韓賀舟 董耀東 魏薇 馬秀嵐

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科

毛細(xì)胞是構(gòu)成聽覺感受器的重要組成部分，研究表明，老化、噪聲及耳毒性藥物均可造成毛細(xì)胞損傷，進(jìn)而導(dǎo)致感音神經(jīng)性聽力損傷[1]。目前，國(guó)內(nèi)外最新研究結(jié)果顯示，耳蝸毛細(xì)胞在魚和兩棲類動(dòng)物中損傷后可以再生，但在哺乳動(dòng)物中損傷后不可再生，故重建耳蝸感覺上皮結(jié)構(gòu)，促進(jìn)耳蝸毛細(xì)胞再生有望成為治療感音神經(jīng)性聽力損失的理想手段[2]。大量研究表明，毛細(xì)胞再生可能與細(xì)胞自身修復(fù)，支持細(xì)胞和感覺上皮細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)化，以及干細(xì)胞的轉(zhuǎn)化密切相關(guān)[3]。但毛細(xì)胞是否可以再生以及通過何種途徑實(shí)現(xiàn)再生尚存在爭(zhēng)議，故本文將從支持細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)分化、誘導(dǎo)干細(xì)胞或者成熟體細(xì)胞向毛細(xì)胞系轉(zhuǎn)化及毛細(xì)胞的自我修復(fù)三個(gè)方面對(duì)毛細(xì)胞再生機(jī)制的最新研究進(jìn)展進(jìn)行歸納和總結(jié)。

1 支持細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)分化

在哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育過程中，耳蝸毛細(xì)胞和支持細(xì)胞有共同的前體細(xì)胞，因此支持細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)分化是目前毛細(xì)胞再生研究的焦點(diǎn)。原代培養(yǎng)的橢圓囊感覺上皮細(xì)胞能產(chǎn)生毛細(xì)胞樣細(xì)胞，且能表達(dá)支持細(xì)胞的標(biāo)記物，表明橢圓囊感覺上皮細(xì)胞可能是毛細(xì)胞再生的前體細(xì)胞之一[1]。

鳥類內(nèi)耳再生實(shí)驗(yàn)表明，毛細(xì)胞損傷后周圍的支持細(xì)胞大量增殖，而新生的毛細(xì)胞是通過有絲分裂增殖形成[2]，提示新生的毛細(xì)胞很有可能是周圍的支持細(xì)胞分化而來(lái)。目前，有研究者通過使用特殊的化學(xué)物質(zhì)或者在小鼠的胚胎中轉(zhuǎn)染Atoh1基因，促進(jìn)前庭系統(tǒng)中的支持細(xì)胞轉(zhuǎn)化為毛細(xì)胞[3]，進(jìn)而緩解聽力損失。但結(jié)果顯示，這種基因治療具有很多致命的缺陷，首先Atoh1基因過表達(dá)會(huì)促進(jìn)Mucin2的表達(dá)[4]，而Mucin2是許多粘液性癌的粘液性成分；其次Atoh1基因的過表達(dá)與髓母細(xì)胞瘤的發(fā)生相關(guān)。同時(shí)有實(shí)驗(yàn)證明某種修飾過的Atoh1基因可加速腫瘤的生長(zhǎng)速度[5-6]。因此，對(duì)于注入基因ATOH1治療聽力損失的安全性還有待考量。另外，細(xì)胞基因表達(dá)級(jí)聯(lián)與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)被認(rèn)為是決定毛細(xì)胞命運(yùn)的最重要的臨床問題[7]。在毛細(xì)胞分化過程中，WNTs、FGFs、BMP、Shh和Notch等信號(hào)分子發(fā)揮了不同的作用。Notch信號(hào)和PCP信號(hào)在感覺上皮細(xì)胞和耳蝸器官會(huì)聚性伸展中的中心作用已被確定。Atoh1對(duì)于支持細(xì)胞分化的影響作用，除了Notch信號(hào)外，其他信號(hào)也參與了Atoh1的表達(dá)調(diào)控。例如，Sox2抑制Atoh1的表達(dá)并促進(jìn)Prox1的表達(dá)，Prox1是針對(duì)新生支持細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子[8]。在層狀上皮的基底細(xì)胞中，p63可維持基底細(xì)胞的增殖能力。p63在發(fā)育的耳蝸中表達(dá)，并誘導(dǎo)Atoh1、Prox1和Hes5的表達(dá)，調(diào)節(jié)聽覺上皮細(xì)胞的分化，并且p63基因的破壞導(dǎo)致Corti器官中額外的內(nèi)/外毛細(xì)胞出現(xiàn)[9]。NMII集中在縮短的細(xì)胞-細(xì)胞連接處，是小鼠聽上皮會(huì)聚延伸所必需的[10]，但NMII在聽覺上皮細(xì)胞中的作用有待進(jìn)一步研究確定。故有關(guān)耳蝸上皮分層、會(huì)聚延伸和前列腺上皮嵌合形成的特異性復(fù)雜性機(jī)制仍有待闡明。

