牛小云，孫曉梅，陳東升，張守攻

(1. 中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所國家林業(yè)和草原局林木培育重點實驗室，北京 100091；2. 河北農(nóng)業(yè)大學園林與旅游學院，河北保定071000)

落葉松是我國北方重要的速生用材林樹種，大面積種植落葉松人工純林存在潛在的地力衰退[1-4]，尤其是在中齡林與近熟林階段[1，5]。落葉松凋落物積累與分解的不平衡是導致地力衰退以及土壤酸化的主要原因[1，3-4]，落葉松人工林每年以凋落物形式歸還的養(yǎng)分占其年吸收量的61.4%，而從凋落物轉(zhuǎn)移至土壤中的養(yǎng)分僅占養(yǎng)分歸還量的36.0%，占林地凋落物層元素積累量的4.9%。微生物在枯落物分解過程中發(fā)揮著重要作用[6]，是土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和循環(huán)的主要驅(qū)動力[7-8]，微生物對三江平原濕地枯落物分解的貢獻量可高達52%～78%[9]。微生物的種類和數(shù)量影響枯落物的分解速率[10-11]，而枯落物的質(zhì)量對微生物的生物量、多樣性也有重要影響[12-13]，尤其是真菌群落[12]，這進一步影響了枯落物的分解速率。伴隨日本落葉松林分發(fā)育以及撫育管理，林分郁閉度與林下植被發(fā)生變化[5]，這將如何影響枯落物的質(zhì)量以及微生物群落結(jié)構(gòu)，此方面的相關(guān)研究還較少，阻礙了對日本落葉松在中齡林與近熟林階段地力衰退機制的進一步探索。

本文以遼東山區(qū)日本落葉松人工林為研究對象，分析不同發(fā)育階段林分未分解層、半分解層以及全分解層枯落物中微生物群落結(jié)構(gòu)特征及其與枯落物理化性質(zhì)的相互作用關(guān)系，揭示日本落葉松在中齡林或近熟林階段地力衰退的微生物學作用機制，旨在為緩解日本落葉松地力衰退提出合理的經(jīng)營措施。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于遼寧省撫順市大孤家林場(125°48′41″E，52°45′21″N)，該區(qū)屬長白山系千山山脈龍崗支脈北坡，中溫帶季風氣候，年均氣溫 6 ℃，最低氣溫-30℃，最高氣溫34 ℃，全年無霜期128 d，年均降水量 650 mm。林地土壤為暗棕色森林土，土層厚 50 cm，pH 6.2～6.8，枯枝落葉層厚3.5～6 cm，pH 4.8～5.6。

1.2 研究方法

2009年在全面踏查此地區(qū)的落葉松人工林的基礎(chǔ)上，本著土壤類型、立地條件一致的原則，在幼齡林林分(Y，11 a)、中齡林林分(Z，20 a)、近熟林林分(J，34 a)與成熟林林分(C，47 a)分別選擇9個樣地，共計36個樣地作為實驗樣地。36個樣地的林分初值密度均為4 444株·hm-2，后經(jīng)撫育間伐管理。2013年樣地概況如表1、表2所示。

1.3 樣品采集與分析

于2013年10月在4個不同發(fā)育階段林分內(nèi)分別隨機選擇3個樣地，共計12塊，樣地面積均為0.08 hm2(28.3 m×28.3 m)。按梅花型取樣方法選擇5個樣點，每個樣點設(shè)置0.5 m ×0.5 m 小樣方，分別對樣方內(nèi)未分解層(W)、半分解層(B)和全分解層枯落物(Q)取樣。取樣分層標準[14]：未分解層位于枯落物的表層，形成時間小于 1年，未分解、未壓縮成塊狀；半分解層已開始分解，但葉片形狀尚完整，未壓縮成塊狀；全分解層葉片形狀已不完整或已不能辨認，通常壓縮成塊狀，緊挨表土層。每個小樣方每層取3份樣品，分別用作含水量、pH、養(yǎng)分含量以及微生物群落結(jié)構(gòu)測定。用于群落結(jié)構(gòu)測定的樣品用冰盒保存帶回實驗室，置于-80℃冰箱中待用。

