鄭斯鑫 周春華 孔文成 尹光

[摘要] 目的 探討沉默水通道蛋白3（AQP3）基因表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、凋亡和化療敏感性的影響。 方法 體外培養(yǎng)結(jié)直腸癌細(xì)胞LoVo，采用梯度濃度誘導(dǎo)法建立紫杉醇耐藥細(xì)胞株LoVo/Taxol。將LoVo細(xì)胞和LoVo/Taxol細(xì)胞分別分為空白對(duì)照組（細(xì)胞不做任何特殊處理）、陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒）、shAQP3組（沉默AQP3表達(dá)），逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）和Western blot法檢測(cè)AQP3 mRNA和蛋白表達(dá)。CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。四唑化合物（MTS）檢測(cè)紫杉醇的細(xì)胞毒性。結(jié)果 人結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo中AQP3 mRNA相對(duì)表達(dá)量和蛋白表達(dá)量均高于人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460和HCoEpiC，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。敲低AQP3表達(dá)后，shAQP3組LoVo細(xì)胞增殖活性（OD值）較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組降低，同時(shí)凋亡率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。成功構(gòu)建LoVo/Taxol耐藥細(xì)胞，對(duì)紫杉醇、5-Fu、阿霉素的耐藥指數(shù)分別為（31.97±1.78）、（17.97±2.14）、（104.80±5.53）。而shAQP3組LoVo/Taxol細(xì)胞對(duì)紫杉醇、5-Fu、阿霉素的耐藥指數(shù)分別為（6.06±0.25）、（5.57±0.20）、（21.23±0.27），較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 沉默AQP3基因表達(dá)能夠抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡并增強(qiáng)LoVo/Taxol耐藥細(xì)胞的化療敏感性。

[關(guān)鍵詞] AQP3;結(jié)直腸癌;增殖;凋亡;化療敏感性

[中圖分類(lèi)號(hào)] R735.3? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2021）31-0006-06

[Abstract] Objective To explore the effect of silencing aquaporin 3 （AQP3） gene expression on the proliferation， apoptosis， and chemosensitivity of colorectal cancer cells. Methods LoVo colorectal cancer cells were cultured in vitro， and the LoVo/Taxol paclitaxel-resistant cell lines were established by gradient concentration induction method. The LoVo cells and LoVo/Taxol cells were divided into the blank control group （no special treatment）， the negative control group （negative control plasmid transfection）， and the shAQP3 group （silencing AQP3 expression）. Reverse transcription-polymerase chain reaction （qRT-PCR） and Western blot method were used to detect AQP3 mRNA and protein expression. CCK-8 experiment was used to detect cell proliferation ability， and flow cytometry was used to detect cell apoptosis. Tetrazolium compound （MTS） was used to detect the cytotoxicity of paclitaxel. Results The AQP3 mRNA relative expression and protein expression in human colon cancer cells LoVo were higher than those in human normal colonic epithelial cells NCM460 and HCoEpiC，the difference was statistically significant （P<0.05）. After knocking down the AQP3 expression， the proliferation activity （OD value） of LoVo cells in the shAQP3 group was lower than those in the blank control group and the negative control group， and the apoptosis rate was higher than those in the blank control group and the negative control group，the difference was statistically significant（P<0.05）. The LoVo/Taxol resistant cells were successfully constructed， and the resistance indexes to paclitaxel， 5-Fu and adriamycin were （31.97±1.78）， （17.97±2.14）， （104.80±5.53）， respectively. The resistance indexes of LoVo/Taxol cells to paclitaxel， 5-Fu and adriamycin in the shAQP3 group were （6.06±0.25）， （5.57±0.20）， （21.23±0.27）， respectively， which were significantly lower than those in the blank control group and the negative control group，the difference was statistically significant（P<0.05）. Conclusion Silencing AQP3 gene expression can inhibit the proliferation of colorectal cancer cells， promote the apoptosis of colorectal cancer cells， and enhance the chemosensitivity of LoVo/Taxol resistant cells.