miRNA因其具有高度保守性和其在細(xì)胞內(nèi)的重要調(diào)節(jié)作用，是目前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究熱點(diǎn)。其中，miRNA-183家族是位于人類7號(hào)染色體上的具有高度保守的miRNA家族的一員，有研究證明miRNA-183對(duì)于毛細(xì)胞再生有明顯的促進(jìn)作用[11-12]。Notch信號(hào)通路通過下調(diào)miRNA-183的表達(dá)，抑制毛細(xì)胞的增殖，從而參與內(nèi)耳發(fā)育和細(xì)胞分化的調(diào)控過程。同時(shí)也有實(shí)驗(yàn)分別利用miRNA-182mimics和siRNA在新生大鼠耳蝸前體細(xì)胞中過表達(dá)和低表達(dá)miRNA-182，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)miRNA-182可以促進(jìn)耳蝸前體細(xì)胞分化成毛細(xì)胞[13]。斑馬魚的毛細(xì)胞可以再生而小鼠作為哺乳動(dòng)物的毛細(xì)胞一直以來(lái)被認(rèn)為是不能再生的，分別對(duì)斑馬魚和小鼠的毛細(xì)胞進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miRNA對(duì)于兩種動(dòng)物模型的毛細(xì)胞調(diào)控作用一致，此項(xiàng)研究為聽力損傷的基因治療提供了可能性。通過支持細(xì)胞的增殖隨后產(chǎn)生毛細(xì)胞的有絲分裂再生，需要通過基因重編程過程，包括激活β—catenin以上調(diào)Wnt信號(hào)，缺失Notch1以下調(diào)Notch信號(hào)，以及新生小鼠耳蝸中的支持細(xì)胞Sox2(+)伴隨著過表達(dá)Atoh1。此外，在Notch1敲除的Sox2(+)細(xì)胞中，刪除β-catenin后，Notch1缺失誘導(dǎo)的毛細(xì)胞增殖消失，這進(jìn)一步表明Notch信號(hào)是Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的上游和負(fù)調(diào)控因子。通過與正常人耳蝸相比，β—catenin激活、Notch1缺失和β—catenin激活聯(lián)合Notch1缺失組的轉(zhuǎn)錄，鑒定了參與增殖和轉(zhuǎn)分化過程的多個(gè)基因，這些基因不是受單個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)途徑控制，就是受Wnt和Notch聯(lián)合傳導(dǎo)信號(hào)的控制[14]。

2 誘導(dǎo)干細(xì)胞或者成熟體細(xì)胞向毛細(xì)胞系轉(zhuǎn)化

對(duì)于內(nèi)耳的干細(xì)胞移植注射路徑主要有：圓窗、半規(guī)管、中階、蝸軸等，圓窗入路移植和半規(guī)管入路移植原理一致，都是通過外淋巴液的流動(dòng)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞遷移。因?yàn)閳A窗注射途徑與臨床操作接近，所以在技術(shù)路線上可行性較高[15]。那么主要問題就在能否找到誘導(dǎo)干細(xì)胞向毛細(xì)胞轉(zhuǎn)化的小分子組合進(jìn)而可以控制干細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達(dá)[16]。但是干細(xì)胞治療存在許多局限性：首先是分化成功率比較低，轉(zhuǎn)化成功率僅有1%-2%[17]；其次是干細(xì)胞的分化潛能具有不可控性，容易導(dǎo)致腫瘤的產(chǎn)生，因?yàn)槿诤系募?xì)胞可能無(wú)限的分裂下去；并且移植的干細(xì)胞可能與宿主發(fā)生排斥反應(yīng)；最后干細(xì)胞可能會(huì)向鄰近腦組織遷移進(jìn)而破壞腦組織，因此干細(xì)胞治療感音神經(jīng)性耳聾還面臨許多挑戰(zhàn)[18]。于是新的假想出現(xiàn)了：如果用分化成熟的人體細(xì)胞完成向毛細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化是不是就能避免這些問題，有數(shù)據(jù)表明，基于GPA的治療能夠使成纖維細(xì)胞完成向毛細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[19]。在成熟的耳蝸中，通過高分辨率的轉(zhuǎn)錄分離，將Isl1（胰島因子1）作為一種與Atoh1聯(lián)合重新編程的因素[20]，是目前比較前沿的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)研究。新霉素?fù)p傷可以顯著增加Lgr5+標(biāo)記的祖細(xì)胞再生成毛細(xì)胞的能力，然而新霉素對(duì)于Lgr5+標(biāo)記的祖細(xì)胞的增生效果不顯著[21]。目前關(guān)于Lgr5+祖細(xì)胞再生機(jī)制并不清楚，只能確定基因在細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)中起到了重要作用。目前發(fā)現(xiàn)Cdkn1a、Mdm2、Tfdp1和 Wee1基因在 NLPs(neomycin-treated Lgr5+progenitors,新霉素處理Lgr5+祖細(xì)胞)中明顯上調(diào)，而Ccne2、Gadd45g、Nek2、Sfn和Stmn1在ULPs(untreated Lgr5+progenitors,未用新霉素處理的Lgr5+祖細(xì)胞)中明顯下調(diào)。其中Cdkn1a[22]和Mdm2[23]的機(jī)制得到了闡明。另外，轉(zhuǎn)錄因子也在Lgr5+標(biāo)記的祖細(xì)胞再生中發(fā)生變化，在ULPs中，Hes1、Hes5[24]、Hey1[25]、HeyL[26]、Id1、Id2 和Id3[27]表達(dá)明顯下調(diào)。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)miRNAs對(duì)于毛細(xì)胞的保護(hù)和再生有重要的意義，在NLPs中miR466i表達(dá)上調(diào)，而 miR7007、mmu-miR-703、miR107、miR361、miR6918、miR6982和miR3099表達(dá)下調(diào)[28]。Shh、Hippo和TGFβ三個(gè)信號(hào)通路對(duì)于內(nèi)耳細(xì)胞的發(fā)育很重要[29-31]。