樣品采集后立即測定其鮮質(zhì)量，帶回實驗室80 ℃烘干至恒重，測定其干質(zhì)量，計算含水量及枯落物層貯量。2 g風干材料在研缽中加入液氮研磨成粉末后加入到盛有40 mL超純水三角瓶中，震蕩30 min再靜置30 min后，吸取上清液，用電子pH 計測定pH。研磨后的枯落物，過10目篩用于速效養(yǎng)分測定，過100目篩用于全量養(yǎng)分測定?？萋湮镉袡C碳(LOC)采用硫酸消煮—重鉻酸鉀外加熱法；全氮(TN)采用硫酸消煮—凱氏定氮；堿解氮(AN)采用堿解擴散法；全磷(TP)采用硫酸消煮—鉬銻抗比色法；有效磷(AP)采用NaHCO3浸提—鉬銻抗比色法；全鉀(TK)采用磷酸消煮—原子吸收分光光度計法；速效鉀(AK)采用醋酸銨浸提—原子吸收分光光度計法；交換性鈣離子(Ca2+)、交換性鎂離子(Mg2+)采用醋酸銨交換法。具體測定方法參照《中華人民共和國林業(yè)行業(yè)標準方法》[15]。

表1 研究樣地概況①Table 1 General situation of the sample sites for the research

表2 不同發(fā)育階段日本落葉松林分表層土壤化學性質(zhì)Table 2 Chemical properties of topsoil relative to stand different development stagein the Larix kaempferi plantation

1.4 枯落物層微生物群落結(jié)構(gòu)測定

DNA提?。翰捎肕oBioPowersoil DNA 提取試劑盒(Mo Bio，CA，USA)，按照說明書提取，通過瓊脂糖電泳以及Nanodrop8000檢測DNA質(zhì)量與濃度。

微生物數(shù)量測定：采用實時熒光定量PCR技術(shù)(qPCR)分別擴增細菌16SrDNA，真菌18SrDNA的基因拷貝數(shù)[16-17]。分別用真菌特異性引物FF390/FR1、細菌特異性引物338f/518r[5]，擴增樣品DNA，PCR產(chǎn)物純化后克隆到PMD19-T載體中，將陽性克隆子擴增培養(yǎng)后提取質(zhì)粒 DNA，將已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒稀釋10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，作為標準曲線的DNA模板。熒光定量PCR采用20 μL反應(yīng)體系：2 μL稀釋模板(細菌稀釋100倍，真菌稀釋10倍)或者2 μL質(zhì)粒DNA，10 μmol·L-1上下游引物各0.4 μL，BSA 0.5 μL(20 mg·mL-1)，SYBRⅡ10.0 μL，RoxdyeⅡ0.4 μL，滅菌水補足至20 μL。qPCR運行程序分別為：細菌95 ℃，2 min；(95 ℃，5 s；60 ℃，35 s；) 28 cycles。真菌95 ℃，2 min；(95 ℃，40 s；55 ℃，40 s；72 ℃，40 s)30 cycles。每個樣品做3個重復，每次試驗同時做陰性對照(NC)、標準曲線與溶解曲線。溶解曲線呈單峰說明擴增引物特異性強，16S rDNA標準曲線為Ct=-3.287 lgCt+37.26(R2=0.997，EFF%=101.5)；18S rDNA標準曲線為Ct=-3.236lgCt+36.92(R2=0.998，EFF%= 103.724)。真菌與細菌的標準曲線相關(guān)系數(shù)r與擴增效率EFF均符合要求。以上所用試劑均購自Takara公司。

