鐘婷婷，任虎，席瑞闌，許飏

[1.綿陽(yáng)市第三人民醫(yī)院（四川省精神衛(wèi)生中心） 皮膚科，四川 綿陽(yáng) 621000；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 皮膚科，四川 瀘州 646000]

水痘-帶狀皰疹病毒（varicella-zoster virus, VZV）可導(dǎo)致水痘和帶狀皰疹[1]，監(jiān)測(cè)VZV 有助于評(píng)價(jià)其傳染性[2]。VZV 是醫(yī)院感染的常見(jiàn)病毒之一，而血液病毒檢測(cè)有助于早期診斷[3-4]。早期持續(xù)性監(jiān)測(cè)外周和中樞VZV DNA 水平變化，對(duì)判斷病毒性腦膜炎和病毒性腦炎病情進(jìn)展十分重要[5]。目前qPCR 試劑盒成本高昂，難以得到普遍應(yīng)用[6]，急需一種快捷、經(jīng)濟(jì)、有效的VZV 檢測(cè)方法。有研究利用巢式PCR 從病毒感染宿主血液中得到DNA，經(jīng)純化后作為標(biāo)準(zhǔn)品用于病毒核酸的qPCR 檢測(cè)[7]。本研究據(jù)此設(shè)計(jì)一種改良的qPCR，與VZV DNA 試劑盒進(jìn)行對(duì)比，并進(jìn)一步分析其臨床應(yīng)用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年5月—2017年7月在西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院就診的帶狀皰疹患者31例。診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《中國(guó)臨床皮膚病學(xué)》[8]。患者均無(wú)認(rèn)知障礙，同意參與本研究，并接受標(biāo)準(zhǔn)伐昔洛韋抗病毒治療方案。伐昔洛韋（西班牙Glaxo Wellcome, S.A.公司，批號(hào)H20150209）1 000 mg/次，3 次/d，連續(xù)7 d）[9]。

1.2 主要試劑及儀器

血液/細(xì)胞/組織基因組DNA 提取試劑盒（離心柱型）及引物購(gòu)自北京天根生化科技公司，PCR Master Mix（2X）試劑購(gòu)自北京博邁德生物公司，瓊脂糖凝膠試劑購(gòu)自北京沃比森科技有限公司，VZV 的qPCR 試劑盒（Taqman 探針?lè)ǎ┵?gòu)自上海之江生物科技股份有限公司。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀購(gòu)自美國(guó)ABI 公司，設(shè)計(jì)引物的Primer Premier 6.0 軟件購(gòu)自美國(guó)Premier 公司。

1.3 標(biāo)本采集和處理

采集帶狀皰疹患者的皰液標(biāo)本，利用離心柱法提取其DNA。采集臨床VZV 感染患者的外周血標(biāo)本，分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC）和血漿，用離心柱法提取PBMC 和血漿中的DNA。

1.4 巢式PCR 和凝膠電泳制備標(biāo)準(zhǔn)品

標(biāo)準(zhǔn)品引物1 正向引物：5'-GATCTCGGGT TCGCCTTTA-3'，反向引物：5'-CCAGAGCATTCGC GTTGTA-3'，長(zhǎng)度489 bp；標(biāo)準(zhǔn)品引物2 正向引物：5'-ATCTCGGGTTCGCCTTTAC-3'，反向引物：5'-TGGC ATAACACCACCGTCT-3'，長(zhǎng)度404 bp；標(biāo)準(zhǔn)品引物3正向引物：5'-CTCGGGTTCGCCTTTA-3'，反向引物：5'-ACACCACCGTCTAGTCTTAA-3'，長(zhǎng)度395 bp。巢式PCR 反應(yīng)體系：皰液DNA 樣品5μl，正反向引物各1μl，2×MasterMix 12.5μl，ddH2O 5.5μl；反 應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸5 min，共30 個(gè)循環(huán)。DNA 產(chǎn)物在4℃下保存。瓊脂糖凝膠電泳步驟：配置1.5%瓊脂糖，裝入錐形瓶放入微波爐中加熱溶解，待冷卻后倒入模具，常溫下放置30 min，拔除模具卡槽并將瓊脂糖凝膠放入1×TAE，加入Marker Ⅰ和DNA 產(chǎn)物在120 V下電泳約20 min，取出瓊脂糖膠塊并在紫外燈下顯影，膠塊上300 ～400 bp 為所需標(biāo)準(zhǔn)品的區(qū)間，切下該區(qū)間的瓊脂糖，通過(guò)膠回收得到標(biāo)準(zhǔn)品。采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品濃度，標(biāo)準(zhǔn)品定量為6.02×1023（拷貝/mol）×質(zhì)量濃度（g/ml）/（DNA 長(zhǎng)度×660）。