Sox2是控制毛細(xì)胞所必需的細(xì)胞因子，Sox2可通過激活A(yù)toh1進(jìn)而影響毛細(xì)胞的形成和成熟[32]。此外，Sox2單倍體不足和損傷是β—catenin誘導(dǎo)新生耳蝸的過渡細(xì)胞（從支持細(xì)胞向毛細(xì)胞樣細(xì)胞直接表型轉(zhuǎn)化的細(xì)胞）增殖和形成的允許信號(hào)[33]。研究表明，Sox2在分化毛細(xì)胞中的下調(diào)取決于Six1活性，Six1發(fā)生突變后可導(dǎo)致耳蝸中整個(gè)器官發(fā)育障礙[34]。在耳蝸器官分化過程中，維持Fgf8的表達(dá)及N-cadherin和E-cadherin的動(dòng)態(tài)分布需要Six1[35]，且Six1基因劑量可能對(duì)內(nèi)毛細(xì)胞和外毛細(xì)胞的發(fā)育有不同的影響。運(yùn)動(dòng)蛋白肌球蛋白II調(diào)節(jié)Corti器官的延伸以及毛細(xì)胞和支持細(xì)胞排列成有序的行。膠原受體DDR1與小鼠內(nèi)耳非肌肉肌球蛋白IIA共定位，有助于運(yùn)動(dòng)細(xì)胞的構(gòu)筑和穩(wěn)定性。已經(jīng)確定DDR1和NM-IIA共同定位在螺旋韌帶的III型纖維細(xì)胞（張力纖維細(xì)胞）、OHCs和內(nèi)毛細(xì)胞的立體纖毛中，且DDR1與肌動(dòng)蛋白/肌球蛋白復(fù)合物的蛋白質(zhì)協(xié)同，以維持內(nèi)耳的機(jī)械力，并穩(wěn)定OHC細(xì)胞形狀，以便進(jìn)行適當(dāng)?shù)穆犛X信號(hào)傳導(dǎo)[36]，這是蛋白質(zhì)組合療法的新思路。

3 毛細(xì)胞的自我修復(fù)

毛細(xì)胞的自我修復(fù)雖然在人類中沒有具體的研究，但是在蜥蜴的囊胚中，慶大霉素能夠誘導(dǎo)毛細(xì)胞損傷后的恢復(fù)與再生[37]，這表明，在外突和紋狀體出現(xiàn)感覺上皮修復(fù)和毛細(xì)胞再生，其中恢復(fù)主要通過支持細(xì)胞的增殖或者是毛細(xì)胞的自我修復(fù)實(shí)現(xiàn)。感覺上皮的細(xì)胞增生也是有限的，故毛細(xì)胞的自我修復(fù)是毛細(xì)胞再生的一個(gè)重要機(jī)制。胰島素、FGF2和EGF幾種營(yíng)養(yǎng)因子的協(xié)同作用對(duì)毛細(xì)胞損傷丟失后的修復(fù)存在一定的影響。

4 小結(jié)

再生療法的當(dāng)前策略是通過基因和藥物治療實(shí)現(xiàn)內(nèi)耳毛細(xì)胞再生，替換受損的內(nèi)耳細(xì)胞（細(xì)胞療法）。因此，目前可能尚無(wú)在活體內(nèi)毛細(xì)胞再生的技術(shù)手段，但是對(duì)于耳蝸毛細(xì)胞再生和毛細(xì)胞修復(fù)的基因研究我們已經(jīng)取得了突破，也許未來(lái)可以結(jié)合耳內(nèi)鏡的探測(cè)技術(shù)和基因研究機(jī)制的突破，在耳蝸毛細(xì)胞再生研究領(lǐng)域?qū)⑷〉猛黄菩赃M(jìn)展。