微生物群落多樣性測定：采用PCR擴增與末端限制性酶切片段長度多態(tài)性技術(shù)(T-RFLP)相結(jié)合的方法。分別用特異性引物27F/1492r、ITS1/ITS4對細菌 16S rDNA和真菌ITS rDNA進行PCR擴增，并在上游引物的正向標記熒光物質(zhì)(FAM)[5，18-19]。25 μL反應(yīng)體系：Extaq 0.2 μL (5 U·μL-1)，10×Exbuffer 2.5 μL，dNTPmix 2.0 μL (各2.5 mmol·L-1)，模版1 μL，10 μmol·L-1上下游引物各1 μL，BSA 0.5 μL (20 mg·mL-1)，滅菌水補足至25 μL。PCR運行程序分別為：細菌：94 ℃，30 s；(94 ℃，30 s；54 ℃，30 s；72 ℃，90 s) 24 cycles；72 ℃，10 min。真菌：95 ℃，2 min；(95 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，45 s) 30 cycles。每個樣品取300 ng純化的PCR產(chǎn)物，分別用限制性內(nèi)切酶MSPⅠ、HinfⅠ及HaeⅢ(Takara)按照說明書步驟對真菌ITS PCR產(chǎn)物、細菌16S rDNA PCR產(chǎn)物進行酶切。酶切產(chǎn)物脫鹽后，經(jīng) 1.2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，MSPⅠ對細菌、HinfⅠ對真菌PCR產(chǎn)物酶切效果較好，送北京睿博興科生物技術(shù)有限公司進行基因掃描，真菌使用GS500內(nèi)標，細菌使用GS1200Liz內(nèi)標。掃描結(jié)果用GeneMarker V2.0進行統(tǒng)計分析，剔除小于50 bp和大于500 bp(細菌大于1 000 bp)的片段，以及熒光強度小于100 單位的峰。將1 bp以內(nèi)的片段(T-RFs)進行合并，不同長度的T-RFs代表不同種微生物。以不同長度的T-RFs片段的峰面積占總峰面積的百分數(shù)來表征不同微生物類群的相對數(shù)量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

微生物群落多樣性指數(shù)按如下公式進行計算：

多樣性指數(shù)采用 Shannon-Weinner指數(shù)(H')：

均勻度指數(shù)采用Pielou指數(shù)(E)：

式中，Pi為第i個物種的個體數(shù)(Ni)占總數(shù)的(N)的比值。

本研究中數(shù)據(jù)均用均值±標準差表示，采用Spss V19.0軟件進行雙因素方差分析，經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布的，采用LSD進行多重比較，否則采用Kruskal-Wallis進行非參數(shù)檢驗，P＜0.05 差異顯著。主成分分析(PCA)分析不同發(fā)育階段段林分枯落物層微生物群落結(jié)構(gòu)的差異性；冗余分析(RDA)分析不同發(fā)育階段林分枯落物層微生物群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境變量的關(guān)系。冗余分析(RDA)與主成分分析(PCA)均在CanocoV4.5軟件中運行。

2 結(jié) 果

2.1 枯落物理化性質(zhì)及養(yǎng)分貯量

枯落物中堿解氮與全磷含量在中齡林與近熟林最低；有機碳、速效鉀濃度以及pH不受林齡影響，在未分解層顯著高于其他分解層。全氮、有效磷、全鉀濃度以及C/N受林齡與分解層的共同影響，全氮與有效磷濃度在幼齡林與中林齡較高，在成熟林較低，在未、半分解層較高，在全分解層較低，而全鉀濃度呈相反趨勢；C/N在幼齡林最高，在半分解層最低(表3)?？萋湮锟們α恳约梆B(yǎng)分總儲量均在近熟林最高。幼齡林、中齡林及近熟林枯落物儲量與養(yǎng)分貯量主要集中在半分解層，成熟林養(yǎng)分主要集中在全分解層(表4)。

表3 不同發(fā)育階段林分枯落物層理化性質(zhì)Table 3 Physico-chemical properties of the litter relative to stand different in development stage

2.2 微生物群落結(jié)構(gòu)

單位質(zhì)量枯落物細菌與真菌基因拷貝數(shù)隨林齡增大在不同枯落物層總體呈“V”形趨勢。細菌在幼齡林最高，近熟林最低，成熟林階段又有所上升，其中半分解層細菌基因拷貝數(shù)在不同發(fā)育階段林分中均最高 (圖1a)。真菌基因拷貝數(shù)在中齡林或近熟林較低，在成熟林與幼齡林較高，其中未分解層真菌基因拷貝數(shù)在不同發(fā)育階段林分中均最高(圖1b)。

