李 鵬 金文琪 李小嘉 丁旭楓 朱煜璋 楊 鏞 郭修田

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院，上海 200071）

大便失禁是指機(jī)體對(duì)液體、固體內(nèi)容物以及氣體的蓄控能力的降低或喪失，不能隨意控制內(nèi)容物的溢出，導(dǎo)致大便次數(shù)增多，輕者糞便污染內(nèi)褲，重者完全排出。肛門括約肌損傷引起的結(jié)構(gòu)和功能的破壞會(huì)導(dǎo)致大便失禁，它不僅給患者帶來(lái)極大的痛苦及心理障礙，還會(huì)嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。大便失禁影響著5.9%的人口，隨著年齡的增加失禁的風(fēng)險(xiǎn)逐漸增大［1］。雖然目前對(duì)于大便失禁的治療方法多種多樣，包括飲食療法、口服藥物、膨脹劑注射、盆底神經(jīng)刺激，生物反饋甚至手術(shù)治療等［2］，但是隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，復(fù)發(fā)率卻逐年增高，療效均不理想，使患者的身體及心理上的創(chuàng)傷也被放大，嚴(yán)重影響日常生活。

干細(xì)胞的多向分化潛能、歸巢機(jī)制、分泌生物活性因子等優(yōu)勢(shì)使其在組織修復(fù)再生醫(yī)學(xué)中發(fā)揮著重要作用［3］。在一些動(dòng)物及臨床研究中，細(xì)胞療法與生物工程技術(shù)作為一種無(wú)創(chuàng)的治療手段已應(yīng)用于肛門括約肌組織的修復(fù)與再生［4］。但是許多研究也證實(shí)經(jīng)靜脈注射的間充質(zhì)干細(xì)胞出現(xiàn)在肺脾腎分布，大部分被清除，只有少部分可到達(dá)損傷部位。筆者前期研究證實(shí)溫和灸不僅可促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的歸巢［5］，還可調(diào)節(jié)大鼠肛瘺術(shù)后創(chuàng)面組織局部血流、肉芽組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)從而促進(jìn)組織修復(fù)［6］。因此，筆者將溫和灸與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）移植聯(lián)合應(yīng)用于大鼠損傷的肛門括約肌，觀察不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)對(duì)損傷括約肌結(jié)構(gòu)和功能的修復(fù)效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SD雌性大鼠120只，年齡約12周，體質(zhì)量200～250 g，SPF級(jí)，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002。大鼠BMSC制備方法：麻醉大鼠后，穿刺股骨骨髓腔抽取骨髓，DMEM-F12稀釋后接種在DF-12胎牛血清培養(yǎng)液中，并放入37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3天更換新鮮培養(yǎng)基。收集第三代消化后含有1×107的細(xì)胞懸液備用。

1.2 試藥與儀器［1］干細(xì)胞培養(yǎng)基及胎牛血清均選用Gibco公司的試劑（DMEM/F-12培養(yǎng)基，型號(hào)：12660-012；胎牛血清，型號(hào)：10091-148），鹽酸布比卡因選用山東華魯制藥有限公司，型號(hào)為H37022106，Masson染色試劑盒購(gòu)于Baso公司（型號(hào)：BA4079A，BA4079B）。艾條選用佛山市艾傳醫(yī)療器械有限公司（李時(shí)珍蘄艾條，型號(hào)：1.8 cm×20 cm）。顯微鏡分別采用德國(guó)OLYMPUS解剖顯微鏡（型號(hào)：CX23）及激光共聚焦顯微鏡（型號(hào)：OLS5000），肛壓檢測(cè)采用成都儀器廠出產(chǎn)的多道信息采集處理系統(tǒng)（型號(hào)：RM6240BDJ型），大鼠球囊檢測(cè)裝置采用專利（專利號(hào)：ZL 2018 2 0913781.7）。

1.3 分組與造模 健康SD雌性大鼠120只隨機(jī)分為5組，每組24只，分別為空白對(duì)照組、溫和灸加干細(xì)胞組、干細(xì)胞組、溫和灸組與假手術(shù)組。各組大鼠肛門括約肌損傷均采用Zusthi模型，在腹腔麻醉后，于解剖顯微鏡下進(jìn)行大鼠腹側(cè)縱行切除25%的肛門括約肌復(fù)合體，即切除10點(diǎn)位到2點(diǎn)位之間的括約肌復(fù)合體，術(shù)后采用壓迫止血及布比卡因（0.5 mg/kg）鎮(zhèn)痛。所有需采用干細(xì)胞及溫和灸治療的組別均采用以上方式治療，其中空白對(duì)照組大鼠不做任何治療；溫和灸加干細(xì)胞組大鼠在干細(xì)胞注射完成后立即進(jìn)行溫和灸治療；干細(xì)胞組大鼠僅局部注射0.3 mL PBS(含107個(gè)BMSCs)；溫和灸組大鼠僅采用溫和灸局部治療15 min；假手術(shù)組僅造模，不做任何治療。

