張 志，葛 棟，李翠翠，宮楓舉，孫學(xué)強(qiáng)

（1.青島立見診斷技術(shù)發(fā)展中心，山東青島 266114；2.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一種家豬和野豬烈性傳染病。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為須通報動物疫病，我國將其列為一類動物疫病[1]。ASF 病程短，發(fā)病率和死亡率高，病死率可達(dá)100%，給養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴(yán)重威脅。ASFV 在外界環(huán)境中存活能力較強(qiáng)，傳播途徑多樣，既可通過豬與豬、豬與蜱的直接接觸傳播，也可通過食物、糞便、運(yùn)輸工具、人員等間接傳播。豬感染ASFV 后很難產(chǎn)生有效的中和保護(hù)抗體，且目前尚無有效的疫苗可用，因此ASFV 核酸檢測是防控ASF 的主要措施之一。我國自2018 年首次暴發(fā)ASF 以來，養(yǎng)豬業(yè)損失重大，各地紛紛加強(qiáng)了ASFV 核酸檢測。一些檢測方法如熒光PCR、LAMP、試紙條等也開始用于ASFV 檢測[2]。其中，針對ASFV 核酸檢測的熒光PCR 方法，以其敏感、特異、快速、穩(wěn)定的優(yōu)點，在我國各級獸醫(yī)檢測實驗室、養(yǎng)豬場、屠宰場、第三方檢測機(jī)構(gòu)等廣泛應(yīng)用。與此同時，隨著ASFV 檢測強(qiáng)度增大和頻率增多，很多檢測實驗室陸續(xù)出現(xiàn)熒光PCR檢測結(jié)果“假陽性、假陰性”問題，嚴(yán)重干擾了正常的檢測工作。這些問題或多或少與檢測實驗室的質(zhì)量管理有關(guān)。本文根據(jù)全面質(zhì)量管理理論[3]和《ISO/IEC17025 校準(zhǔn)和檢測實驗室管理體系》，結(jié)合部分ASF 檢測實驗室的實際情況，總結(jié)了目前ASFV 熒光PCR 檢測過程中遇到的問題，從全面質(zhì)量管理理論的“人、機(jī)、料、法、環(huán)”[4]等環(huán)節(jié)，進(jìn)行了詳細(xì)闡述和剖析，并逐項提出了相應(yīng)的改進(jìn)措施或解決方案，以期為相關(guān)從業(yè)部門開展ASFV檢測提供參考。

1 人員

在影響ASFV 檢測結(jié)果的所有因素中，人是最關(guān)鍵的，是起到?jīng)Q定性作用的因素。ASFV 檢測的任何環(huán)節(jié)，不管是樣品采集、運(yùn)輸、滅活、預(yù)處理、核酸提取，還是熒光PCR 擴(kuò)增體系配制、反應(yīng)程序設(shè)置、結(jié)果判定和分析等，都離不開檢測人員的參與。檢測人員的基本素質(zhì)和操作技能直接決定了檢測質(zhì)量。檢測人員在任何環(huán)節(jié)出現(xiàn)失誤，都有可能導(dǎo)致檢測失敗，因此對檢測人員提出了較高的要求：一是在思想上要樹立“規(guī)范操作、防止污染”的理念，深刻認(rèn)識“操作不規(guī)范，核酸就會無處不在”的現(xiàn)象，從而在操作上嚴(yán)格要求自己；二是從制度上要加強(qiáng)采樣和檢測人員管理，設(shè)立ASFV 核酸檢測崗位，制定檢測規(guī)程，提出檢測技能操作要求，建立崗位和人員考核制度，定期對相關(guān)人員開展考核，考核合格者方可上崗；三是要對采樣和檢測人員定期開展ASF 檢測培訓(xùn)，強(qiáng)化其試驗操作技能，提升其理論水平，規(guī)范其操作流程，使其熟悉法律法規(guī)，能夠解決工作中經(jīng)常遇到的問題；四是要在不同檢測人員甚至實驗室之間定期開展檢測能力比對，通過不同人員和實驗室的檢測比對尋找差距，從而提高整體檢測水平。

2 儀器設(shè)備

ASFV 熒光PCR 檢測涉及的儀器有熒光PCR儀、組織勻漿機(jī)、離心機(jī)、移液器、生物安全柜等。在處理樣品和加樣過程中，這些儀器都存在一定的污染或交叉感染風(fēng)險。這些儀器設(shè)備在使用過程中可能存在的主要問題有：

一是熒光PCR 儀的精確性問題。熒光PCR 儀是檢測的最關(guān)鍵儀器，其精度高、儀器元件精細(xì)，但出現(xiàn)問題的類型復(fù)雜多樣，既有硬件問題，也有軟件問題。硬件問題有：熒光PCR 儀濾鏡污漬導(dǎo)致光路強(qiáng)度下降、燈源效能降低，加熱槽個別孔污物過多導(dǎo)致受熱不均或出現(xiàn)邊緣效應(yīng)等；軟件問題有：吸光值不高、擴(kuò)增曲線不典型、出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增、樣品全部為陰性等[5]。為確保 PCR 儀檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠，必須定期對熒光PCR 進(jìn)行校準(zhǔn)；檢測實驗室可以根據(jù)發(fā)布的《聚合酶鏈反應(yīng)分析儀校準(zhǔn)規(guī)范》（JJF1527—2015）[6]，對實驗室的實時熒光PCR 儀溫度和光學(xué)系統(tǒng)定期進(jìn)行校準(zhǔn)[7]，或者采用商品化的PCR 儀校準(zhǔn)品試劑進(jìn)行校準(zhǔn)，以保障熒光PCR 硬件正常運(yùn)行。解決熒光PCR 軟件方面的問題主要注意以下幾點：循環(huán)段與恒溫段起始溫度位置是否正確，各個階段的溫度與時間是否正確，熒光信號設(shè)置的采集點是否合適，所采集的熒光信號是否與說明書一致，實時熒光PCR 反應(yīng)結(jié)束后是否設(shè)置了無效基線范圍[8]。這些因素必須逐項檢查，一一排除。