基于T-RFLP測定數(shù)據(jù)分析不同發(fā)育階段林分微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性指數(shù)(表5)與微生物群落結(jié)構(gòu)差異(圖2)?？傮w而言，不同發(fā)育階段林分細菌與真菌半、全分解層豐富度指數(shù)與多樣性指數(shù)在近熟林或中齡林最高，在幼齡林最低，而均勻度指數(shù)在近熟林最低。豐富度指數(shù)與多樣性指數(shù)在幼齡林與成熟林隨枯落物分解程度增加而減小，在中齡林與近熟林呈相反趨勢，而均勻度指數(shù)在幼齡林、中齡林與成熟林隨枯落物分解程度增加而增加。微生物群落在PCA圖中的分布可以看出，不同發(fā)育階段林分全分解層細菌群落較相似，真菌群落差異較大。中齡林與成熟林未分解、半分解層細菌群落結(jié)構(gòu)相似；幼齡林未分解、半分解層與近熟林未分解層細菌群落結(jié)構(gòu)相似；幼齡林、中齡林未分解、半分解層以及近熟林未分解層真菌群落結(jié)構(gòu)相似。近熟林半分解層的真菌與細菌與其他林齡分布距離較遠，表明近熟林半分解層真菌與細菌群落結(jié)構(gòu)存在特異性。

2.3 優(yōu)勢微生物種群

?

圖1 不同發(fā)育階段林分單位質(zhì)量枯落物細菌(a)與真菌(b)基因拷貝數(shù)Fig. 1 Bacterial (a) and fungal (b) gene copies relative to stand different in development stage

表5 不同發(fā)育階段林分微生物群落多樣性指數(shù)Table 5 Microbial community diversity index relative to stand different in development stage

對相對含量大于3%的優(yōu)勢菌進行分析，不同處理中優(yōu)勢菌相對含量總值基本均大于60%，因此可以反映微生物群落結(jié)構(gòu)信息。不同發(fā)育階段林分枯落物層優(yōu)勢細菌種類基本相同(圖3)，相對含量不同，而優(yōu)勢真菌種類及相對含量明顯不同(圖4)。細菌T-RF145、147、435及533在不同發(fā)育階段林分枯落物各分解層均為優(yōu)勢菌，相對含量受林齡以及分解層的共同影響?？傮w上T-RF 145、435及533在幼齡林隨分解程度增加相對含量呈顯著增加趨勢；T-RF 145、147與533在近熟林與成熟林隨分解程度增加相對含量呈顯著降低趨勢；T-RF147與435在中齡林半分解層相對含量最高。真菌T-RF 260在除幼齡林及近熟林的全分解層外的其他枯落物層均為優(yōu)勢菌株，但在近熟林未、半分解層相對含量顯著低于其他3個林齡，隨分解程度增加相對含量逐漸降低。T-RF 306主要分布在中齡林、近熟林與成熟林，并且在半分解層相對含量較高。T-RF 50、277及276分布在幼齡林、中齡林與成熟林的未分解或半分解層，在近熟林中沒有分布。T-RF 201、346、349、359及459僅在近熟林未分解、半分解層為優(yōu)勢菌。T-RF 240在幼齡林全分解層占絕對優(yōu)勢，T-RF 239與245在中齡林與成熟林全分解層占絕對優(yōu)勢，T-RF 303與315在近熟林全分解層占絕對優(yōu)勢。大于3%的優(yōu)勢真菌種類在近熟林未分解層最多，在半分解、全分解層則最少。

圖2 微生物群落結(jié)構(gòu)PCA分析Fig. 2 PCA analysis of the soil microbial community

圖3 不同發(fā)育階段林分枯落物層優(yōu)勢細菌T-RFLP分析Fig. 3 T-RFLP analysis of the dominant bacteria in the litter relative to stand different in development stage