1.5 改良的qPCR

根據(jù)VZV DNA 保守序列ORF59 設(shè)計(jì)出正向引物：5'-CGGTTGGGTTGTCTTCTGTG-3'，反向引物：5'-GCGACGAACCGTAAGCGTGG-3'，長(zhǎng)度1 955 bp。改良的qPCR 反應(yīng)體系：VZV DNA 樣品1μl（梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品及PBMC、血漿中提取的DNA）、正反向引物各0.3μl、MasterMix（SYBR Green 法）10μl 和ddH2O 8.4μl；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性1 min，60℃退火30 s，72℃延伸2 min，共40 個(gè)循環(huán)。qPCR 檢測(cè)下限為15.5 拷貝/μl。熔解曲線(xiàn)：95℃變性1 min，55℃冷卻1 min，使DNA 雙鏈充分結(jié)合，最后從55℃逐步加熱至98℃，每一步增加0.5℃并保持10 s，同時(shí)采集熒光信號(hào)。

1.6 VZV DNA 試劑盒

采用Taqman 探針?lè)╭PCR，反應(yīng)體系：混合液35.0μl、酶（Taq+UNG）0.4μl 和樣品4.0μl（梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品及PBMC、血漿中提取的DNA）。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min，93℃變性15 s，60℃退火60 s，共40 個(gè)循環(huán)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較用Fisher 確切概率法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品分析

在3 次巢式PCR 反應(yīng)中，分別加入標(biāo)準(zhǔn)品引物1、標(biāo)準(zhǔn)品引物2 和標(biāo)準(zhǔn)品引物3。在第1 次PCR 反應(yīng)中利用皰液中的VZV DNA 作為模板，得到大小為489 bp 的產(chǎn)物1 ；在第2 次PCR 反應(yīng)中以產(chǎn)物1作為模板，得到大小為404 bp 的產(chǎn)物2；在第3 次PCR 反應(yīng)中以產(chǎn)物2 為模板，得到大小為395 bp的產(chǎn)物3，即標(biāo)準(zhǔn)品。以上產(chǎn)物在凝膠電泳實(shí)驗(yàn)中均無(wú)雜帶出現(xiàn)（見(jiàn)圖1）。標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)測(cè)序，并與VZV DNA 進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)兩者匹配程度高，且匹配片段相似性良好，標(biāo)準(zhǔn)品被匹配的堿基數(shù)占比為99%（見(jiàn)圖2）。故利用巢式PCR 制備的產(chǎn)物3 純度、特異性和穩(wěn)定性均良好，可以用作qPCR 實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)品。

圖1 3 次巢式PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果

圖2 Blast 檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品堿基與VZV DNA 堿基的配對(duì)

2.2 改良的qPCR 反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、擴(kuò)增曲線(xiàn)及熔解曲線(xiàn)

以巢式PCR 制備的產(chǎn)物3 作為標(biāo)準(zhǔn)品，并梯度稀釋?zhuān)?×100、1×101/2、1×101、1×102、1×103），然后采用改良的qPCR 進(jìn)行檢測(cè)。其中標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)決定系數(shù)R2=0.9999，回歸方程Y=-3.9367X+45.07。見(jiàn)圖3～5。

圖3 改良的qPCR 反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

圖4 改良的qPCR 反應(yīng)的擴(kuò)增曲線(xiàn)

2.3 兩種VZV DNA 檢測(cè)方法比較

隨機(jī)抽取15例帶狀皰疹患者，分離出PBMC 標(biāo)本，分別采用改良的qPCR 與VZV DNA 試劑盒檢測(cè)PBMC 中VZV DNA 陽(yáng)性率。2 種方法的陽(yáng)性率均為73.3%（11/15），經(jīng)Fisher 確切概率法檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=1.000）。2 種檢測(cè)方法效果相近。

2.4 2 種標(biāo)本治療前后的VZV DNA 陽(yáng)性率變化

隨機(jī)抽取22例帶狀皰疹患者，分離出PBMC 和血漿標(biāo)本，采用改良的qPCR 檢測(cè)伐昔洛韋抗病毒治療前后VZV DNA 的陽(yáng)性率。在治療前、治療后，PBMC 與血漿的VZV DNA 陽(yáng)性率比較，經(jīng)Fisher 確切概率法檢驗(yàn)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明血漿可替代PBMC 進(jìn)行VZV DNA 的檢測(cè)。PBMC、血漿標(biāo)本治療前與治療后VZV DNA 陽(yáng)性率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明伐昔洛韋抗病毒治療方案未降低VZV DNA 水平。見(jiàn)表1。