1.4 干預(yù)方法 干細(xì)胞注射：在大鼠括約肌損傷處及缺損兩側(cè)斷端邊緣直接注射，共0.3 mL PBS（含107個(gè)BMSCs），每個(gè)部位1/3細(xì)胞量。溫和灸治療：將點(diǎn)燃的蘄艾條放置距大鼠肛門約2 cm溫和灸大鼠肛門局部創(chuàng)面，治療15 min。所有治療均從造模后第1日開始，每日1次，連續(xù)7 d?？瞻讓?duì)照組：不做任何治療。溫和灸加干細(xì)胞組：在大鼠括約肌損傷處基底部及兩側(cè)斷端各注射0.1 mL PBS（共0.3 mL PBS，含107個(gè)BMSCs），然后將點(diǎn)燃的艾條直對(duì)干細(xì)胞注射處（即括約肌損傷處）進(jìn)行治療，時(shí)間15 min，每日1次，連續(xù)7 d。干細(xì)胞組：僅在大鼠括約肌損傷處基底部與兩側(cè)斷端各注射0.1 mL PBS（共0.3 mL PBS，含107個(gè)BMSCs），每日1次，連續(xù)7 d。溫和灸組：將點(diǎn)燃的艾條放置于距括約肌損傷處2 cm的部位進(jìn)行局部治療，時(shí)間為15 min，每日1次，連續(xù)7 d。假手術(shù)組：僅造模，不做任何治療。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）大鼠肛門括約肌功能檢測(cè)：包括靜息壓、收縮壓與肌電振幅、頻率，均在造模后7、14、28 d進(jìn)行測(cè)定。采用多道信息采集處理系統(tǒng)的不同檢測(cè)模塊，記錄并分析不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)各組的功能指標(biāo)。在大鼠腹腔注射麻醉后，將1個(gè)特制的球囊潤(rùn)滑后完全放入大鼠肛內(nèi)以進(jìn)行括約肌壓力檢測(cè)，球囊插入深度為球囊淹沒后0.5 cm，球囊連接注射器與采集處理系統(tǒng)，每次注水0.8 mL擴(kuò)張球囊以檢測(cè)肛壓。選取壓力通道，設(shè)置參數(shù)后每只大鼠檢測(cè)時(shí)間為波形穩(wěn)定后15 min。保存所有文件，分別選取穩(wěn)定波峰及基線值記錄為收縮壓與靜息壓。檢測(cè)肌電，將兩只30號(hào)US53153型同軸電針?lè)謩e插在大鼠肛門3、9點(diǎn)位，深度約0.4 cm，電極夾連接采集系統(tǒng)，選取生物肌電模式進(jìn)行檢測(cè)。設(shè)置參數(shù)后每只大鼠檢測(cè)時(shí)間為波形穩(wěn)定后15 min。保存所有采集文件，為了定量肛門括約肌EMG動(dòng)作電位的振幅和頻率，在每個(gè)節(jié)點(diǎn)的檢測(cè)波形中隨機(jī)選取5個(gè)5 s的時(shí)間間隔計(jì)算平均值，并設(shè)定一個(gè)高于噪音但低于動(dòng)作電位的臨界值以定量動(dòng)作電位的頻率。統(tǒng)計(jì)波形穿過(guò)此閾值的動(dòng)作電位的振幅和頻率。2）組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)：麻醉處死大鼠，解剖顯微鏡下剝離肛門括約?。ň嚯x肛緣0.5～1 cm），制作為石蠟切片并進(jìn)行Masson染色。染色完畢后采用共聚焦顯微鏡掃描全部組織。采用Image J進(jìn)行肌肉及膠原纖維定量分析以比較各組的差異。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS21進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有計(jì)量資料都進(jìn)行正態(tài)性與方差齊性檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)一以（）表示。若資料滿足正態(tài)性、方差齊性與“球?qū)ΨQ”假設(shè)，采用重復(fù)測(cè)量資料的方差分析。采用one-way ANOVA聯(lián)合組間比較檢驗(yàn)評(píng)價(jià)各組之間的差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肛門括約肌壓力值比較 見表1。術(shù)后第7天，3組治療組的收縮壓均顯著高于假手術(shù)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但治療組組間無(wú)顯著差異。術(shù)后14 d，溫和灸加干細(xì)胞組的收縮壓顯著高于其他兩治療組，具有顯著差異（P＜0.05），但干細(xì)胞組與溫和灸組之間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。術(shù)后28 d靜息壓均較術(shù)后14 d增高，且溫和灸加干細(xì)胞組仍顯著高于干細(xì)胞組、溫和灸組、假手術(shù)組3組（P＜0.05），但干細(xì)胞組、溫和灸組兩組間仍無(wú)顯著差異（P＞0.05）。在術(shù)后14 d時(shí)，干細(xì)胞組、溫和灸組、假手術(shù)組、溫和灸加干細(xì)胞組4組的靜息壓均較前增高，此時(shí)所有治療組肛管靜息壓均顯著高于假手術(shù)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但3組治療組組間仍無(wú)顯著差異（P＞0.05）。在術(shù)后28 d時(shí)，溫和灸+干細(xì)胞組的靜息壓雖顯著高于干細(xì)胞組與溫和灸組，但卻仍低于空白對(duì)照組。

