楊 斌 孫洮玉 劉 真 崔 曄 徐春英△

（1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，北京 100091；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700）

變應(yīng)性鼻炎（AR）是變應(yīng)原刺激下IgE介導(dǎo)的鼻黏膜非感染性慢性炎癥。流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國(guó)城市AR患病率平均為11.1%，全球AR患者人數(shù)超過(guò)5億［1］。AR如未得到有效控制，可導(dǎo)致鼻竇炎、哮喘等疾病發(fā)生［2］，因此對(duì)AR患者進(jìn)行有效干預(yù)治療，對(duì)防止其惡化具有重要意義。玉蟬衛(wèi)肺丸是西苑醫(yī)院院內(nèi)制劑，具有補(bǔ)氣健脾散風(fēng)之功，臨床上取得了較好的療效［3-4］。本研究通過(guò)觀察AR大鼠鼻腔分泌物中嗜酸粒細(xì)胞數(shù)量、血清IgE水平、鼻黏膜組織病理改變以及肥大細(xì)胞表達(dá)，探究玉蟬衛(wèi)肺丸對(duì)AR的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 32只SPF級(jí)SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量（200±20）g，4～6周齡，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0001。大鼠飼料喂養(yǎng)，自由飲水，室溫（22±2）℃，濕度（55±15）%，并通過(guò)本院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理研究委員會(huì)同意。

1.2 試藥與儀器 玉蟬衛(wèi)肺丸，由黃芪、玉竹、蟬衣、防風(fēng)、白芷組成，生藥量4.25 g/丸，院內(nèi)制劑號(hào)：京衛(wèi)藥制字（087）第F-1246號(hào)。氯雷他定片（西安楊森，10 mg/片，批號(hào)：050218967）。卵清蛋白（OVA）（批號(hào)A5253-1009，Sigma），氫氧化鋁凝膠［Al（OH）3］（批號(hào)A8222-250，Sigma），MC小鼠單克隆抗體（貨號(hào)ab2378，Abcam），酶標(biāo)山羊抗小鼠/兔IgG聚合物（批號(hào)1919D0516，中杉金橋）。全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀（ASP300，Thermo），全自動(dòng)脫水機(jī)（TP1020，Leica），組織切片機(jī)（RM2235，Leiea），光學(xué)顯微鏡（BX53，Olymplus），Image-Pro Plus 6.0（Media Cybernetics）。

1.3 分組與造模 1）分組：采用隨機(jī)數(shù)字表法，32只SD大鼠分為對(duì)照組、AR模型組、玉蟬衛(wèi)肺丸組、氯雷他定組，每組8只。2）造模：除對(duì)照組外，其余各組按照文獻(xiàn)方法制備AR大鼠模型：致敏階段給予大鼠腹腔注射卵清蛋白+抗原佐劑混懸液［0.3 mg OVA和30 mg Al（OH）3］溶于1 mL 0.9%氯化鈉溶液，隔日1次，共14 d。激發(fā)階段從第15天開(kāi)始，雙側(cè)10% OVA生理鹽水溶液滴鼻，每側(cè)50 μL，連續(xù)滴鼻7 d。鼻腔激發(fā)后30 min內(nèi)，觀察大鼠噴嚏個(gè)數(shù)、流涕分泌量及搔鼻次數(shù)，采用疊加量化法記錄評(píng)分，當(dāng)評(píng)分≥6時(shí)，表明造模成功［5-6］。