圖4 不同發(fā)育階段林分枯落物層優(yōu)勢真菌T-RFLP分析Fig. 4 T-RFLP analysis of the dominant fungi in the litter relative to stand different in development stage

2.4 微生物群落與環(huán)境因素的相關(guān)性

微生物群落在RDA圖中的分布受林齡與分解層的共同影響(圖5)，未分解、半分解層分布在第二、三象限，其中幼齡林與成熟林分布在第二象限，微生物群落主要受全氮、全磷以及C/N影響；中齡林與近熟林分布在第三象限，微生物群落主要受pH、有效磷、林下植被生物量、堿解氮、速效鉀、全鉀以及C/N影響。全分解層分布在第一、四象限，幼齡林與中齡林分布在第一與第四象限相接處，微生物群落主要受全鉀、C/N與枯落物含水率正影響；近熟林分布在第一象限，微生物群落主要受枯落物含水率影響；成熟林分布在第四象限，微生物群落主要受C/N與全鉀影響。

環(huán)境因素對真菌與細菌群落結(jié)構(gòu)多樣性的影響存在較大差異，全磷、枯落物含水率以及全鉀對細菌群落結(jié)構(gòu)多樣性影響較大；有效磷、林下植被生物量、pH、堿解氮、有機碳以及速效鉀對真菌群落結(jié)構(gòu)多樣性影響較大。

3 討 論

3.1 微生物群落結(jié)構(gòu)對不同發(fā)育階段林分枯落物分解差異的解釋

微生物是枯落物重要的分解者，可以作為枯落物分解的指示特征[20-21]，微生物數(shù)量與枯落物分解速率呈顯著正相關(guān)[11]。在本研究中近熟林或中齡林單位質(zhì)量枯落物細菌與真菌基因拷貝數(shù)最低，近熟林階段枯落物層微生物群落結(jié)構(gòu)也與其他發(fā)育階段明顯不同。這可能是近熟林階段枯落物分解速率下降，枯落物儲量以及養(yǎng)分儲量在近熟林階段最高的主要原因。近熟林階段優(yōu)勢菌種類與其他發(fā)育階段林分明顯不同，尤其是優(yōu)勢真菌的種類，比如優(yōu)勢真菌T-RF 50、277以及276在幼齡林、中齡林以及成熟林中均為優(yōu)勢真菌，而在近熟林中不是。T-RF 201、346、349、359及459僅在近熟林未分解、半分解層為優(yōu)勢真菌。這可能是由于不同林齡林分環(huán)境的差異導致[22]，與對長白山區(qū)不同林分類型以及不同發(fā)育階段林分真菌與細菌群落結(jié)構(gòu)研究的結(jié)論相同[23]。近熟林階段復雜的林分環(huán)境為微生物提供了更多的生態(tài)位，微生物群落豐富度指數(shù)與多樣性指數(shù)較高，但不利的環(huán)境條件如枯落物層較高的C/N，較貧瘠的表層土壤中以及高郁閉度的林分環(huán)境，導致一部分優(yōu)勢菌相對含量顯著下降，甚至下降為非優(yōu)勢菌，因此均勻度指數(shù)降低。這與本研究優(yōu)勢真菌種類在近熟林半、全分解層最少的結(jié)果相一致，因此推測優(yōu)勢菌在不同發(fā)育階段林分枯落物分解中發(fā)揮著重要作用。

