潘嘉立，趙燕，黃麗華，高晗，黃妤，陳金軍，張學文

生長素在煙草表皮毛中的極性運輸及對細胞伸長的影響

潘嘉立，趙燕，黃麗華，高晗，黃妤，陳金軍，張學文*

(湖南農(nóng)業(yè)大學生物科學技術學院，湖南 長沙 410128)

利用生長素極性運輸轉(zhuǎn)運蛋白PIN1與增強綠色熒光蛋白EGFP的融合，對PIN1進行了熒光標記，并以煙草表皮毛為模式，開展了PIN1對生長素極性運輸及對細胞伸長生長影響的研究。采用DNA重組技術，將融合標記基因置于擬南芥表皮毛特異表達基因的啟動子調(diào)控下，構(gòu)建成含的Ti質(zhì)粒，以根癌農(nóng)桿菌葉盤共培轉(zhuǎn)化法將重組標記基因轉(zhuǎn)化至煙草WS38中，篩選鑒定出多株轉(zhuǎn)基因煙草。通過對這些轉(zhuǎn)基因煙草表皮毛進行顯微熒光觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，標記的綠色熒光信號集中分布在表皮毛細胞的間隔區(qū)，表現(xiàn)為明顯的極性分布現(xiàn)象。用生長素極性運輸抑制劑三碘苯甲酸(TIBA)處理后，表皮毛的伸長生長受到抑制，細胞中熒光的分布極性減弱。說明生長素在煙草表皮毛中的極性分布對煙草表皮毛伸長起關鍵作用，抑制生長素的極性運輸不只抑制表皮毛的細胞伸長，同時還影響到生長素極性運輸?shù)鞍譖IN的極性分布。

煙草；生長素；極性運輸；表皮毛；細胞伸長

植物細胞的伸長生長是細胞初生生長的主要過程，決定了細胞成熟后的長度和大小。這一過程涉及細胞骨架的方向性延展、細胞膜的增大及細胞壁的延伸等細胞變化。對于纖維植物而言，細胞初生生長是決定纖維長度，進而決定其產(chǎn)量品質(zhì)的重要因素。在研究植物細胞伸長生長過程中，多細胞的表皮毛提供了一個較好的模式[1-2]。在擬南芥表皮毛細胞中過表達生長素合成基因，可以顯著增加葉片表皮毛的分布密度，但表皮毛長度無顯著變化[3]。而在煙草的表皮毛細胞中過表達，則可促進其細胞的伸長生長[4]。對這兩者的差異性有必要進行深入研究。

植物生長素是調(diào)節(jié)細胞生長發(fā)育的重要激素，它參與細胞伸長的調(diào)節(jié)，是構(gòu)成植物向性生長的基礎。在擬南芥向光性生長中，通過對生長素響應分子標記的研究，發(fā)現(xiàn)擬南芥的下胚軸背光側(cè)有更高濃度的生長素分布，促進背光側(cè)細胞相對更多的伸長生長，使胚軸向光的方向彎曲[5]。在植物葉原基、側(cè)枝原基、側(cè)根原基及花原基等器官啟動時，都在原基位點形成生長素極高值的分布點[6]。生長素的極性分布主要依賴于1種關鍵轉(zhuǎn)運蛋白(PIN)對生長素在臨近細胞間的極性運輸來實現(xiàn)。事實上PIN是植物中廣泛存在的一類生長素輸出載體家族蛋白[7]，在擬南芥中已鑒定出8個家族成員，分別在不同的組織或信號反應中參與生長素的極性運輸[8]。通過對PIN蛋白進行標記，結(jié)合對生長素響應的啟動子，如GH3、Dr5等調(diào)控報告基因，進行GUS標記，是目前研究生長素極性運輸和濃度分布的常用方法[9-10]。