1.4 干預(yù)方法 造模成功后，根據(jù)體表面積法換算，玉蟬衛(wèi)肺丸組劑量500 μg/kg，中藥溶于蒸餾水灌胃，每日1次，氯雷他定組劑量1.25 mg/kg，每日1次，對(duì)照組及AR模型組等量生理鹽水灌胃，連續(xù)用藥10 d。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）Wright染色檢測(cè)鼻腔分泌物嗜酸性粒細(xì)胞：鼻腔分泌物涂片，95%乙醇固定，蒸餾水洗后平放于染色盒內(nèi)，滴加Wright染色液覆蓋涂片上細(xì)胞區(qū)域，再滴加等量緩沖液，輕輕搖動(dòng)涂片充分混勻，鏡下觀察染色情況，適時(shí)蒸餾水沖洗終止反應(yīng)，再經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片后備檢。200倍鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)嗜酸性粒細(xì)胞個(gè)數(shù)。2）ELISA檢測(cè)血清IgE水平：末次用藥24 h后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，1 400g離心10 min，分離血清，根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟檢測(cè)血清IgE水平。3）HE染色檢測(cè)鼻黏膜組織形態(tài)學(xué)改變：處死大鼠，統(tǒng)一取左鼻黏膜組織10%中性甲醛固定，右鼻黏膜組織凍存。組織固定后，常規(guī)脫水、包埋、切片，HE染色，顯微鏡下觀察各組鼻黏膜組織病理改變。4）免疫組化檢測(cè)鼻黏膜組織內(nèi)肥大細(xì)胞的表達(dá)：石蠟切片制作為4 μm厚度，脫蠟至水，檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）高壓熱修復(fù)3 min，10% H2O2室溫封閉10 min，PBS洗滌后加入一抗MC，濃度為1∶200，用PBS代替一抗做陰性對(duì)照，4℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育30 min，鏡下DAB顯色、蘇木精復(fù)染、梯度酒精脫水、封片。在光學(xué)顯微鏡200倍下，每切片選取3個(gè)高倍視野，拍攝鼻黏膜組織圖像。醫(yī)學(xué)圖像分析軟件（Image Pro-plus6.0）分析測(cè)定每張圖像的積分光密度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示。兩組間比較用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠鼻黏膜嗜酸性粒細(xì)胞及血清IgE水平比較 見(jiàn)表1。Wright染色檢測(cè)中，嗜酸性粒細(xì)胞被染為紅色，其細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)多量紫紅色嗜酸性顆粒樣物質(zhì)。與對(duì)照組比較，AR模型組大鼠鼻腔分泌物內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量增多，血清IgE水平增高（P＜0.05）。各用藥組與AR模型組比較，兩指標(biāo)均有下調(diào)（P＜0.05），其中玉蟬衛(wèi)肺丸組嗜酸性粒細(xì)胞減少較明顯。

表1 各組大鼠鼻黏膜組織嗜酸性粒細(xì)胞及血清IgE水平比較（±s）

表1 各組大鼠鼻黏膜組織嗜酸性粒細(xì)胞及血清IgE水平比較（±s）

與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與AR模型組比較，△P＜0.05

組別對(duì)照組AR模型組玉蟬衛(wèi)肺丸組氯雷他定組n 8 8 8 8 EOS（個(gè)）3.51±1.07 14.24±3.55*8.02±1.68△9.44±2.24 IgE（μg/mL）40.26±5.61 98.46±11.04*69.72±7.05△73.83±7.96△

2.2 各組大鼠鼻黏膜組織病理學(xué)觀察 見(jiàn)圖1。光鏡下，空白組鼻黏膜上皮未見(jiàn)損傷，假?gòu)?fù)層柱狀纖毛上皮未見(jiàn)變性壞死、增生及萎縮，形態(tài)及結(jié)構(gòu)完整，黏膜下層有少數(shù)充血，未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及腺體增生。模型組鼻黏膜假?gòu)?fù)層柱狀纖毛上皮明顯增厚，杯狀細(xì)胞增多，黏膜下腺體增生擴(kuò)張，排列紊亂，黏膜下間質(zhì)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、毛細(xì)血管明顯擴(kuò)張充血。玉蟬衛(wèi)肺丸組較模型組大鼠鼻黏膜上皮損傷程度明顯減輕，上皮層次較清楚，黏膜下腺體增生不明顯，毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，水腫不明顯，少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。氯雷他定組鼻黏膜破損減輕，上皮層次較清楚，黏膜下層腺體輕度減少，毛細(xì)血管擴(kuò)張充血水腫，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

圖1 各組大鼠鼻黏膜組織形態(tài)學(xué)改變（HE染色，200倍）

2.3 各組大鼠鼻黏膜組織內(nèi)肥大細(xì)胞表達(dá) 見(jiàn)圖2。免疫組化結(jié)果顯示：肥大細(xì)胞胞漿呈黃色至棕黃色陽(yáng)性顆粒，界限清楚，背景清晰。肥大細(xì)胞主要存在于大鼠鼻黏膜組織黏膜及黏膜下層，部分肌層亦見(jiàn)表達(dá)，以前二者為主要表達(dá)部位。對(duì)照組高倍鏡（200倍）視野下平均肥大細(xì)胞數(shù)為（28.60±4.50）個(gè)，與對(duì)照組比較，AR模型組大鼠鼻黏膜組織內(nèi)肥大細(xì)胞蛋白表達(dá)增高，平均肥大細(xì)胞數(shù)為（59.60±8.80）個(gè)（P＜0.05）；各用藥組與AR模型組比較，肥大細(xì)胞數(shù)均有不同程度的下調(diào)，玉蟬衛(wèi)肺丸組為（44.80±6.10）個(gè)（P＜0.05），氯雷他定組為（48.10±5.30）個(gè)（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠鼻黏膜組織內(nèi)肥大細(xì)胞表達(dá)（免疫組化染色，200倍）

