邱 冬，吳 坤，徐小艷，董永毅，蔣彩霞，朱水明，楊 楊，胡圣林

（1.江蘇省動物疫病預(yù)防控制中心，江蘇南京 210036；2.鎮(zhèn)江市動物疫病預(yù)防控制中心，江蘇鎮(zhèn)江 212000；3.句容市畜牧獸醫(yī)站，江蘇句容 212400）

小鵝瘟（gosling plague）是由鵝細(xì)小病毒（goose parvovirus，GPV）引起的雛鵝的一種急性或亞急性敗血性傳染病[1]。病雛鵝臨診表現(xiàn)為精神萎頓、食欲廢絕、嚴(yán)重下痢，有時(shí)出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，病死率高。本病傳播快，發(fā)病率和死亡率均可高達(dá)90%～100%，是嚴(yán)重危害養(yǎng)鵝業(yè)的重要傳染病之一[2]。本病最早由方定一等[1]于1956年在揚(yáng)州發(fā)現(xiàn)，截至目前，國內(nèi)大多數(shù)養(yǎng)鵝地區(qū)均有發(fā)生。為了更好地防控小鵝瘟的發(fā)生，本研究針對水禽養(yǎng)殖場免疫程序，采用了3 種預(yù)防方案進(jìn)行雛鵝小鵝瘟防控，通過免疫抗體監(jiān)測，篩選出最佳的小鵝瘟防控方法，從而指導(dǎo)養(yǎng)殖戶科學(xué)防控。

1 材料與方法

1.1 疫苗與卵黃抗體

小鵝瘟活疫苗（SYG41-50雛鵝），購買自國藥集團(tuán)揚(yáng)州威克生物工程有限公司，生產(chǎn)批號Z0 718059；小鵝瘟病毒卵黃抗體（穩(wěn)康寧），購買自天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司空港經(jīng)濟(jì)區(qū)分公司，生產(chǎn)批號20190317。

1.2 試驗(yàn)動物

200 只1 日齡健康雛鵝，由江蘇省句容市馬里農(nóng)業(yè)生態(tài)園基地提供。試驗(yàn)鵝在試驗(yàn)前均未進(jìn)行小鵝瘟疫苗免疫。

1.3 瓊擴(kuò)試劑

優(yōu)質(zhì)瓊脂粉，購自O(shè)XIDE 分裝；小鵝瘟瓊擴(kuò)試驗(yàn)用抗原及陽性血清國家參考品，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.4 試驗(yàn)分組

試驗(yàn)鵝（1 日齡）隨機(jī)分成4 組，每組50 只。A 組為疫苗組，采用疫苗免疫，分別于1 日齡首免，7 日齡二免，其中首免0.1 mL/只，二免0.1 mL/只，皮下注射。B 組為卵黃抗體+疫苗組，即先注射卵黃抗體1 次，再免疫疫苗1 次，其中1 日齡肌內(nèi)注射GPV 卵黃抗體，0.5 mL/只，7 日齡皮下注射疫苗，0.1 mL/只。C 組為卵黃抗體組，分別于1 日齡、7 日齡注射卵黃抗體1 次，其中1 日齡0.5 mL/只，7 日齡1 mL/只，肌內(nèi)注射。D 組（對照組），既不免疫，也不注射卵黃抗體。

1.5 采樣方案

各組分別于免疫或注射抗體前和首免后第7、14、21、28 天采集血清，每組隨機(jī)采集10 只。同時(shí)每組在免疫前全部采集咽肛拭子樣品40 份。

1.6 檢測方法

1.6.1 瓊脂板配制 在100 mL 8% 氯化鈉溶液中加入1.0 g 優(yōu)質(zhì)瓊脂糖，加熱溶化后，再加入0.01%的硫柳汞，澆制凝膠板（約3 mm 厚，15～18 mL）。按六角形打孔，孔徑為5.0 mm，孔距為3.0 mm。

1.6.2 血清稀釋 將待檢血清用生理鹽水進(jìn)行2倍系列稀釋，最高稀釋度為1:64。

1.6.3 加樣 中央孔加入小鵝瘟瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)抗原，周圍孔分別依次加入各稀釋度抗體、陽性血清和陰性血清，加量以孔滿為度。加樣后置35～37 ℃濕盒中孵育，24、48 h 各觀察1 次，并于48 h 判定結(jié)果。

1.6.4 抗體檢測結(jié)果判定 采用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測待檢血清的效價(jià)，判定標(biāo)準(zhǔn)為：待陽性血清與抗原孔之間出現(xiàn)明顯沉淀線，陰性血清與抗原孔之間無沉淀線，待檢血清與抗原孔之間出現(xiàn)沉淀線的最大稀釋倍數(shù)即為抗體效價(jià)。小鵝瘟瓊擴(kuò)抗體效價(jià)不低于1:4 判為免疫合格[4]。

1.6.5 病原檢測 應(yīng)用熒光定量PCR 對拭子樣品進(jìn)行GPV 檢測。反應(yīng)體系為：SYBR Green PCR Master Mix 12.5 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、模板1 μL，最后加去離子水補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性15 s，53 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，共40 個(gè)循環(huán)。當(dāng)Ct ≤40 時(shí)，判為陽性，反之為陰性[3]。

