼穎(1983—)，女，湖南慈利人，博士，講師，主要從事園林植物研究，wumanying911@126.com；*通信作者，熊興耀，博士，教授，主要從事馬鈴薯病害研究，xiongxingyao@caas.cn

10.13331/j.cnki.jhau.2020.06.011

責任編輯：羅慧敏

英文編輯：羅維