遲文靜， 劉宜昕， 王 粟， 劉 濤， 趙 虎， 張艷梅

（復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200040）

分子系統(tǒng)發(fā)育學(xué)是利用分子特征研究生物體之間進(jìn)化關(guān)系的學(xué)科，在揭示生物進(jìn)化途徑、研究生物多樣性和分子流行病學(xué)特征、鑒定菌種和基因功能等方面發(fā)揮重要作用[1]。早期微生物分子系統(tǒng)發(fā)育研究依賴于蛋白質(zhì)序列，其中應(yīng)用廣泛的蛋白質(zhì)序列有鐵氧還蛋白和細(xì)胞色素等。20世紀(jì)70年代中期，有學(xué)者開始使用16SrRNA的基因序列構(gòu)建進(jìn)化樹，以確定不同生物之間的進(jìn)化關(guān)系。目前，隨著高通量測序（next generation sequencing，NGS）等技術(shù)的應(yīng)用，大大降低了基因分析的成本，加快了基因分析的速度，為細(xì)菌進(jìn)化樹的構(gòu)建提供了更多類型的分析和展示形式[2]。本文對(duì)進(jìn)化樹及其在細(xì)菌親緣關(guān)系中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 進(jìn)化樹概述

1.1 進(jìn)化樹定義

進(jìn)化樹又稱系統(tǒng)發(fā)生樹，是描述生物體形成或進(jìn)化順序的拓?fù)錁浣Y(jié)構(gòu)，通常是二叉樹的形狀，一般由一系列節(jié)點(diǎn)和分支組成，節(jié)點(diǎn)代表某個(gè)具體序列，節(jié)點(diǎn)之間的連線代表物種之間的親緣關(guān)系[3]。構(gòu)建進(jìn)化樹不僅需要分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、生態(tài)學(xué)等生命科學(xué)學(xué)科知識(shí)，還需要統(tǒng)計(jì)學(xué)、計(jì)算機(jī)學(xué)等多個(gè)學(xué)科知識(shí)的融合[4]。微生物進(jìn)化樹的構(gòu)建過程主要有：序列數(shù)據(jù)的獲取、進(jìn)化距離模型的確定、多個(gè)序列的比對(duì)、對(duì)比后結(jié)果的提取以及算法和參數(shù)的選擇[5]。進(jìn)化樹可以分析未知細(xì)菌和已知細(xì)菌間的親緣關(guān)系[6]，在遺傳本質(zhì)上探究細(xì)菌多樣性的產(chǎn)生機(jī)制。

1.2 進(jìn)化樹的呈現(xiàn)方式

根據(jù)是否制定根節(jié)點(diǎn)，進(jìn)化樹可以分為有根樹和無根樹2種呈現(xiàn)方式[7]。有根樹制定了根節(jié)點(diǎn)，從樹中可以看出各節(jié)點(diǎn)之間的距離和各分支分化的先后關(guān)系。有根樹引入外群作為根節(jié)點(diǎn)，而外群通常選擇與研究序列關(guān)系密切的序列，且能很好地聚類；或者選擇比研究序列進(jìn)化歷史更早的序列，故有根樹可以看到不同細(xì)菌間關(guān)系的遠(yuǎn)近，還可以看到細(xì)菌的進(jìn)化順序和方向[8]。無根樹不引入外群，沒有根節(jié)點(diǎn)，只能看出個(gè)各個(gè)節(jié)點(diǎn)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和相對(duì)距離，因而無根樹功能單一，可以顯示不同細(xì)菌的聚類關(guān)系和相對(duì)距離的遠(yuǎn)近，卻無法顯示細(xì)菌的起源和進(jìn)化方向[9]。見圖1。

