車宇，梁靜，楊怡萍，廖娟，王蒨，蔡英全，邵帥

（陜西省腫瘤醫(yī)院 放療科，陜西 西安 710061）

近年來，我國胃癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1]。胃癌早期多以燒心、腹脹不適及體重下降等亞臨床表現(xiàn)為主，許多患者就診時其胃癌已屬臨床晚期，失去了行根治性手術(shù)的機會。研究抑制胃癌生長的分子指標(biāo)對提高胃癌患者手術(shù)切除率及改善患者長期預(yù)后具有重要作用。

MicroRNA 是單鏈的長度較短的RNA，通常其堿基數(shù)量為18 ～25 bp[2]。已發(fā)現(xiàn)許多與胃癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移及腫瘤血管新生密切相關(guān)的microRNA[3-4]。microRNA-494（miR-494）是近年來新鑒定出的一種microRNA，在多種婦科腫瘤（包括子宮內(nèi)膜癌及卵巢癌）中的表達水平顯著下調(diào)[5-6]。目前，miR-494 在胃癌中的表達水平及生物學(xué)功能尚不可知。筆者擬通過檢測miR-494 在胃癌組織及胃癌細(xì)胞MGC803 中的表達，探究miR-494 對胃癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本

選取2015年1月—2018年1月被陜西省腫瘤醫(yī)院收治并行手術(shù)切除的60例患者的胃癌組織及對應(yīng)癌旁組織（距腫瘤邊緣＞2 cm）標(biāo)本。其中男性38例，女性22例；年齡37 ～68 歲，中位年齡53 歲。

1.2 細(xì)胞來源及主要試劑

MGC803 細(xì)胞由陜西省腫瘤醫(yī)院放療科實驗室保存。microRNA mimics 模擬物（miR-494 及陰性對照）、引物（miR-494 及U6）購自廣州復(fù)能基因有限公司及廣州銳博生物科技有限公司，DMEM 培養(yǎng)基及胎牛血清購自美國Gibco 公司，Trizol、Lipofectamine?2000、SuperScript? One-Step RT-PCR System with Platinum? Taq DNA Polymerase 及DyNAmo Flash SYBR Green qPCR Kit 購自美國Invitrogen 公司，細(xì)胞周期蛋 白D1（CyclinD1） 抗 體（ab494175） 及β-actin抗體（ab8226）購自美國Abcam 公司，MTT 藥物、Annexin-V/PI 細(xì)胞周期及凋亡檢測試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司。

1.3 PCR

按Trizol 試劑說明書提取胃癌組織、癌旁組織及MGC803 細(xì)胞RNA，分別組建RT-PCR 及realtime PCR 反應(yīng)體系。RT-PCR 反應(yīng)條件：50℃逆轉(zhuǎn)錄30 min，94℃變性2 min，共1 個循環(huán)。real-time PCR反應(yīng)條件：94℃變性15 s，60℃退火30 s，68℃延伸3 min，共40 個循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸10 min。通過2-△△Ct法計算miR-494 及CyclinD1 mRNA 的相對表達量。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及mimics 轉(zhuǎn)染

培養(yǎng)MGC803 細(xì)胞至穩(wěn)定傳代，將MGC803 細(xì)胞以合適密度接種于6 孔板中，過夜培養(yǎng)后洗滌細(xì)胞。根據(jù)mimics 轉(zhuǎn)染分為miR-494 組和對照組。miR-494組每孔加入100 pmol miR-494 mimics、2 ml 含血清DMEM 及5μl 轉(zhuǎn)染試劑；對照組每孔加入100 pmol陰性對照mimics、2 ml 含血清DMEM 及5μl 轉(zhuǎn)染試劑。轉(zhuǎn)染24 h 后進行后續(xù)實驗。

1.5 MTT 法

將MGC803 細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h 后按2×104個/孔的密度接種于96 孔板，每個時間點設(shè)置6個平行對照。培養(yǎng)過夜后加入MTT 溶液，再次避光培養(yǎng)4 h。吸凈上清液后每孔用150μl DMSO 溶液溶解MTT結(jié)晶。讀取酶標(biāo)儀490 nm 處的光密度（optical density,OD）值。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)