表1 各組大鼠肛管收縮壓與靜息壓比較（mmHg，±s）

表1 各組大鼠肛管收縮壓與靜息壓比較（mmHg，±s）

與假手術(shù)組同期比較，*P＜0.05；與干細(xì)胞組、溫和灸組同期比較，#P＜0.05。下同

組別空白對(duì)照組（n=24）溫和灸加干細(xì)胞組（n=24）干細(xì)胞組（n=24）溫和灸組（n=24）假手術(shù)組（n=24）肛管靜息壓8.43±0.43 8.49±0.43 8.54±0.55 6.58±0.39 7.42±0.58*8.07±0.43*#6.21±0.89 7.08±0.32*7.57±0.62 6.26±0.84 7.03±0.83*7.53±0.49 6.17±0.57 6.32±0.36 6.96±0.67時(shí)間術(shù)后7 d術(shù)后14 d術(shù)后28 d術(shù)后7 d術(shù)后14 d術(shù)后28 d術(shù)后7 d術(shù)后14 d術(shù)后28 d術(shù)后7 d術(shù)后14 d術(shù)后28 d術(shù)后7 d術(shù)后14 d術(shù)后28 d肛管收縮壓12.40±0.79 12.30±0.64 12.30±0.70 7.98±0.63*9.69±0.46*#11.40±0.84*#7.89±0.69*8.79±0.27 10.30±0.77 7.95±0.62*8.71±0.44 10.60±0.86 7.19±0.48 8.28±0.39 9.65±0.44

2.2 各組大鼠肛門括約肌肌電指標(biāo)比較 見表2。在術(shù)后14 d時(shí)，3組治療組的肌電振幅顯著假手術(shù)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在術(shù)后28 d時(shí)，溫和灸加干細(xì)胞組的振幅顯著高于干細(xì)胞及溫和灸組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但仍低于空白組，此時(shí)干細(xì)胞與溫和灸組仍無(wú)明顯差異（P＞0.05）。術(shù)后14 d，干細(xì)胞組、溫和灸組、假手術(shù)組3組的肌電頻率均顯著高于假手術(shù)組，并且溫和灸加干細(xì)胞組肌電頻率顯著高于干細(xì)胞組及溫和灸組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。并且這種差異一直持續(xù)到術(shù)后28 d。在術(shù)后28 d時(shí)，雖然溫和灸加干細(xì)胞組肌電頻率顯著高于其他治療組，但仍低于空白組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 各組大鼠肛門括約肌肌電指標(biāo)比較（±s）

表2 各組大鼠肛門括約肌肌電指標(biāo)比較（±s）

組 別 時(shí) 間 肌電振幅 肌電頻率空白對(duì)照組（n=24）溫和灸加干細(xì)胞組（n=24）干細(xì)胞組（n=24）溫和灸組（n=24）假手術(shù)組（n=24）術(shù)后7 d術(shù)后14 d術(shù)后28 d術(shù)后7 d術(shù)后14 d術(shù)后28 d術(shù)后7 d術(shù)后14 d術(shù)后28 d術(shù)后7 d術(shù)后14 d術(shù)后28 d術(shù)后7 d術(shù)后14 d術(shù)后28 d 145±10.31 145±11.02 145±11.10 88.9±8.47 113±9.16*138±10.11*#88.4±5.27 110±6.01*132±10.9 88.7±6.98 111±6.34*129±9.81 87.4±6.53 103±8.75 120±6.11 40.9±3.01 41.2±3.25 41.5±2.93 17.3±4.68 27.8±0.86*#37.2±1.77*#17.5±3.01 23.8±1.47*31.9±3.57 17.8±2.83 23.6±2.12*32.3±0.67 17.3±1.33 20.2±1.41 26.5±0.60