[Key words] AQP3; Colorectal cancer; Proliferation; Apoptosis; Chemosensitivity

2018年，中國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病率占世界的24.3%，病死率占世界的22.9%，且逐漸呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)[1]。為了提高臨床治療效果，有必要更好地了解結(jié)直腸癌的發(fā)生機(jī)制，從而推動(dòng)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展。水通道蛋白（Aquaporins，AQPs）是一種糖基化的膜整合蛋白，能夠通過(guò)跨質(zhì)膜的滲透梯度促進(jìn)跨上皮水分子轉(zhuǎn)運(yùn)[2]。雖然AQPs存在于多種組織中，但大多具有獨(dú)特的組織表達(dá)模式，如在某些腫瘤細(xì)胞中表達(dá)非?；钴S。研究表明，AQP3在多種腫瘤細(xì)胞增殖、生存、轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用[3]。Hong等[4]研究也發(fā)現(xiàn)血清AQP-1、AQP-3對(duì)年輕結(jié)腸癌患者具有重要的預(yù)后價(jià)值，但是缺乏基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持。因此，本研究分別以結(jié)直腸癌親本細(xì)胞LoVo和紫杉醇耐藥細(xì)胞株LoVo/Taxol作為研究對(duì)象，探討沉默AQP3基因表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、凋亡和化療敏感性的影響，以期為尋找結(jié)腸癌新的靶點(diǎn)提供證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來(lái)源及培養(yǎng)

人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW620、LoVo、HCT116、SW480、Caco-2、HT-29及人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460、HCoEpiC，均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院（上海）典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于RPMI-1640或DMEM培養(yǎng)液中，輔以10%胎牛血清、50 IU/mL青霉素、50 μg/mL鏈霉素和2 mmol/L谷氨酰胺，培養(yǎng)在37℃、5%CO2生化培養(yǎng)箱中。

1.2 材料

Dulbecco改良Eagle高糖培養(yǎng)基（DMEM）、RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;兔抗人單克隆抗體Anti-AQP3購(gòu)自美國(guó)Cell Signing公司。紫杉醇（Paclitaxel）購(gòu)自上海Sigma-Aldrich公司，溶解在二甲基亞砜（DMSO）中，制備20 mmol/L儲(chǔ)備液，DMSO終濃度<0.1%（V/V），保存在-80℃，使用前用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋。5-Fu購(gòu)自上海Sigma-Aldrich公司，以20 mmol/L濃度儲(chǔ)存在DMSO中。阿霉素購(gòu)自上海Sigma-Aldrich公司，用PBS溶解至1 mmol/L保存在 -20℃。AQP3 shRNA轉(zhuǎn)染質(zhì)粒購(gòu)自美國(guó)Origene公司;Genjet轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)SignaGen Laboratories;反轉(zhuǎn)錄試劑盒與SYBR Premix Ex Taq 試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司;CCK-8、MTS試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所;倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司;Annexin V-FITC/PI 流式細(xì)胞檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海朗智生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 建立耐藥細(xì)胞株? 采用體外梯度濃度誘導(dǎo)法建立LoVo紫杉醇耐藥細(xì)胞株，起始濃度為0.05 μmol/L，培養(yǎng)48 h后更換為不含藥物的RPMI-1640完全培養(yǎng)液，待細(xì)胞狀態(tài)逐漸正常（約2周）后，以濃度倍增的方式提高藥物濃度，待細(xì)胞能夠在1.5 μmol/L紫杉醇溶液中長(zhǎng)期穩(wěn)定生長(zhǎng)時(shí)，制備細(xì)胞爬片，用2% Giemsa染液染色，并用安裝了MacBiophotonics插件的Image J（v. 1.39）系統(tǒng)分析細(xì)胞和核周長(zhǎng)等形態(tài)學(xué)參數(shù)。收集細(xì)胞，用紫杉醇、5-Fu、順鉑驗(yàn)證細(xì)胞的耐藥指數(shù)和半數(shù)抑制濃度（50% Concentration inhibition，IC50）[5]。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組? 將LoVo和LoVo/Taxol細(xì)胞分別分為空白對(duì)照組（細(xì)胞不做任何特殊處理）、陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒）、shAQP3組（轉(zhuǎn)染AQP3 shRNA質(zhì)粒序列）。在4個(gè)AQP3 shRNA轉(zhuǎn)染質(zhì)粒序列中，選擇下調(diào)最明顯的質(zhì)粒作為穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞（shAQP3組）的載體用作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。用Genjet體外轉(zhuǎn)染試劑將AQP3 shRNA轉(zhuǎn)染質(zhì)粒和對(duì)照shRNA質(zhì)粒[包括一個(gè)紅色熒光蛋白（Red fluorescent protein，RFP）序列和位于SV40啟動(dòng)子下游的嘌呤霉素-N-乙?；D(zhuǎn)移酶基因]轉(zhuǎn)染LoVo細(xì)胞。用2 μg/mL嘌呤霉素處理細(xì)胞2周后，用玻璃菌落篩選柱挑選抗嘌呤霉素細(xì)胞集落。然后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行5倍的連續(xù)稀釋?zhuān)詈笠淮蜗♂屧u(píng)估RFP表達(dá)和傳代培養(yǎng)。