圖1 進(jìn)化樹的呈現(xiàn)方式

1.3 進(jìn)化模型

進(jìn)化模型是對(duì)微生物進(jìn)化變異進(jìn)行的數(shù)學(xué)描述，描述內(nèi)容主要有：基因的點(diǎn)突變、插入缺失，各堿基突變發(fā)生的概率及核苷酸組成頻率等和目標(biāo)菌株間的親緣關(guān)系，選擇和構(gòu)建合適的進(jìn)化模型是研究細(xì)菌進(jìn)化的前提[10]。生物進(jìn)化的研究按層次可分為宏進(jìn)化和微進(jìn)化。宏進(jìn)化是細(xì)菌間的進(jìn)化，主要指細(xì)菌不同目/科/屬/種的進(jìn)化[11]，微進(jìn)化是指細(xì)菌種內(nèi)或近緣菌種間的進(jìn)化[12]。以幽門螺桿菌為例，在其微進(jìn)化過程中，構(gòu)建幽門螺桿菌不同菌株間的進(jìn)化樹模型，不僅需要估計(jì)堿基點(diǎn)突變率，還需要估計(jì)重組率、核苷酸差異率及重組核苷酸片段長度等重要信息[13]。對(duì)于細(xì)菌的進(jìn)化分析，選擇合適的進(jìn)化模型才可能得到可靠的結(jié)果，反之可能得到不準(zhǔn)確甚至是錯(cuò)誤的結(jié)果，這種現(xiàn)象主要是由進(jìn)化樹不相同的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)或分支長度造成的，因此選擇合適的進(jìn)化模型、構(gòu)建正確的進(jìn)化樹至關(guān)重要。

1.4 進(jìn)化樹分析方法

1.4.1 距離矩陣法 距離矩陣法是一種以細(xì)菌核苷酸序列間的變異估計(jì)菌株間距離，并通過距離矩陣構(gòu)建進(jìn)化樹的方法。這種方法首先需要將輸入的核苷酸序列數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為距離信息，然后通過距離信息進(jìn)一步構(gòu)建進(jìn)化樹，主要分為系統(tǒng)樹法和網(wǎng)絡(luò)法[14]?？偟膩碚f，距離矩陣法是一種基于距離構(gòu)建進(jìn)化樹的方法，其優(yōu)點(diǎn)在于簡單、直觀、計(jì)算速度快，但在菌株間進(jìn)化速率差異較大的情況下，可能得到錯(cuò)誤的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)[15]。

1.4.2 最大簡約法 最大簡約法是一種將細(xì)菌的核苷酸序列位點(diǎn)視為形狀的方法，是一個(gè)比較所有可能的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的過程。最大簡約法首先篩選出對(duì)細(xì)菌進(jìn)化分析有用的核苷酸位點(diǎn)，然后統(tǒng)計(jì)每個(gè)位點(diǎn)的核苷酸最小替換數(shù)，進(jìn)而以各位點(diǎn)替代數(shù)總和最小的進(jìn)化樹作為最優(yōu)樹[16]。相對(duì)于距離矩陣法，最大簡約法對(duì)信息的利用度更高，而相對(duì)于極大似然法和后驗(yàn)概率法，該方法計(jì)算速度更快，可處理較多的插入、缺失序列。

1.4.3 極大似然法 極大似然法是利用進(jìn)化模型和核苷酸序列，通過進(jìn)化樹的分枝長度、拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、模型參數(shù)構(gòu)建進(jìn)化樹的方法。極大似然法通過選取合適的進(jìn)化模型分析核苷酸序列，得到似然率最大的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，再以其中最大似然率的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)構(gòu)建的進(jìn)化樹作為最優(yōu)樹，應(yīng)用極大似然法分析比較重要的問題時(shí)需要確定最合適的進(jìn)化模型[17]。一般在選擇合理、正確的進(jìn)化模型的情況下，極大似然法可以推導(dǎo)出很好的進(jìn)化樹結(jié)果，但與最大簡約法相比，極大似然法很難在序列長度較短的情況下得到正確的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。

1.4.4 后驗(yàn)概率法 后驗(yàn)概率法又被稱為貝葉斯推論法，該方法首先假定所有可能的進(jìn)化樹是等概率的，然后計(jì)算出比對(duì)后序列的進(jìn)化樹的后驗(yàn)概率，進(jìn)而將后驗(yàn)概率最大的進(jìn)化樹作為最優(yōu)樹[18]。后驗(yàn)概率法的優(yōu)點(diǎn)在于不但具有數(shù)學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)基礎(chǔ)，同時(shí)還可以處理復(fù)雜的、接近實(shí)際情況的進(jìn)化模型。與極大似然法相比，后驗(yàn)概率法同樣應(yīng)用廣泛，且可通過相同的數(shù)據(jù)信息，更低的計(jì)算量，得出與極大似然法一致的結(jié)論。與最大簡約法相比，后驗(yàn)概率法能夠考慮更多的進(jìn)化相關(guān)信息。

