程華怡，施 巍

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院，上海 200011)

腦膠質(zhì)瘤是最常見的中樞系統(tǒng)原發(fā)腫瘤，我國腦膠質(zhì)瘤患者約占顱內(nèi)腫瘤患者的35%以上，年發(fā)病率為5～8人/10萬人，在原發(fā)性腦腫瘤中處于較高水平[1].腦膠質(zhì)瘤高發(fā)于40～55歲的中年人群，該群體是社會的中堅和家庭支柱，因此，給家庭和社會帶來嚴(yán)重影響[2].盡管腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病率在全身性腫瘤中所占比例不高，但具有治療難度大，復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、致死率高的特點[3].目前，臨床治療腦膠質(zhì)瘤以手術(shù)聯(lián)合放化療為主，但療效并不理想[4].近年來，隨著生命科學(xué)的快速發(fā)展，開始從基因和分子通路水平探討腫瘤的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，應(yīng)用靶向治療、免疫治療等手段改善腫瘤患者的預(yù)后水平[5].細(xì)胞周期蛋白E1(Cyclin E1)是CCNE1編碼的一種核蛋白，以循環(huán)式表達(dá)存在于細(xì)胞周期中并發(fā)揮重要的調(diào)控作用[6].相關(guān)研究[7]顯示：肺癌、胃癌、乳腺癌等多種腫瘤組織和細(xì)胞中均存在Cyclin E1表達(dá)，并介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和耐藥性的產(chǎn)生.Cyclin E1高表達(dá)能夠促進(jìn)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和遷移，但作用強(qiáng)度和分子機(jī)制仍未完全闡明.有研究[8]顯示：人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，Cyclin E1表達(dá)上調(diào)對細(xì)胞增殖、遷移能力的促進(jìn)作用無統(tǒng)計學(xué)差異.但亦有研究[9]顯示：Cyclin E1表達(dá)上調(diào)能夠明顯促進(jìn)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力.PI3K/Akt信號通路在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移中均發(fā)揮重要作用[10]；有研究[11]發(fā)現(xiàn)：Cyclin D1可通過影響PI3K/Akt信號通路表達(dá)來調(diào)控腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和遷移，但關(guān)于Cyclin E1表達(dá)對PI3K/Akt信號通路的影響仍未明確.本研究通過體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)上調(diào)人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中Cyclin E1表達(dá)，探討其對細(xì)胞增殖、遷移的影響.

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞(通派(上海)生物科技有限公司)；胎牛血清、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基(廣州嘉勝康生物科技有限公司)；pEGFP-Timp1-Cyclin E1人源基因質(zhì)粒、pEGFP-Timp1空載體質(zhì)粒(上海欽誠生物科技有限公司)；鼠抗人Cyclin E1單克隆抗體、兔抗人p-PI3K、p-Akt單克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(北京信諾金達(dá)生物科技有限公司)；Trizol總RNA提取試劑盒、CCK-8試劑盒、SYBR Green PCR Kit(200)試劑盒(上海宇淳生物科技有限公司)；Transwell 趨化小室(北京優(yōu)尼康生物科技有限公司).

1.2 方 法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%)傳代，收集對數(shù)期細(xì)胞用于實驗.將人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞分為空白對照組、陰性對照組、Cyclin E1轉(zhuǎn)染組，空白對照組U251細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，陰性對照組U251細(xì)胞轉(zhuǎn)染pEGFP-Timp1空載體質(zhì)粒，Cyclin E1轉(zhuǎn)染組U251細(xì)胞轉(zhuǎn)染pEGFP-Timp1-Cyclin E1質(zhì)粒，37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育48 h后，在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況，激發(fā)片波長460～550 nm，發(fā)射片波長590 nm.

1.2.2 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力

將對數(shù)期U251細(xì)胞的密度調(diào)至1×106/mL，向96孔板中接種1 500個/孔細(xì)胞；設(shè)置5組，每組設(shè)置3個復(fù)孔，置入37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，繼續(xù)培養(yǎng)96 h；并于12、24、48、72、96 h 5個時間點取出培養(yǎng)板，向相應(yīng)分組的培養(yǎng)孔中加入10 μL CCK-8試劑；應(yīng)用酶標(biāo)儀測定490 nm處的吸光度值.