1.3.3 qRT-PCR檢測(cè)AQP3 mRNA的表達(dá)? Trizol試劑盒按照說(shuō)明書(shū)提取總RNA，紫外分光光度法定量后，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。AQP3上游引物：5'-GTC ACT CTG GGC ATC CTC AT-3'，下游引物：5'-GCC CAA AAA CTA TTC CAG CA-3'。用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒進(jìn)行PCR，擴(kuò)增條件為94℃，15 s;55℃，15 s;72℃，20 s;共35個(gè)循環(huán)。用2-ΔΔCt法以β-actin為內(nèi)參計(jì)算LoVo和LoVo/Taxol各組細(xì)胞中AQP3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞AQP3蛋白表達(dá) 細(xì)胞用RIPA 緩沖液溶解，13 000 RCF離心去除不溶性物質(zhì)，用Lowry法定量分析裂解產(chǎn)物的蛋白質(zhì)含量，并在690 nm處進(jìn)行吸光度測(cè)量。取每個(gè)樣本約60 μg蛋白經(jīng)12% SDS-PAGE變性分離。隨后以100 V電轉(zhuǎn)到PVDF膜上，然后用5%脫脂牛奶加入含0.1% Tween-20（TBST）的1×TBS緩沖液進(jìn)行封閉。封閉后，在TBST和TBS緩沖液中分別洗滌3次和1次，然后在4℃下與兔抗人AQP3抗體孵育過(guò)夜，用山羊抗兔IgG-HRP結(jié)合的二級(jí)抗體再次孵育。洗膜后暴露于EN-ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)5 min。然后使用GBOX HR 16成像系統(tǒng)和GeneSys軟件進(jìn)行可視化處理。以微管蛋白（Tubulin）作為內(nèi)參。

1.3.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖? 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LoVo細(xì)胞接種于96孔板上，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72、96 h后每孔加入10 μL CCK-8試劑，37℃孵育2 h后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度（OD）值。

1.3.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡? 培養(yǎng)48 h后收集各組LoVo細(xì)胞，先加入300 μL 1×Binding Buffer 懸浮細(xì)胞，然后加入5 μL的Annexin V-FITC混勻、避光、室溫孵育15 min。上機(jī)前5 min再加入5 μL PI染色，上機(jī)前補(bǔ)加200 μL 1×Binding Buffer，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率。

1.3.7 MTS檢測(cè)LoVo/Taxol細(xì)胞的多藥耐藥性? 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LoVo細(xì)胞和LoVo/Taxol細(xì)胞，用0.25%胰酶消化，按5000個(gè)/100 μL接種于96孔板，次日更換培養(yǎng)基，將紫杉醇、5-Fu、阿霉素分別稀釋至8個(gè)梯度濃度，加藥處理48 h后，每孔加入20 μL的MTS試劑，37℃繼續(xù)孵育3 h，用酶標(biāo)儀讀取每孔的光密度值（OD=490 nm）。設(shè)含紫杉醇組為實(shí)驗(yàn)組，0 nM為對(duì)照組，細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組OD490-空白組OD490）/（對(duì)照組OD490-空白組OD490）×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人結(jié)腸癌細(xì)胞和正常結(jié)腸上皮細(xì)胞中AQP3表達(dá)差異

經(jīng)qRT-PCR法和Western blot法檢測(cè)，人結(jié)腸癌細(xì)胞系（SW620、LoVo、HCT116、SW480、Caco-2、HT-29）中AQP3 mRNA相對(duì)表達(dá)量和蛋白表達(dá)量均高于人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460和HCoEpiC，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。本研究選擇AQP3表達(dá)量相對(duì)較高的LoVo細(xì)胞用于后續(xù)研究。見(jiàn)圖1。

2.2 沉默AQP3表達(dá)對(duì)細(xì)胞LoVo細(xì)胞增殖和凋亡活性的影響

2.2.1 AQP3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量? 經(jīng)qRT-PCR法和Western blot法檢測(cè)，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，shAQP3組LoVo細(xì)胞中AQP3 mRNA相對(duì)表達(dá)量和蛋白表達(dá)量均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖2A。

2.2.2 細(xì)胞增殖活性? 經(jīng)CCK-8法檢測(cè)，分別轉(zhuǎn)染24、48、72、96 h時(shí)，shAQP3組LoVo細(xì)胞增殖活性（OD值）均低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖2B。