2 進(jìn)化樹的構(gòu)建

2.1 基于保守基因構(gòu)建進(jìn)化樹

2.1.1 基于核心基因組多位點(diǎn)序列分型（multilocussequence typing，MLST）構(gòu)建進(jìn)化樹 核心基因序列是重復(fù)且保守的核苷酸序列，在進(jìn)化過程中可能發(fā)生富集、選擇和遺傳[19]。細(xì)菌的核心基因序列之間可以通過直接接觸及質(zhì)粒、噬菌體或其他可移動(dòng)遺傳元件（整合子、轉(zhuǎn)座子和插入序列等）的方式進(jìn)行基因復(fù)制或基因交換，通過分析這些保守序列，可以分析不同細(xì)菌進(jìn)化的差異以及菌株間的親緣關(guān)系[20]。MLST是近年來發(fā)展迅速的分子生物學(xué)分析方法，具有較高的分辨能力，可以通過多個(gè)管家基因450 bp左右的基因序列比較菌株等位基因的多態(tài)性，不同菌株對(duì)應(yīng)不同的序列型，可以進(jìn)行菌株進(jìn)化和種群結(jié)構(gòu)的研究[21]。核心基因組MLST可以使用微生物數(shù)百甚至數(shù)千個(gè)保守的等位基因進(jìn)行基因分型，其分辨率遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的MLST[22]。隨著NGS技術(shù)的廣泛應(yīng)用，核心基因組MLST主要被應(yīng)用在分子流行病學(xué)分析領(lǐng)域，且在該領(lǐng)域快速發(fā)展，已有研究采用核心基因組MLST方法分析我國即食食品中單核細(xì)胞增生李斯特菌的分子流行病學(xué)特征，結(jié)果表明核心基因組MLST能將不同譜系、血清群和克隆群的菌株明顯分開，共分為24個(gè)亞群，與克隆群基本保持一致[23]?；谌蚪M測序的核心基因組MLST分辨能力強(qiáng)，可用于監(jiān)測暴發(fā)性食源性疾病。但核心基因組MLST仍有一定的局限性，如缺乏對(duì)關(guān)系非常密切的菌株的分辨能力，且可分析菌株的種類有限[24]。2011年，SAHL等[25]對(duì)大腸埃希菌的MLST研究結(jié)果顯示，全基因組序列進(jìn)化樹與MLST分型的結(jié)果并不一致。2014年，朱健銘等[26]對(duì)肺炎克雷伯菌進(jìn)行分析，結(jié)果表明采用單個(gè)核苷酸序列進(jìn)行細(xì)菌進(jìn)化分析及采用MLST進(jìn)行菌株親緣關(guān)系分析并不可靠，為了校正MLST的缺點(diǎn)，提高分辨率，他們采用管家基因和毒力基因聯(lián)合檢測的方法進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)根據(jù)核心基因組各位點(diǎn)序列圖譜構(gòu)建的進(jìn)化樹，與參與菌株相應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì)，既可以準(zhǔn)確地研究細(xì)菌遺傳進(jìn)化關(guān)系，又可以確定菌株的種屬，對(duì)分析細(xì)菌親緣關(guān)系意義重大。

2.1.2 基于非編碼保守基因構(gòu)建進(jìn)化樹 非編碼保守DNA序列（conserved noncoding DNA sequences，CNS）是指細(xì)菌基因組中轉(zhuǎn)錄RNA但不能翻譯蛋白質(zhì)或能調(diào)控其他基因的序列，是比較小的一段序列[27]。CNS在生物的進(jìn)化中具有加工修飾RNA、調(diào)控轉(zhuǎn)錄和DNA結(jié)構(gòu)等特殊的功能[28]。CNS不僅具有長度和頻率的物種特異性，還具有豐富性、廣闊性、保守性和功能性等特點(diǎn)，使其在微生物親緣關(guān)系的分析中極具潛力，如對(duì)耐輻射球菌與嗜熱菌親緣關(guān)系的分析[29]。但是如果要對(duì)CNS的功能進(jìn)行正確、全面的理解和分析，還需要通過大量的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行功能驗(yàn)證。