1.2.3 Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移能力

24孔板中放入孔徑8 μm的Transwell 趨化小室，取對數(shù)期U251細(xì)胞，消化、重懸、計數(shù)后向Transwell 趨化小室加入6×105個細(xì)胞以及無血清的DMEM培養(yǎng)基300 μL；向下室中加入含血清的DMEM培養(yǎng)基500 μL，37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育48 h；取出Transwell 趨化小室，多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染色后，在光學(xué)顯微鏡視野下計數(shù)遷移細(xì)胞數(shù).重復(fù)上述操作5次，取平均值.

1.2.4 RT-PCR檢測Cyclin E1 mRNA表達(dá)情況

應(yīng)用Trizol總RNA提取試劑盒收集3組U251細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA.應(yīng)用SYBR Green PCR Kit(200)試劑盒測定Cyclin E1 mRNA水平，反應(yīng)體系30 μL，操作按試劑盒說明書進(jìn)行；反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min預(yù)變性，95 ℃ 2 min，60 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s，共30個循環(huán).引物序列由上海同進(jìn)基因科技有限公司設(shè)計合成，Cyclin E1上游引物：5′-AAAGTCCCCTCTTTAAACCGC-3′；下游引物：5′-CTTGTAAC GGGTCGTGATGCC-3′；內(nèi)參β-actin上游引物：5′-GCAACTGAGGCTGGAAGT GG-3′；下游引物：5′-CCATGTAGGTACTGTTGAAAC-3′.應(yīng)用2-ΔΔCT法定量分析Cyclin E1 mRNA相對表達(dá)量.

1.2.5 Western blot檢測Cyclin E1、p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)情況

應(yīng)用RIPA裂解液提取3組U251細(xì)胞總蛋白，BCA法蛋白定量，行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳；將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF，5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，滴加鼠抗人Cyclin E1單克隆抗體(1∶200稀釋)，兔抗人p-PI3K單克隆抗體(1∶500稀釋)，兔抗人p-Akt單克隆抗體(1∶500稀釋)，鼠抗人β-actin單克隆抗體(1∶1 000稀釋)，4 ℃過夜；次日滴加HRP標(biāo)記的二抗(1∶2 000稀釋)，室溫靜置2 h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，暗室顯影；應(yīng)用Image J軟件分析各條帶灰度值.

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞株的鑒定

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后，熒光顯微鏡下觀察顯示：陰性對照組和Cyclin E1轉(zhuǎn)染組的人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞質(zhì)中均可見綠色熒光，空白對照組中無熒光.此結(jié)果說明pEGFP-Timp1空載體質(zhì)粒、pEGFP-Timp1-Cyclin E1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞株構(gòu)建成功，其中，pEGFP-Timp1-Cyclin E1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞株熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于pEGFP-Timp1空載體質(zhì)粒.見圖1.

2.2 各組U251細(xì)胞中Cyclin E1 mRNA和蛋白表達(dá)水平

Cyclin E1 mRNA和蛋白表達(dá)水平在3組間比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，其中，Cyclin E1轉(zhuǎn)染組Cyclin E1 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯高于陰性對照組和空白對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01).陰性對照組與空白對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05).見表1.

表1 各組U251細(xì)胞中Cyclin E1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平

2.3 各組U251細(xì)胞增殖情況

應(yīng)用酶標(biāo)儀測定490 nm處的OD值，U251細(xì)胞培養(yǎng)12、24 h時，細(xì)胞增殖水平在3組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05).培養(yǎng)48、72、96 h時，與陰性對照組和空白對照組比較，U251細(xì)胞增殖水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05).陰性對照組與空白對照組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05).見表2.

表2 各組U251細(xì)胞增殖情況Tab.2 U251 cell proliferation in each group

2.4 各組U251細(xì)胞遷移能力

Cyclin E1轉(zhuǎn)染組的遷移細(xì)胞數(shù)為(528.05±51.83)個，明顯多于陰性對照組(131.73±35.09)個、空白對照組(129.58±32.14)個，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=28.391、28.804，均P<0.01)，每組均設(shè)置5個平行對照.見圖2.