2.2.3 細(xì)胞凋亡活性? 經(jīng)FCM法檢測(cè)，shAQP3組LoVo細(xì)胞凋亡率為（25.84±3.15）%，高于空白對(duì)照組的（5.22±0.37）%和陰性對(duì)照組的（6.31±0.75）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖2C。

2.3 LoVo/Taxol耐藥細(xì)胞驗(yàn)證

歷時(shí)8個(gè)月，利用體外濃度梯度誘導(dǎo)法成功建立LoVo紫杉醇耐藥細(xì)胞株LoVo/Taxol。

2.3.1 形態(tài)學(xué)觀察? Giemsa染色和影像學(xué)分析顯示，比較LoVo細(xì)胞和LoVo/Taxol耐藥細(xì)胞的細(xì)胞周長(zhǎng)和核周長(zhǎng)，均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)圖3A。

2.3.2 AQP3表達(dá)差異? qRT-PCR法和Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，與LoVo細(xì)胞比較，LoVo/Taxol耐藥細(xì)胞中AQP3 mRNA相對(duì)表達(dá)量和蛋白表達(dá)量均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖3B。

2.3.3 LoVo/Taxol細(xì)胞多藥耐藥性驗(yàn)證? 經(jīng)MTS法檢測(cè)，培養(yǎng)48 h時(shí)，LoVo/Taxol細(xì)胞對(duì)紫杉醇、5-Fu、阿霉素的耐藥指數(shù)分別為（31.97±1.78）、（17.97±2.14）、（104.80±5.53）。見(jiàn)圖3C。

2.4 沉默AQP3表達(dá)對(duì)細(xì)胞LoVo/Taxol細(xì)胞多藥耐藥的影響

2.4.1 AQP3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量? 經(jīng)qRT-PCR法和Western blot法檢測(cè)，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，shAQP3組LoVo/Taxol細(xì)胞中AQP3 mRNA相對(duì)表達(dá)量和蛋白表達(dá)量均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖4A。

2.4.2 化療藥物細(xì)胞毒作用? 經(jīng)MTS法檢測(cè)，培養(yǎng)48 h時(shí)，shAQP3組LoVo/Taxol細(xì)胞對(duì)紫杉醇、5-Fu、阿霉素的耐藥指數(shù)分別為（6.06±0.25）、（5.57±0.20）、（21.23±0.27），較空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖4B。

3 討論

據(jù)最新流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，全世界有超過(guò)945 000人患結(jié)直腸癌，約492 000人病死[6]。結(jié)直腸癌發(fā)病率隨著年齡的增長(zhǎng)而增加，這不僅造成沉重的醫(yī)療、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，也導(dǎo)致相當(dāng)?shù)纳鐣?huì)生產(chǎn)力損失[7]。手術(shù)、放療和化療是直腸癌治療的重要組成部分，尤其是化療對(duì)于中晚期結(jié)直腸癌的治療必不可少[8]。雖然近年來(lái)結(jié)直腸癌的治療取得了很大進(jìn)展，但是化療的效率通常受到癌細(xì)胞對(duì)治療藥物的耐藥性的限制。鑒于此，為治療干預(yù)確定新的細(xì)胞靶點(diǎn)對(duì)于開(kāi)發(fā)臨床治療藥物至關(guān)重要。本研究發(fā)現(xiàn)，敲低LoVo細(xì)胞中AQP3的表達(dá)可以顯著調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)的多個(gè)病理進(jìn)程，包括細(xì)胞增殖、凋亡和化療耐藥。先前的證據(jù)表明，AQP3與結(jié)腸癌患者預(yù)后有關(guān)，但是缺少體外證據(jù)證明AQP3對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的作用。針對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡研究是非常重要的，因?yàn)槟[瘤細(xì)胞生長(zhǎng)活性與疾病預(yù)后有著顯著的相關(guān)性。結(jié)合上述數(shù)據(jù)，表明通過(guò)抑制AQP3的表達(dá)可以通過(guò)降低細(xì)胞增殖活性，同時(shí)提高細(xì)胞凋亡率，進(jìn)而功能性地靶向細(xì)胞生長(zhǎng)，這也更好地解釋了AQP3可能與結(jié)腸癌患者的臨床預(yù)后相關(guān)。