2.2 基于單核苷酸多態(tài)性（single nucleotidepolymorphism，SNP）構(gòu)建進(jìn)化樹

SNP是指基因組中的單個(gè)堿基的突變引起的DNA序列多態(tài)性，有數(shù)量多、多態(tài)性豐富、遺傳穩(wěn)定、易實(shí)現(xiàn)分析自動(dòng)化的特點(diǎn)[30]。單個(gè)堿基的變異可以由顛換或轉(zhuǎn)換引起，也可以由插入或缺失引起，這些SNP位點(diǎn)可能影響基因的功能，引起性狀的改變，甚至導(dǎo)致疾病的發(fā)生，因此SNP是遺傳變異的重要依據(jù)，被廣泛應(yīng)用于微生物的起源、進(jìn)化及遷移等方面的研究。有學(xué)者為了解外源基因轉(zhuǎn)化沙漠寡營養(yǎng)細(xì)菌的進(jìn)化與變異，通過生物學(xué)信息繪制了細(xì)菌的SNP系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明SNP數(shù)量最多的菌株進(jìn)化速度最快[31]。SNP分析不僅提供了研究和理解基因突變的新方法，還能為微生物的鑒定及親緣關(guān)系分析提供依據(jù)。

2.3 基于基因拷貝數(shù)構(gòu)建進(jìn)化樹

基因拷貝數(shù)是某種基因或某段特定DNA序列在基因組中出現(xiàn)的數(shù)目，多拷貝基因廣泛存在于細(xì)菌中，而且多是可以移動(dòng)的基因序列，分析基因拷貝數(shù)變異（jcopy number variation，CNV）是研究微生物進(jìn)化、變異以及致病性的基礎(chǔ)[32]。CNV是基因組中的多核苷酸突變，是一種重要的遺傳變異，與研究較多的SNP相比，CNV涉及更多的堿基，覆蓋更大范圍的基因序列，在基因突變與細(xì)菌進(jìn)化的研究上逐漸成為熱點(diǎn)和重點(diǎn)[30]。目前，全基因組CNV檢測的方法主要有芯片法和NGS技術(shù)等。全基因組CNV圖譜和更精確的參考基因組必將引領(lǐng)微生物基因組學(xué)研究熱潮，并進(jìn)一步提高在全基因組范圍內(nèi)探測基因組變異的準(zhǔn)確性，對(duì)微生物親緣關(guān)系的分析有重大的指導(dǎo)意義。

3 基于其他特征基因構(gòu)建進(jìn)化樹

3.1 基于致病島構(gòu)建進(jìn)化樹

致病島又被稱為毒力島、適應(yīng)島、生態(tài)島或共生島，是細(xì)菌基因組中可以編碼毒力因子的序列，與細(xì)菌的致病性密切相關(guān)，能夠在菌株間通過基因組水平轉(zhuǎn)移，可以使細(xì)菌在短期內(nèi)發(fā)生形狀的改變，甚至產(chǎn)生新的變種，這種演變有助于細(xì)菌不斷適應(yīng)環(huán)境[33]。很多病原菌都有致病島，如產(chǎn)腸毒素葡萄球菌、幽門螺桿菌、大腸埃希菌、沙門菌等[34-35]?；谥虏u構(gòu)建進(jìn)化樹有助于理解細(xì)菌的進(jìn)化和遷徙。有學(xué)者[36]研究了基于幽門螺桿菌CagPAI和Cag A基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，驗(yàn)證了拉丁美洲菌株的分群和聚類特點(diǎn)，以及與之相關(guān)的人群背景。隨著微生物耐藥性的增強(qiáng)和新型病原體的出現(xiàn)，鑒定致病菌也越來越重要。鑒定病原體的毒力基因并了解其從非致病性向致病性的進(jìn)化，對(duì)于基礎(chǔ)科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究都是一種挑戰(zhàn)。

3.2 基于規(guī)律成簇間隔的短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）構(gòu)建進(jìn)化樹