2.3 各組大鼠肛門括約肌組織形態(tài)學(xué)檢測(cè) 見表3，圖1。在術(shù)后28 d時(shí)，Masson染色證實(shí)所有組別均仍有不同程度的環(huán)形缺損，但溫和灸加干細(xì)胞組已非常接近完整的環(huán)形，它的缺損面積明顯小于其他組別，缺損部位含有更多紅染的新生肌纖維，而C、D、E 3組缺損部位均顯示更多藍(lán)染的膠原纖維。定量分析肌肉面積百分比：溫和灸加干細(xì)胞組肌肉比例顯著高于其余3組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但仍低于空白組（P＜0.05）。

表3 各組大鼠術(shù)后28 d肛門肌肉面積百分比（%）

圖1 各組造模后28 dMasson染色全景圖

3 討 論

組織的結(jié)構(gòu)與功能相輔相成，結(jié)構(gòu)的完整才能保證功能的正常行使，功能的正常依賴于完整的結(jié)構(gòu)，肛門括約肌亦是如此。作為協(xié)調(diào)排便機(jī)制中的一種，肛門括約肌結(jié)構(gòu)或功能的破壞會(huì)影響腸內(nèi)容物的正常排出，而肛門括約肌的結(jié)構(gòu)和功能則需要肌肉和神經(jīng)的完整性，其中肛門括約肌損傷引起的大便失禁最為普遍。近年來(lái)，干細(xì)胞在組織修復(fù)與再生醫(yī)學(xué)方面的研究日新月異，因其多向分化潛能、旁分泌潛能、免疫調(diào)節(jié)與抑制潛能、便捷的分離與擴(kuò)增等四大特性廣泛應(yīng)用于各種組織工程學(xué)研究［7-9］。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為成體干細(xì)胞中的一種，在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域受到廣泛重視［10-11］。雖然干細(xì)胞對(duì)大鼠損傷肛門括約肌的顯著的修復(fù)效果，但不同的研究結(jié)果差異較大。近年來(lái)許多研究證實(shí)移植的干細(xì)胞在創(chuàng)面的存活率與定植率并不能達(dá)到滿意的效果，而經(jīng)靜脈注射的間充質(zhì)干細(xì)胞出現(xiàn)在肺脾腎分布，大部分被清除，只有少部分可到達(dá)損傷部位，嚴(yán)重影響創(chuàng)面的修復(fù)作用。因此許多學(xué)者采用不同的方法以促進(jìn)干細(xì)胞在創(chuàng)面的定植與存活率，包括與其他細(xì)胞共培養(yǎng)，生物材料或機(jī)械應(yīng)力的使用等［12-17］。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為創(chuàng)面愈合的根本為正氣虛損，而溫和灸具有溫通氣血、扶正祛邪的功效，而且我們前期研究證實(shí)溫和灸不僅能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向損傷部位歸巢［5］，還可調(diào)節(jié)大鼠肛瘺術(shù)后創(chuàng)面組織局部血流、肉芽組織中VEGF的表達(dá)從而促進(jìn)組織修復(fù)。

因此，基于溫和灸的溫通效應(yīng)及歸巢機(jī)制，我們將溫和灸與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植聯(lián)合應(yīng)用于大鼠損傷的肛門括約肌，發(fā)現(xiàn)溫和灸聯(lián)合干細(xì)胞不僅可顯著促進(jìn)大鼠肛門括約肌肛壓與肌電的恢復(fù)，還能促進(jìn)肛門括約肌缺損部位肌肉新生及環(huán)形結(jié)構(gòu)的恢復(fù)，從組織結(jié)構(gòu)和功能兩方面研究證實(shí)溫和灸加干細(xì)胞移植顯著優(yōu)于單純干細(xì)胞移植與溫和灸治療。但本研究也存在一些缺陷，由于觀察節(jié)點(diǎn)（28 d）的限制，所有治療組肛門括約肌組織均未恢復(fù)為正常的完整環(huán)形組織，雖然溫和灸+干細(xì)胞組大鼠的肛門括約肌趨于完整的環(huán)形組織，但仍有部分缺損，這可能也是導(dǎo)致治療組肛壓與肌電低于空白對(duì)照組的主要原因。但無(wú)論從功能性指標(biāo)，抑或是組織形態(tài)學(xué)來(lái)分析，溫和灸與干細(xì)胞移植聯(lián)合應(yīng)用的治療效果顯著高于其他治療組別。但是其中的機(jī)制是否與溫和灸促進(jìn)干細(xì)胞的定植或分化，抑或與增強(qiáng)干細(xì)胞旁分泌效果有關(guān)仍未可知，未來(lái)仍需要更多更深入的實(shí)驗(yàn)探索其相關(guān)機(jī)制。