AQPs家族的膜蛋白通道促進(jìn)水分在所有細(xì)胞膜上的快速運(yùn)輸，從而維持體內(nèi)水分的穩(wěn)態(tài)[9]。迄今為止，已經(jīng)確定了13種人類(lèi)AQPs[10]，它們分為兩個(gè)不同的亞組：經(jīng)典AQPs（AQP1、2、4、5、6和8），它們只負(fù)責(zé)運(yùn)輸水分子;水甘油通道蛋白（Aquaglyceroporins）（AQP 3、7、9和10），它們還會(huì)額外運(yùn)輸小的不帶電荷的分子，如甘油和尿素[11]。AQP3在人體內(nèi)廣泛表達(dá)，參與了越來(lái)越多的生理和病理過(guò)程，包括糖脂代謝、維持皮膚彈性等[12]。動(dòng)物研究顯示，AQP3-null小鼠被證明具有較低的傷口愈合能力，同時(shí)皮膚癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)也較低[13]。此外，在肺癌[14]、乳腺癌[15]和前列腺癌[16]中觀察到AQP3的過(guò)表達(dá)和異位表達(dá)，在這些癌癥中，AQP3有助于轉(zhuǎn)移、增殖和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲在腫瘤的發(fā)展過(guò)程中起著重要作用。癌細(xì)胞的特征是細(xì)胞增殖加速，腫瘤的進(jìn)展通常與異常的細(xì)胞增殖、遷移和侵襲有關(guān)。AQP定位于遷移細(xì)胞的前緣有助于吸收水分，從而引起小的腫脹，通過(guò)增加肌動(dòng)蛋白絲的空間來(lái)促進(jìn)向前移動(dòng)[17]。在本研究中，通過(guò)敲除AQP3在LoVo細(xì)胞中的表達(dá)可減少細(xì)胞的增殖活性，同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，說(shuō)明AQP3低表達(dá)對(duì)于抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)具有積極作用。最近有研究顯示，AQP3可介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)H2O2參與EGF誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及其依賴(lài)細(xì)胞功能的表皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)，而敲除AQP3基因后，免疫缺陷小鼠 A431細(xì)胞移植瘤的生長(zhǎng)受到明顯抑制[18]。因此，AQP3在EGFR細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中作為第二信使發(fā)揮促腫瘤增殖的作用[19]，這表明AQP3可能是這些促癌信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。雖然這些不是直接證據(jù)，但也間接說(shuō)明降低AQP3表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞行為改變的機(jī)制。

此外，不受控制的增殖活性為癌細(xì)胞抵抗常規(guī)化療藥物提供了生存優(yōu)勢(shì)。以Taxol為基礎(chǔ)的治療是最常見(jiàn)的結(jié)腸癌治療方案之一。然而，Taxol治療常常導(dǎo)致化療耐藥的發(fā)展，導(dǎo)致復(fù)發(fā)和治療失敗。AQP3是否參與結(jié)腸癌的化療耐藥尚不清楚。Gao等[20]研究證明，AQP3和AQP9過(guò)表達(dá)抑制了黑色素瘤中亞砷酸鹽的治療效果。本研究發(fā)現(xiàn)，AQP3過(guò)表達(dá)與LoVo/Taxol細(xì)胞化療抵抗有關(guān)。敲低AQP3表達(dá)后，可以顯著增強(qiáng)LoVo/Taxol細(xì)胞對(duì)Taxol、5-Fu、阿霉素等細(xì)胞毒藥物的敏感性。這些結(jié)果表明，AQP3介導(dǎo)了LoVo/Taxol細(xì)胞的多藥耐藥性，這與AQP3過(guò)表達(dá)與結(jié)腸癌患者預(yù)后不良之間的關(guān)系一致。

AQP3有望成為結(jié)腸癌治療的一個(gè)令人興奮的靶標(biāo)，首先它是一種膜蛋白，使用傳統(tǒng)的藥學(xué)手段相對(duì)容易獲得;其次使用AQP3基因敲除小鼠的研究表明，其主要表型后果僅限于導(dǎo)致皮膚干燥和減少傷口愈合，雖然傷口愈合的延遲可能是術(shù)后的一個(gè)問(wèn)題，但是仍然可以通過(guò)比較簡(jiǎn)單的手段來(lái)解決。本研究為進(jìn)一步的工作提供了一個(gè)平臺(tái)，然而仍然需要更深入的機(jī)制研究以證實(shí)AQP3作為結(jié)腸癌治療靶點(diǎn)的潛力。

綜上所述，AQP3高表達(dá)可能是促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)和化療耐藥的重要分子機(jī)制之一;敲低AQP3表達(dá)后，LoVo細(xì)胞增殖活性降低，同時(shí)凋亡率增加，LoVo/Taxol細(xì)胞對(duì)多種化療藥物的耐藥性也被逆轉(zhuǎn)。此研究結(jié)果為AQP3在結(jié)直腸癌中的作用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)，并為結(jié)直腸癌的臨床治療提供新的思路。

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（收稿日期：2021-04-10）