CRISPR在細(xì)菌基因組中由不連續(xù)的同向重復(fù)序列和插入其中的間隔序列組成，有針對(duì)噬菌體或質(zhì)粒等外源基因的獲得性免疫作用，在細(xì)菌進(jìn)化過程中保持結(jié)構(gòu)的高度可變，CRISPR位點(diǎn)是研究細(xì)菌分型與進(jìn)化的關(guān)鍵位點(diǎn)[37]。CRISPR通常由同向重復(fù)序列、間隔序列、前導(dǎo)序列以及CRISPR相關(guān)蛋白組成。cas基因與重復(fù)序列相互關(guān)聯(lián)，可使細(xì)菌協(xié)同進(jìn)化[38]。CRISPR位點(diǎn)會(huì)隨著細(xì)菌的進(jìn)化不斷出現(xiàn)新間隔序列的插入以及舊間隔序列的丟失，這種現(xiàn)象是導(dǎo)致細(xì)菌基因組進(jìn)化速度快的重要原因之一，因此CRISPR位點(diǎn)具有很復(fù)雜的多態(tài)性[39]。CRISPR位點(diǎn)在細(xì)菌中的多態(tài)性不僅能夠反映細(xì)菌與環(huán)境相互作用的關(guān)系，還能夠記錄細(xì)菌在進(jìn)化過程中的生態(tài)學(xué)和地理學(xué)信息，如根據(jù)CRISPR位點(diǎn)的間隔序列在沙門菌中排列的差異，可以判斷不同菌株間的親緣關(guān)系，并進(jìn)行溯源分析；根據(jù)醋酸菌的重復(fù)序列構(gòu)建進(jìn)化樹，可將不同屬的菌種進(jìn)行分類[40]。有研究應(yīng)用CRISPR序列分型分析病原體的暴發(fā)流行，如鼠疫耶爾森菌和腸炎沙門菌亞種的分群[40-41]。此外，CRISPR還可以提供與微生物表型相關(guān)的重要信息，如腸球菌耐藥基因序列和化膿性鏈球菌基因組中的前噬菌體等，這些信息都反映了CRISPR在調(diào)控基因水平轉(zhuǎn)移、細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境及細(xì)菌進(jìn)化中的作用[42]。因此，應(yīng)用CRISPR構(gòu)建進(jìn)化樹分析細(xì)菌親緣關(guān)系的優(yōu)點(diǎn)在于：基因分型分辨率較高、操作簡單、重復(fù)性好、結(jié)果數(shù)字化、便于不同實(shí)驗(yàn)室結(jié)果的比對(duì)等[43]。但目前仍然存在一些需要解決的問題，如數(shù)據(jù)不夠充分、數(shù)據(jù)庫不夠健全、細(xì)菌之間的分型標(biāo)準(zhǔn)不夠完善等，在未來，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化的CRISPR數(shù)據(jù)庫具有十分重要的意義。

4 總結(jié)和展望

基因分析技術(shù)的飛速發(fā)展促進(jìn)了生物學(xué)諸多領(lǐng)域的發(fā)展，對(duì)認(rèn)識(shí)細(xì)菌基因組與進(jìn)化的關(guān)系有深遠(yuǎn)的影響。細(xì)菌基因組具有多樣性和規(guī)律性特征，面對(duì)海量的基因組信息，挖掘有效信息，構(gòu)建合適的進(jìn)化樹是十分重要的。有效地構(gòu)建進(jìn)化樹應(yīng)該具備2個(gè)條件：首先，必須基于一種合適的進(jìn)化方式，能反映或解釋進(jìn)化事件；其次，應(yīng)該覆蓋更多的基因組信息[44]。為更好地鑒定細(xì)菌類型以及明確不同菌群之間的親緣關(guān)系，結(jié)合不同基因組序列構(gòu)建細(xì)菌進(jìn)化樹，將有效幫助解決細(xì)菌進(jìn)化中許多懸而未決的問題[45]。

本文簡述了目前常見的用于構(gòu)建細(xì)菌進(jìn)化樹的方法，但是可以用來進(jìn)行細(xì)菌親緣關(guān)系分析而構(gòu)建進(jìn)化樹的方法不限于文中所述，挖掘更多有價(jià)值的基因標(biāo)志物將是很有前景的研究，也是探究細(xì)菌進(jìn)化史的必由之路。