通過流式細(xì)胞儀檢測過表達miR-494 對MGC803 細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響。將轉(zhuǎn)染72 h后的MGC803 細(xì)胞用冷PBS 洗2 次，胰酶消化后以800 r/min 離心5 min，獲取細(xì)胞沉淀，用PBS 緩沖液重懸細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度為5×106個/ml，取100μl細(xì)胞懸液與10μl 碘化丙啶（PI）溶液混合上機檢測細(xì)胞周期；取100μl 細(xì)胞懸液與5μl 及10μl PI 溶液混合上機檢測細(xì)胞凋亡。

1.7 Western blotting

采用放射免疫沉淀法提取細(xì)胞總蛋白，SDSPAGE 膠電泳分離蛋白，70 V 濕轉(zhuǎn)120 min 轉(zhuǎn)印目標(biāo)蛋白至PVDF 膜上，室溫封閉2 h 后將目標(biāo)條帶分別置入CyclinD1 和β-actin 一抗溶液中，在4℃下孵育過夜，用1∶5 000 稀釋的HRP 標(biāo)記二抗，在室溫中孵育目標(biāo)條帶1 h。采用ECL 法顯影，計算蛋白相對表達量。

1.8 免疫組織化學(xué)法

將甲醛固定、石蠟包埋的組織切片常規(guī)脫蠟、水化及微波抗原修復(fù)，分別用3%過氧化氫及10%山羊血清封閉切片。用PBS 溶液按1∶100 配制CyclinD1一抗工作液，覆蓋組織切片，4℃搖晃、孵育過夜。PBS 溶液洗凈未結(jié)合一抗后，使用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗結(jié)合相應(yīng)一抗，用DAB 法顯示陽性蛋白。計算染色得分：無陽性染色細(xì)胞計0 分，＜25%計1 分，25%～＜50%計2 分，50%～＜75%計3 分，≥75%計4 分[7]。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗或重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，相關(guān)性分析用Pearson 法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌與癌旁組織miR-494 相對表達量比較

癌旁組織miR-494 相對表達量為（1.327±0.052），胃癌組織為（0.921±0.048），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.421，P=0.000），癌旁組織較胃癌組織高。不同腫瘤直徑、TNM 分期患者的miR-494 相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）不同性別、年齡，及是否吸煙、幽門螺桿菌感染、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的miR-494相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 不同臨床病理特征患者的miR-494 相對表達量比較（n =60，±s）

表1 不同臨床病理特征患者的miR-494 相對表達量比較（n =60，±s）

臨床病理特征 miR-494 t 值 P 值性別男0.871±0.037 1.295 0.062女0.931±0.065年齡≤60 歲 0.935±0.026 1.167 0.087＞60 歲 0.881±0.038吸煙是0.904±0.049 0.856 0.105否0.936±0.028幽門螺桿菌感染是0.933±0.019 0.738 0.211否0.909±0.024腫瘤直徑≤3 cm 0.975±0.031 1.844 0.041＞3 cm 0.722±0.046淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是0.884±0.055 1.660 0.059否0.939±0.032 TNM 分期Ⅰ、Ⅱ期 0.949±0.027 1.969 0.028Ⅲ、Ⅳ期 0.836±0.059

2.2 miR-494 對MGC803 細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期進展及凋亡的影響

對照組MGC803 細(xì)胞miR-494 相對表達量為（1.00±0.00），miR-494 組 為（11.23±3.87），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=8.031，P=0.000），對照組較miR-494 組低（見圖1），表明慢病毒感染促進MGC803 細(xì)胞miR-494 的表達。兩組轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h 的OD 值比較，經(jīng)重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果如下：①不同時間點的OD 值比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=15.762，P=0.016）；②兩組的OD值比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=67.896，P=0.008），miR-494 組較對照組低，細(xì)胞活力較低；③兩組的OD 值變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=19.214，P=0.013）（見表2和圖2）。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，對照組G0/G1期比例為（40.33±4.23）%，miR-494 組為（78.19±6.48）%，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.721，P=0.023）（見圖3）；對照組細(xì)胞凋亡比例為（11.28±3.05）%，miR-494 組為（13.45±2.16）%，經(jīng)t檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.034，P=0.063）（見圖4）。