為了驗證煙草表皮毛細胞中生長素的極性運輸，本研究中，以增強型綠色熒光蛋白EGFP對擬南芥生長素極性運輸載體蛋白PIN1進行了融合標記，采用擬南芥表皮毛細胞特異表達的GL2啟動子，構(gòu)建1個含融合基因的Ti質(zhì)粒載體，通過根癌農(nóng)桿菌介導的葉盤共培養(yǎng)法轉(zhuǎn)化煙草WS38，對轉(zhuǎn)基因煙草表皮毛細胞開展熒光觀察，探究煙草表皮毛細胞中PIN存在的極性分布情況；以生長素極性運輸阻斷試劑TIBA進行處理，觀察表皮毛中PIN的分布情況及表皮毛形態(tài)的變化，旨在研究煙草單向伸長性多細胞的表皮毛細胞中生長素的極性運輸對其表皮毛伸長的影響。

1　材料與方法

1.1　材料

煙草()品種 WS38。大腸埃希菌()InvaF￠、根癌農(nóng)桿菌()LBA4404和Ti質(zhì)粒載體pEGAD均為湖南農(nóng)業(yè)大學細胞生物學實驗室保存。

1.2　方法

1.2.1標記載體pEGAD-的構(gòu)建

從Nucleotide數(shù)據(jù)庫中獲得擬南芥生長素極性運輸載體蛋白核心序列(登錄號AF089085.1)，根據(jù)其cds序列設計2條特異性引物，上游引物為5￠-CC CATGATTACGGCGGCGGA-3￠，下游引物為5￠-CGGTTTTGGTAATATCTCTTCATA GACC-3￠，其中下劃線部分分別為限制性內(nèi)切酶RⅠ和HⅠ酶切位點。根據(jù)載體序列設計2條同源重組引物，上游引物為5￠-GCTGCGGCA GCGGCCGAATTCATGATTACG GCGGCGGA-3￠，下游引物為5￠-CAGTTATCTAGATCCGGTGGATC CGTTTTGGTAATATCTCTTCATAGACC-3￠，用同源重組引物對PIN1片段cDNA進行PCR擴增，同時用限制性內(nèi)切酶RⅠ和HⅠ對載體進行雙酶切，純化2種產(chǎn)物，進行同源重組并轉(zhuǎn)化大腸埃希菌。小量提取構(gòu)建的重組質(zhì)粒，用電激法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404，獲得工程化根癌農(nóng)桿菌。

構(gòu)建的EGFP對PIN1標記表達載體pEGAD-T-DNA區(qū)如圖1所示。

圖1　植物表達載體pEGAD-GL2pro::EGFP- PIN1 T-DNA區(qū)

1.2.2轉(zhuǎn)基因煙草和擬南芥的轉(zhuǎn)化和篩選

選取煙草WS38野生型無菌苗幼嫩的葉片，切成0.5 cm小塊，接種于愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，預培養(yǎng)2 d后侵染，28 ℃暗培養(yǎng)3 d，將共培養(yǎng)的外植體轉(zhuǎn)移至加有10.0 g/mL 草胺膦(phosphinothricin, ppt)和羧芐青霉素(Carbenicillin, carb)的分化培養(yǎng)基(MS＋0.1 mg/L NAA＋1.0 mg/L 6-BA＋500.0 mg/L Carb＋7 g/L Agar)上。待選擇培養(yǎng)3周后，將外植體轉(zhuǎn)化細胞分化出的抗性不定芽轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基上，待不定芽長至1 cm左右時將其切下，并轉(zhuǎn)移至含有選擇壓力的生根培養(yǎng)基(1/2 MS＋0.05 mg/L NAA＋10.0 g/mL ppt＋7.0 g/L Agar)上培養(yǎng)，2～3周長出不定根。將再生的抗性植株進行煉苗和移栽，用CTAB法提取單株植株DNA，用PCR擴增的方法鑒定植株轉(zhuǎn)基因情況。

1.2.3煙草轉(zhuǎn)基因苗的分子檢測

用CTAB法提取經(jīng)過抗性篩選的煙草葉片總DNA，取100 ng DNA為模板，以GL2啟動子區(qū)域特異性引物5￠-CCCGAGCTCTTTCCTTCACTATAC -3￠和5￠-CCCACCGGTCAAATCCTGTCCCT-3￠進行PCR檢測，瓊脂糖凝膠電泳后鑒定轉(zhuǎn)基因煙草。