2 結(jié)果

2.1 抗體效價(jià)檢測

瓊擴(kuò)抗體效價(jià)顯示：3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組在免疫后第7 天，抗體效價(jià)陽性率均≥70%，平均效價(jià)（log2）≥2.2，且B 組和C 組的抗體平均效價(jià)均高于A 組。在免疫后第14 天，B 組抗體平均效價(jià)出現(xiàn)明顯下降，均低于A 組和C 組，且A 組和C 組平均抗體效價(jià)較第7 天穩(wěn)步上升。在第21～28 天，A 組和B 組保持較高的平均抗體水平，而C 組抗體效價(jià)下降較快，平均效價(jià)（log2）降為1.1。整體來看，第7～28 天，A 組抗體平均效價(jià)逐漸上升，后期陽性率維持在100%。B 組抗體平均效價(jià)先上升后下降再上升，在第14 天出現(xiàn)低谷，陽性率降為40%。C 組抗體平均效價(jià)先逐步上升后直線下降，在第28 天達(dá)到最低，陽性率降為30%。對照組抗體平均效價(jià)無變化，基本為0。具體結(jié)果見表1。

表1 雛鵝抗體檢測結(jié)果

2.2 GPV 檢測

免疫前40 份拭子樣品經(jīng)小鵝瘟熒光PCR 檢測均為陰性，表明試驗(yàn)鵝無GPV 感染。

3 討論

免疫小鵝瘟疫苗和注射卵黃抗體7 天后可產(chǎn)生較高的抗體滴度，均可對雛鵝產(chǎn)生保護(hù)性，但是從試驗(yàn)結(jié)果來看，卵黃抗體維持的高水平時(shí)間較短，需要連續(xù)多次注射，隨著雛鵝生長日齡增加，其自身抵抗力增強(qiáng)，小鵝瘟發(fā)病率顯著降低[5]。使用小鵝瘟疫苗兩免與卵黃抗體+疫 苗聯(lián)合免疫相比，疫苗兩免可以保護(hù)雛鵝產(chǎn)生持續(xù)的較高濃度的抗體，而注射卵黃抗體后再注射疫苗，中間會出現(xiàn)窗口期，若雛鵝此時(shí)感染GPV，則不能產(chǎn)生有效抗體保護(hù)。其原因可能是卵黃抗體對疫苗的干擾作用，使其不能快速產(chǎn)生抗體。連續(xù)兩次注射卵黃抗體，雖然可以對雛鵝產(chǎn)生有效保護(hù)，但需要多次注射，會增加鵝群的應(yīng)激反應(yīng)等。同時(shí)在給雛鵝進(jìn)行疫苗免疫注射時(shí)，要充分考慮鵝體內(nèi)的母源抗體干擾，有條件的養(yǎng)殖場可以通過母源抗體監(jiān)測來確定首免時(shí)間。

本研究選擇200 只1 日齡雛鵝進(jìn)行小鵝瘟疫苗免疫程序試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)小鵝瘟疫苗免疫和卵黃抗體注射均可對雛鵝產(chǎn)生較好的免疫保護(hù)效果。但先注射抗體再注射疫苗，在第14 天免疫鵝的抗體水平出現(xiàn)下降，表明1 次注射不能維持足夠時(shí)間的保護(hù)，需要進(jìn)行2 次注射。從本次試驗(yàn)結(jié)果來看，對于小鵝瘟預(yù)防提出如下建議：在沒有母源抗體保護(hù)的情況下，對于雛鵝小鵝瘟多發(fā)高發(fā)的地區(qū)和場群，建議采用1 日齡、7 日齡分別注射卵黃抗體加以預(yù)防，這樣可以保證雛鵝產(chǎn)生高水平抗體，使其在較小日齡能獲得充分保護(hù)，然后可結(jié)合抗體水平檢測，合理開展后續(xù)免疫。對于雛鵝發(fā)病日齡明顯增加，超過20日齡仍有發(fā)病的地區(qū)和場群，建議采用1日齡、7 日齡分別注射小鵝瘟疫苗加以防控，這樣小鵝能獲得長時(shí)間的高水平抗體，能充分保護(hù)其生長階段免受GPV 感染。同時(shí)還要看到，注射卵黃抗體后再接種疫苗，卵黃抗體會對疫苗產(chǎn)生較強(qiáng)的干擾作用，因此在實(shí)際應(yīng)用中須謹(jǐn)慎，以免造成免疫失敗。

實(shí)踐證明[5]，利用小鵝瘟活疫苗給成年母鵝進(jìn)行預(yù)防注射是預(yù)防本病最經(jīng)濟(jì)有效的方法。于產(chǎn)蛋前15 d 肌內(nèi)注射小鵝瘟種鵝用活疫苗1 mL（1羽份），母鵝于免疫后15～90 d 內(nèi)所產(chǎn)種蛋孵出的雛鵝在30 日齡之內(nèi)能抵抗GPV 強(qiáng)毒的自然感染和人工感染。