圖5 微生物群落與環(huán)境的RDA分析Fig.5 RDA analysis of microbial and environment factors

3.2 微生物群落結(jié)構(gòu)對不同分解層枯落物分解差異的解釋

PCA分析表明未分解、半分解層微生物群落結(jié)構(gòu)與全分解層明顯不同，這主要是由于隨分解進行微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，在分解前期R-對策的微生物占優(yōu)勢，在分解后期K-對策的微生物占優(yōu)勢[24]，這可能是導致不同分解層枯落物分解差異的主要原因。隨分解進行易分解的物質(zhì)越來越少，木質(zhì)素等難分解的頑拗物質(zhì)不斷增加，能夠分解這類物質(zhì)的微生物越來越少[25]，因此真菌基因拷貝數(shù)降低，這與以往的研究枯落物前期分解快、后期分解慢的結(jié)論一致[26-27]。在本研究中真菌群落結(jié)構(gòu)受環(huán)境因素的影響大于細菌群落結(jié)構(gòu)，真菌是降解凋落物的先鋒物種，改變凋落物的結(jié)構(gòu)及其化學組成，軟化植物殘體，為細菌定殖創(chuàng)造條件[28]。細菌基因拷貝數(shù)在半分解層最高，這也主要是由于半分解層凋落物經(jīng)過前期真菌的分解，其自身的理化性質(zhì)發(fā)生很大的變化，具有孔隙多、表面張力大、吸水面大、油脂含量減少等特點，使其更適宜細菌生存繁殖[29-30]。此外，以往的研究也表明枯落物層的分解酶主要來源于真菌[31]，因此真菌群落結(jié)構(gòu)在不同分解層枯落物分解中發(fā)揮著重要作用，調(diào)控真菌群落結(jié)構(gòu)對枯落物分解至關(guān)重要。

3.3 林分環(huán)境對不同發(fā)育階段林分枯落物分解差異的解釋

中齡林與近熟林未、半分解層微生物群落結(jié)構(gòu)受環(huán)境因素的影響一致，而幼齡林則與成熟林相同。這表明從中齡林階段林分環(huán)境(枯落物層理化性質(zhì)以及林下植被)已經(jīng)開始朝不利于微生物生存的方向發(fā)展，到近熟林階段達到頂峰，從成熟林階段開始林分環(huán)境則有所改善，逐漸趨近于幼齡林。中齡林與近熟林枯落物中微生物較幼齡林與成熟林受更多的環(huán)境因素影響，養(yǎng)分含量、林下植被生物量以及pH基本在中齡林或近熟林最低，而C/N最高，這些都反映出近熟林與中齡林階段枯落物質(zhì)量低[32]。在中齡林和近熟林階段林下植被生物量已成為影響微生物群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵因素。因此，改善林下植被對枯落物層的理化性質(zhì)及微生物群落結(jié)構(gòu)均有有利的影響[33]。本研究也證實當林分進入成熟林階段后，由于林分密度、郁閉度降低，林下植被生物量增大，易分解的草本植物以及闊葉灌木枯落物大量歸還到地表，枯落物層理化性質(zhì)得到改善，微生物數(shù)量呈上升趨勢，這與以前的研究認為成熟林階段地力有一定改善的結(jié)論相一致[5，34]。盛煒彤等[33，35]對杉木研究表明當林分郁閉度在0.7以下時，林下植被才能很好地發(fā)育，且能促進土壤中微生物繁殖。因此有必要對中齡林以及近熟林階段林分進行合理的經(jīng)營管理(修枝和間伐)，促進林下植被發(fā)育，改善枯落物層理化性質(zhì)，從而提高枯落物分解，加速養(yǎng)分循環(huán)；或者適當延長日本落葉松的主伐年齡，通過林分的自然稀疏等措施對林分環(huán)境進行調(diào)節(jié)。

4 結(jié) 論

微生物群落結(jié)構(gòu)的變化導致了中齡林與近熟林階段枯落物分解慢，地力衰退。近熟林階段林分半分解層枯落物真菌與細菌的群落結(jié)構(gòu)、優(yōu)勢微生物種類與其他發(fā)育階段林分明顯不同，尤其是真菌；真菌與細菌數(shù)量也在中齡林或近熟林枯落物層最低。中齡林或近熟林枯落物層微生物受環(huán)境因素影響較大，林下植被生物量成為影響微生物群落結(jié)構(gòu)特征的主要因子。因此，加強對日本落葉松人工純林中齡林與近熟林階段的密度管理，促進林下植被發(fā)育，改善枯落物性質(zhì)，可以提高微生物活性，加速養(yǎng)分循環(huán)，緩解地力衰退。