2.5 Cyclin E1過表達(dá)對PI3K/Akt信號通路的影響

Western blot法檢測蛋白表達(dá)水平結(jié)果顯示：Cyclin E1轉(zhuǎn)染組p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)水平明顯高于陰性對照組和空白對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；陰性對照組與空白對照組p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05).見圖3、表3.

表3 各組U251細(xì)胞中p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)水平Tab.3 p-PI3K and p-Akt protein expression levels in U251 cells of each group

3 討 論

高級別腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有很強(qiáng)的增殖、遷移和侵襲能力，是患者死亡的主要原因[12].腦膠質(zhì)瘤的治療方法主要包括手術(shù)、放化療、基因治療等，其中，手術(shù)聯(lián)合放化療的方案雖然不斷革新，但在延長患者生存時間方面作用還不夠理想，因此，放化療聯(lián)合基因治療已成為目前研究的熱點[13].探討人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移的分子調(diào)控機(jī)制，對研發(fā)新的基因治療方案、提升療效、降低患者死亡率具有重要意義.近年來的研究[14]發(fā)現(xiàn)：多種非編碼RNA能夠在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤組織的血管生成，參與疾病的發(fā)生與發(fā)展.其中，Cyclin D1作為細(xì)胞周期正調(diào)控因子，具有促進(jìn)乳腺癌、結(jié)直腸癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌等惡性腫瘤的增殖、遷移能力[15].基于該作用靶點設(shè)計的治療藥物在臨床實驗中取得了較好的效果[16].Cyclin E1與Cyclin D1同屬于細(xì)胞周期蛋白家族，但目前關(guān)于Cyclin E1表達(dá)對人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞影響的研究仍較為少見.有研究[17]顯示：Cyclin E1是非編碼RNA轉(zhuǎn)錄后的主要調(diào)節(jié)因子，能夠加速大鼠體內(nèi)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，縮短生存時間.Cyclin E1能夠與RNA結(jié)合蛋白相互作用，抑制經(jīng)靶基因活化的應(yīng)激顆粒生成，降低癌細(xì)胞對放療和化療的敏感性[18].

細(xì)胞周期調(diào)節(jié)機(jī)制異常會導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂，細(xì)胞的增殖速率與人體需求不一致[19].有研究[20]發(fā)現(xiàn)：在頭頸部腫瘤、惡性皮膚腫瘤等組織中Cyclin E1蛋白表達(dá)明顯升高，同時在肝癌、肺癌、乳腺癌等惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)Cyclin E1蛋白過度表達(dá)[21]，推測Cyclin E1與人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和遷移存在相關(guān)性.本實驗通過pEGFP-Timp1-Cyclin E1質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，上調(diào)細(xì)胞中Cyclin E1 mRNA和蛋白表達(dá)水平，并探討對細(xì)胞增殖、遷移能力以及PI3K/Akt信號通路的影響.結(jié)果顯示：Cyclin E1表達(dá)上調(diào)能夠明顯增強(qiáng)人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的增殖和遷移能力，促進(jìn)人腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生與發(fā)展.相關(guān)研究[22]顯示：Cyclin E1能夠與CDK相互結(jié)合，形成異二聚體，介導(dǎo)人體多種生理過程.結(jié)合本研究結(jié)果可推測，Cyclin E1可能作為一種原癌基因或癌相關(guān)基因參與人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期調(diào)控.PI3K/Akt信號通路可被多種細(xì)胞毒素或刺激物激活，參與細(xì)胞生長、運動、糖原代謝等基本生理進(jìn)程的調(diào)控.有研究[23]發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt信號通路異常會引發(fā)2型糖尿病、心血管疾病、惡性腫瘤等多種疾病.在惡性腫瘤中已發(fā)現(xiàn)兩處能夠增強(qiáng)PI3K內(nèi)在激酶活性的突變，Akt的活化突變也有相關(guān)研究報道[24].由于Akt信號傳導(dǎo)異常所致的人體疾病發(fā)生率很高，已成為目前研究的熱點之一.本研究中Cyclin E1轉(zhuǎn)染組p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)水平明顯高于陰性對照組和空白對照組，提示Cyclin E1表達(dá)上調(diào)可能是通過激活PI3K/Akt信號通路來促進(jìn)人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的增殖和遷移，具體分子調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究.