1.2.4轉(zhuǎn)基因煙草表皮毛的觀察

分別取煙草幼嫩葉芽及成熟葉片的葉尖、葉緣中部或葉基部置于顯微鏡下，以395 nm波長紫外光作為激發(fā)光，觀察轉(zhuǎn)基因煙草表皮毛的熒光分布并拍照記錄，以非激發(fā)狀態(tài)為對照。

配置濃度為7.0 mg/L生長素極性運輸抑制劑三碘苯甲酸(TIBA)，對轉(zhuǎn)基因煙草進行澆灌與頂端噴灑。1～2 d后，取新長的幼葉進行表皮毛熒光觀察并拍照，記錄表皮毛的長度。

2　結(jié)果與分析

2.1　轉(zhuǎn)基因煙草植株的鑒定

轉(zhuǎn)化篩選培育的試管苗經(jīng)煉苗后移栽至基質(zhì)中，獲得5株獨立轉(zhuǎn)化的煙草抗性苗。

利用檢測引物對5株抗性煙草苗進行PCR檢測，以質(zhì)粒模板作為陽性對照，野生型煙草作為陰性對照。經(jīng)鑒定，5株煙草抗性苗全為轉(zhuǎn)基因植株(圖2)。

M　DNA Marker；泳道1～5為5株獨立轉(zhuǎn)基因苗；CK-為非轉(zhuǎn)基因煙草DNA模板的陰性對照；CK+為質(zhì)粒模板的陽性對照。

2.2　轉(zhuǎn)基因煙草表皮毛標記的熒光觀察結(jié)果

以OLYMPUS BX41顯微鏡觀察葉尖、葉中和葉基部3個部位葉沿位置伸展的表皮毛細胞，對比395 nm波長激發(fā)熒光和無激發(fā)的普通光學下表皮毛中熒光的分布。結(jié)果如圖3所示。

a1、a2 葉基部葉沿；b1、b2 葉中部葉沿；c1、c2 葉尖部葉沿；d1、d2 野生型對照葉中部；a1、b1、c1及d1均為熒光激發(fā)觀察結(jié)果，a2、b2、c2和d2分別為對應的非激發(fā)狀態(tài)的觀察結(jié)果。

從圖3可以看出，轉(zhuǎn)基因煙草表皮毛中綠色熒光大部分集中分布在表皮毛的細胞間隔處，并朝細胞長軸的頂端分布，說明生長素極性運輸?shù)鞍自诩毎拈L極端存在極性分布現(xiàn)象。根據(jù)煙草表皮毛發(fā)育的進程，其葉尖部位表皮毛發(fā)育較早，表皮毛細胞相對成熟，而葉基部發(fā)育相對較遲，細胞正處于快速伸長生長期，細胞間的熒光較為均勻。野生型對照煙草表皮毛在激發(fā)狀態(tài)下，其腺性表皮毛頂端細胞及細胞間可以觀察到微弱橘紅色熒光，但沒有觀察到綠色熒光分布，可能是其腺細胞內(nèi)含物的激發(fā)熒光。

2.3　TIBA處理后煙草表皮毛的觀察結(jié)果

經(jīng)TIBA處理1～2 d后的煙草表皮毛，在395 nm波長激發(fā)光照射下觀察表皮毛中熒光分布情況(圖4)，發(fā)現(xiàn)綠色熒光在表皮毛中極性減弱或游離分布在表皮毛細胞中，表明TIBA抑制生長素的極性運輸，使PIN的極性分布受阻。

a1、a2 葉中部葉沿；b1、b2 葉尖部葉沿。a1和b1為激發(fā)熒光下的觀察結(jié)果，a2和b2為非激化狀態(tài)的觀察結(jié)果。

在體視顯微鏡下，選取5個視野分別進行表皮毛長度統(tǒng)計，幼嫩區(qū)葉片葉沿表皮毛長度平均值為0.289 mm，成熟區(qū)葉片葉沿表皮毛長度平均值為0.465 mm；經(jīng)TIBA處理后的幼嫩區(qū)葉片葉沿表皮毛長度平均值為0.253 mm，成熟區(qū)葉片葉沿表皮毛長度平均值為0.319 mm。結(jié)果如圖5所示。經(jīng)TIBA處理的煙草葉片表皮毛與未經(jīng)處理的表皮毛發(fā)育早期其長度無顯著性差異，表皮毛發(fā)育成熟期葉片表皮毛長度存在顯著性差異。