圖1 兩組miR-494 相對表達量比較 （±s）

表2 兩組不同時間點OD 值比較 （±s）

表2 兩組不同時間點OD 值比較 （±s）

組別 24 h 48 h 72 h對照組 0.176±0.011 0.463±0.031 0.814±0.032 miR-494 組 0.131±0.009 0.296±0.017 0.544±0.034

圖2 兩組不同時間點OD 值變化趨勢 （±s）

圖3 兩組G0/G1 期細(xì)胞的流式細(xì)胞圖

圖4 兩組凋亡細(xì)胞的流式細(xì)胞圖

2.3 miR-494 對MGC803 細(xì)胞中CyclinD1 表達的影響

對照組CyclinD1 mRNA 相對表達量為（1.00±0.00），miR-494 組為（0.41±0.13），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.031，P=0.011），對照組較miR-494 組高（見圖5），表明過表達miR-494 抑制CyclinD1 mRNA 的表達。對照組CyclinD1 蛋白相對表達量為（0.68±0.13），miR-494 組為（0.27±0.09），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.106，P=0.042），對照組較miR-494 組高（見圖6），表明過表達miR-494 下調(diào)CyclinD1 蛋白的表達。

圖5 兩組CyclinD1 mRNA 相對表達量比較 （±s）

圖6 兩組CyclinD1 蛋白相對表達量比較 （±s）

2.4 miR-494 與CyclinD1 的相關(guān)性

miR-494 與CyclinD1 免疫組織化學(xué)評分呈負(fù)相關(guān)（r=-0.469，P=0.009）。見圖7。

圖7 miR-494 與CyclinD1 免疫組織化學(xué)評分的相關(guān)性散點圖

3 討論

miR-494 首先被發(fā)現(xiàn)于人類視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中，其在人類許多良惡性疾病中扮演重要角色。例如，抑制動脈粥樣硬化小鼠體內(nèi)miR-494 的表達水平能夠提高斑塊的穩(wěn)定性[8]；高血清miR-494 水平與子宮內(nèi)膜異位癥患者并發(fā)不孕關(guān)系密切[9]；低表達miR-494的乳腺癌患者預(yù)后不良[10]。但其在胃癌的表達及生物學(xué)功能尚未完全清楚。

本研究結(jié)果提示miR-494 在胃癌中扮演潛在抑癌角色，miR-494 能夠顯著抑制體外培養(yǎng)MGC803 細(xì)胞的增殖，阻礙細(xì)胞周期的進展。但是其對細(xì)胞凋亡的發(fā)生并無顯著影響。除此之外，筆者通過文獻查詢也發(fā)現(xiàn)，miR-494 對結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移及肺癌耐藥也具有調(diào)控作用[11-12]，說明miR-494 具有多樣性的抗腫瘤作用，值得進一步深入研究。

MicroRNA 能夠通過結(jié)合靶基因3’-UTR 區(qū)而發(fā)揮負(fù)向調(diào)控作用。結(jié)合上述功能學(xué)實驗結(jié)果及生物信息學(xué)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞周期蛋白CyclinD1 mRNA存在于miR-494 的結(jié)合位點，可能是miR-494 的潛在靶點之一。進一步實驗發(fā)現(xiàn)，過表達miR-494 能下調(diào)CyclinD1 的表達，且在組織水平上，miR-494與CyclinD1 的表達呈負(fù)相關(guān)。CyclinD1 是調(diào)控細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的主要生物因子[13]。有研究指出，CyclinD1 的異常高表達與胃癌的進展密切相關(guān)[13]。因此，下調(diào)CyclinD1 的表達可能是miR-494 抑制胃癌細(xì)胞的關(guān)鍵機制之一。