3 討 論

AR為非感染性的免疫炎癥疾病，流行病學(xué)調(diào)查顯示，全球40%的人口有AR相關(guān)癥狀，已成為全球性的健康問(wèn)題［7］。近年來(lái)我國(guó)AR患病率急劇上升，標(biāo)準(zhǔn)化患病率從2005年的11.1%上升到2011年的17.6%［8］。

變應(yīng)性鼻炎屬于Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)，機(jī)體在外界抗原的刺激下，誘導(dǎo)鼻黏膜或者局部淋巴組織產(chǎn)生過(guò)多的IgE，可與相應(yīng)細(xì)胞（主要為肥大細(xì)胞）表面的IgE受體結(jié)合，活化肥大細(xì)胞分泌組胺或白三烯等炎性介質(zhì)。這些炎癥介質(zhì)誘導(dǎo)黏膜上皮細(xì)胞或者血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌細(xì)胞因子、趨化分子及黏附分子，不僅造成炎癥的進(jìn)一步加劇，而且還可以趨化募集并活化嗜酸粒細(xì)胞及Th2細(xì)胞［9］。最新的研究發(fā)現(xiàn)，肥大細(xì)胞在AR的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中不僅僅是分泌炎癥介質(zhì)的“效應(yīng)劑”，它與鼻黏膜上皮細(xì)胞［10］以及神經(jīng)細(xì)胞［11］可存在交互作用，在調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞完整性及神經(jīng)敏感性方面都發(fā)揮相關(guān)作用。因此，血清IgE水平、嗜酸粒細(xì)胞及肥大細(xì)胞數(shù)量均為衡量AR嚴(yán)重程度的關(guān)鍵指標(biāo)。筆者實(shí)驗(yàn)顯示：玉蟬衛(wèi)肺丸和氯雷他定能顯著降低AR大鼠血清IgE水平，抑制嗜酸粒細(xì)胞及肥大細(xì)胞的活化與增生；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，玉蟬衛(wèi)肺丸組在降低AR大鼠嗜酸粒細(xì)胞及肥大細(xì)胞數(shù)量方面優(yōu)于氯雷他定組。

AR主要病理變化為黏膜上皮變性、損傷，黏膜下腺體增生，毛細(xì)血管擴(kuò)張、出血、水腫，神經(jīng)纖維增生活化及間質(zhì)炎癥等［12］。其中，上皮、血管及神經(jīng)病變是造成鼻塞、鼻癢及流涕的病理基礎(chǔ)，而反復(fù)炎癥及修復(fù)的過(guò)程會(huì)刺激鼻腔黏膜發(fā)生鼻息肉、鼻竇炎。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，玉蟬衛(wèi)肺丸可以修復(fù)鼻黏膜上皮損傷，減緩黏膜下腺體及血管增生，減少水腫，控制炎癥，有效改善鼻黏膜組織損傷，糾正疾病狀態(tài)。

AR在中醫(yī)學(xué)屬于“鼻鼽”范疇，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為鼻鼽的發(fā)生因虛致病者為多，內(nèi)因多為臟腑功能失調(diào)，外因寒邪和異氣之邪為其誘發(fā)因素，主要與肺、脾、腎諸臟有關(guān)。玉蟬衛(wèi)肺丸經(jīng)過(guò)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院耳鼻喉科幾代人的臨床驗(yàn)證，取得了較好療效，得到廣大患者認(rèn)可。其成分為黃芪、玉竹、蟬蛻、防風(fēng)、白蒺藜、辛夷、白芷等。方中君藥為黃芪、玉竹，臣藥為蟬蛻、防風(fēng)，黃芪、玉竹有補(bǔ)益肺脾，提高機(jī)體免疫力的作用，蟬蛻、防風(fēng)、蒺藜可疏散風(fēng)邪、息風(fēng)止痙，有抑制免疫與抗過(guò)敏作用，全方可改善臟腑功能，外散風(fēng)邪［13-14］。

綜上所述，玉蟬衛(wèi)肺丸可以減輕AR大鼠鼻黏膜組織破壞，降低血清IgE水平，減少嗜酸粒細(xì)胞及肥大細(xì)胞的趨化，顯著改善AR大鼠的炎癥及損傷，初步證明了其對(duì)肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞有廣譜抑制活性，可認(rèn)為其是抵抗抗原誘導(dǎo)的氣道炎癥反應(yīng)的有效保護(hù)劑。本研究提供了玉蟬衛(wèi)肺丸針對(duì)AR西醫(yī)學(xué)的病因治療的理論基礎(chǔ)。但在AR研究方面仍有許多值得研究的領(lǐng)域，如中藥改善鼻黏膜組織損傷的具體分子機(jī)制，抑制肥大細(xì)胞活化的作用方式？肥大細(xì)胞與鼻黏膜上皮之間是否存在交互作用？這些具體的作用機(jī)制還需要我們做進(jìn)一步的深入研究。