A　葉片幼嫩區(qū)表皮毛；B　TIBA處理后幼嫩區(qū)葉片表皮毛；C　表皮毛發(fā)育成熟區(qū)表皮毛；D　TIBA處理后表皮毛發(fā)育成熟區(qū)表皮毛?！?*”示差異極顯著。

3　結(jié)論與討論

生長素的濃度和分布對不同細胞類型的影響不同。近十幾年來，隨著對生長素極性運輸研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)生長素在植物中不僅存在于莖尖向根的長距離極性運輸，也存在植物局部組織中細胞間的極性運輸，極性運輸在根尖還造成生長素的環(huán)流[11-12]。生長素在植物局部組織細胞間的極性運輸主要依靠PIN來實現(xiàn)。如果相鄰細胞內(nèi)的PIN都朝向一個中心點分布，就可以使生長素匯聚到中心區(qū)的細胞，形成生長素濃度的極值分布點，這是促進器官原基形成的基礎。

本研究中，通過綠色熒光蛋白對生長素極性運輸進行PIN的標記，在煙草表皮毛中觀察到PIN的極性分布，驗證了生長素對煙草表皮毛的極性促伸長作用。當用生長素極性運輸抑制劑TIBA處理煙草后，其表皮毛伸長作用被顯著抑制，PIN在表皮毛細胞中的分布極性也受到了影響，熒光標記在細胞中出現(xiàn)更多彌散性的信號。說明在煙草的表皮毛中，PIN的極性分布與生長素的極性運輸對細胞伸長的作用是直接相關的。

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The polar transport of the auxin in tobacco trichome and its effect on cell elongation

PAN Jiali, ZHAO Yan, HUANG Lihua, GAO Han, HUANG Yu, CHEN Jinjun, ZHANG Xuewen*

(College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha, Hunan 410128, China)

In this study, the enhanced green fluorescent protein(EGFP) was combined with auxin polar transporter PIN1 and made it fluorescently labeled. The effects of PIN1 on auxin polar transport and cell elongation growth were studied in tobacco trichome. The fusion label genewas recombined under the promoter of the trichome specific expression genefromto enable it specific expression in the transgenic. The recombinantwas constructed in the Ti plasmid pEGAD and then transformed into tobacco WS38 bymediated leaf disc co-culture transformation. Several transgenic tobacco plantlets were screened out and identified. The fluorescence observation of these transgenic tobacco trichome showed that the labeled green fluorescence signals appeared in the interval area of the trichome cells with an obvious polarity distribution. It enables the polarity transport of auxin in trichrome cells and forms a polarity distribution of axuin. After treatment with the auxin polar transport inhibitor triiodobenzoic acid (TIBA), the elongation growth of trichome was significantly inhibited and the polarity distribution of fluorescence in cells was also weakened. Thus, we conclude that the polarity distribution of auxin in tobacco trichome plays a key role in the elongation of tobacco trichome. Inhibition of auxin polar transport not only inhibited cell elongation of trichome, but also affected the polarity distribution of auxin polar transport protein PIN.

tobacco; auxin; polarity transport; trichome; cell elongation

S572；Q943

A

1007-1032(2020)06-0686-05

潘嘉立，趙燕，黃麗華，高晗，黃妤，陳金軍，張學文．生長素在煙草表皮毛中的極性運輸及對細胞伸長的影響[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學學報(自然科學版)，2020，46(6)：686-690．

PAN J L, ZHAO Y, HUANG L H, GAO H, HUANG Y, CHEN J J, ZHANG X W. The polar transport of the auxin in tobacco trichome and its effect on cell elongation[J]. Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences), 2020, 46(6): 686-690.

http://xb.hunau.edu.cn

2019-12-16

2020-01-17

湖南省教育廳重點科研項目(18A104)

潘嘉立(1995—)，男，湖南岳陽人，碩士研究生，主要從事植物遺傳學研究，284774653@qq.com；*通信作者，張學文，博士，教授，主要從事細胞生物學研究，xwzhang@hunau.edu.cn

10.13331/j.cnki.jhau.2020.06.008

責任編輯：毛友純

英文編輯：柳正