3 討論

VZV 屬于人類(lèi)皰疹病毒3 型，其DNA 相對(duì)分子質(zhì)量大小約為12 000 bp。目前普遍使用qPCR 進(jìn)行VZV DNA 的定量檢測(cè)，qPCR 操作簡(jiǎn)便，敏感性和特異性高，其標(biāo)準(zhǔn)品可為質(zhì)粒和純化的DNA[10]。DWORKIN 等[11]在 進(jìn) 行VZV DNA 的qPCR 檢 測(cè) 時(shí)，使用SYBR Green Ⅰ作為染料，選用VZV DNA 的保守區(qū)域ORF59 設(shè)計(jì)特異性引物，并采用純化的病原體作為標(biāo)準(zhǔn)品。本實(shí)驗(yàn)中qPCR 所用的染料和引物均與之相同，但獨(dú)創(chuàng)之處在于筆者使用巢式PCR制備標(biāo)準(zhǔn)品，并通過(guò)凝膠電泳及基因序列比對(duì)，驗(yàn)證了所得DNA片段的純度和特異性。而質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，制作工藝復(fù)雜且成本較高，所以本研究選取上述DNA 片段作為標(biāo)準(zhǔn)品[12]。另外，帶狀皰疹患者VZV DNA 檢測(cè)結(jié)果表明，PBMC 與血漿標(biāo)本的陽(yáng)性檢出率無(wú)差異，鑒于血漿的獲取更加便捷，所以臨床或許可以采用血漿代替PBMC。國(guó)外的研究表明，血液中大約39% VZV DNA 存在于血液細(xì)胞外成份中，這也是血漿能夠用于檢測(cè)VZV DNA 的理論依據(jù)之一[13]。

國(guó)外有研究表明，帶狀皰疹患者留取皮膚病變、PBMC 和血漿標(biāo)本進(jìn)行VZV 檢測(cè)，所有患者檢測(cè)陽(yáng)性[14]。本研究從帶狀皰疹患者皮膚病變中獲得標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行qPCR，從PBMC 和血漿中檢測(cè)VZV DNA 效果良好，且抗病毒治療前后PBMC 和血漿標(biāo)本中VZV DNZ的陽(yáng)性檢出率未顯著下降，通過(guò)Taqman 探針?lè)ㄒ驳贸隽讼嗤Y(jié)果，這或許與抗病毒治療時(shí)間和隨訪(fǎng)時(shí)間較短有關(guān)[9]。筆者下一步研究將擴(kuò)大樣本量、延長(zhǎng)抗病毒治療時(shí)間和隨訪(fǎng)時(shí)間，以觀察VZV DNZ 的陽(yáng)性檢出率變化。

目前臨床對(duì)于帶狀皰疹的抗病毒治療往往需要等到皰疹出現(xiàn)并確診帶狀皰疹后才開(kāi)始進(jìn)行，而皰疹的出現(xiàn)標(biāo)志著帶狀皰疹病程已進(jìn)入中后期，故難以實(shí)現(xiàn)抗病毒療效的最大化。最近研究表明，若帶狀皰疹患者出現(xiàn)發(fā)熱、疲勞不適等全身癥狀，則提示病毒血癥，結(jié)合血液病毒檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果，即具備抗病毒治療指征[15]。帶狀皰疹合并病毒血癥，容易導(dǎo)致帶狀皰疹患者預(yù)后不良，且外周血VZV 病毒載量與帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛發(fā)生率呈正相關(guān)[16]。帶狀皰疹患者合并病毒血癥的早期抗病毒治療有助于縮短病變愈合時(shí)間；帶狀皰疹患者發(fā)病72 h 內(nèi)實(shí)施抗病毒治療，能夠?qū)崿F(xiàn)療效的最大化，顯著降低外周血VZV DNA 水平，并有助于緩解帶狀皰疹相關(guān)性疼痛[14]。

值得注意的是，帶狀皰疹患者唾液中VZV DNA的拷貝數(shù)和帶狀皰疹相關(guān)性疼痛亦存在關(guān)聯(lián)[13，17]。通過(guò)接觸帶狀皰疹患者的唾液及呼吸道分泌物，非免疫人群可感染VZV 并發(fā)生帶狀皰疹[18]，故帶狀皰疹患者咽拭子或唾液中VZV DNA 的分布情況和診斷價(jià)值，以及帶狀皰疹發(fā)病72 h 內(nèi)抗病毒治療降低唾液等分泌物中VZV DNA 的效果等尚需要進(jìn)一步研究。另外，對(duì)于患有水痘且合并病毒血癥的孕婦，VZV 可透過(guò)胎盤(pán)屏障并對(duì)胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育造成不良影響[19]。下一步筆者將研究帶狀皰疹孕婦患者合并病毒血癥對(duì)胎兒的影響，并探索咽拭子和唾液標(biāo)本對(duì)帶狀皰疹的診斷價(jià)值等，以深入了解帶狀皰疹的致病性和傳染性。