二是生物安全柜、離心機(jī)和核酸提取儀操作問題。這些設(shè)備如果操作不當(dāng)，也會形成氣溶膠，導(dǎo)致樣品之間發(fā)生交叉污染。發(fā)生氣溶膠污染以后，要盡快通風(fēng)，增加通風(fēng)頻次和通風(fēng)強(qiáng)度，開啟紫外燈，照射時間延至2 h 以上，同時用1%～2%的84消毒液進(jìn)行消毒處理，讓機(jī)體或腔體中的氣溶膠成分充分降解，避免污染不斷擴(kuò)大。

三是移液器腔體的交叉污染問題。檢測人員在使用移液器時，移液器的彈簧反復(fù)上下移動而吸取液體，一旦存在陽性樣品，就容易在腔體內(nèi)形成氣溶膠，然后在吸取另外一份樣品時造成交叉感染。因此，應(yīng)定期開展移液器檢測，一旦發(fā)現(xiàn)存在污染就要立即采取84 消毒液擦洗等相應(yīng)措施，并用樣品再次進(jìn)行驗證。

3 檢測物料

檢測物料包括檢測樣品（含樣品采集和處理）、耗材以及其他輔助用料。這些物料選擇不當(dāng)，也會引起檢測結(jié)果的“假陰性”和“假陽性”問題。相應(yīng)的解決方法為：

首先，樣品的采集和處理要合理。樣品采集盡管不屬于實驗室檢測環(huán)節(jié)，但樣品采集的好壞直接影響后續(xù)檢測試驗的進(jìn)行。檢測ASF 可供采集的樣品種類較多，既可以是抗凝血、血漿、血清、血塊，也可以是淋巴結(jié)、肝臟、腎臟等組織臟器，甚至是口鼻分泌物、糞便樣品以及環(huán)境樣品等。不管采樣時選擇哪一種樣品，總的原則是選擇代表性樣品，且不能在采樣中引入影響熒光PCR 擴(kuò)增的物質(zhì)。如：在采集豬的全血時，抗凝劑就不能用肝素，因為肝素會強(qiáng)烈抑制PCR 反應(yīng)，造成假陰性，所以可以選擇EDTA 鈉鹽；采集唾液樣品時，要加入DNA 酶抑制劑，且樣品采集后應(yīng)迅速凍存，以免唾液中的酶破壞和降解病毒核酸。

其次，選擇的檢測耗材要合適。檢測中常用的吸頭、離心管、熒光PCR 管等耗材，材質(zhì)不同，質(zhì)量也參差不齊，有些劣質(zhì)的吸頭上含有PCR 抑制劑，可能導(dǎo)致PCR 出現(xiàn)假陰性，有的吸頭表面粗糙，容易殘留液體，移液過程可能導(dǎo)致加樣量不準(zhǔn)，影響熒光PCR 反應(yīng)。有條件的實驗室可以選擇帶濾芯以及無DNA 酶和RNA 酶的一次性耗材，這樣可以避免吸取液體時發(fā)生氣溶膠的交叉污染以及耗材的不均一性對PCR 檢測結(jié)果的影響等。

最后，選擇的輔助用料應(yīng)不影響檢測。如：熒光PCR 反應(yīng)管/反應(yīng)板的選擇要考慮儀器的匹配性，不同型號熒光PCR 儀使用的PCR 管有所差異，有使用100 μL 的，也有200 μL 的，還有兩種型號都使用的；另外，兩種型號PCR 反應(yīng)管的反應(yīng)蓋帽也有差異，如果不能良好配套，就可能導(dǎo)致PCR 管蓋帽多余部分被105 ℃高溫的PCR 儀熱蓋熔化[8]。除此，熒光PCR 儀器的光路有頂部采光、側(cè)面采光和底部采光等多種方式，所以應(yīng)選擇與該儀器匹配的PCR 管。

4 檢測方法

ASFV 熒光PCR 檢測方法包括ASFV 核酸提取和熒光PCR 擴(kuò)增兩個主要步驟。核酸提取方法很多，包括濃鹽法、陰離子去污劑法、苯酚抽提法、柱式法和磁珠法等，不同的提取方法對檢測結(jié)果有顯著影響。濃鹽法、陰離子去污劑法、苯酚抽提法無需特殊儀器，但操作繁瑣，且提取核酸的質(zhì)量不高，現(xiàn)在很少使用；柱式提取法和磁珠法的提取效率差別不大，但柱式提取適用于小型實驗室或樣品數(shù)量不多時使用，磁珠法更適用于自動化操作，還可避免柱式提取容易形成氣溶膠污染的風(fēng)險，但需要購買磁珠法對應(yīng)的核酸提取儀器。不同的實驗室可根據(jù)自身檢測目的、樣品種類、檢測數(shù)量、人員素質(zhì)、實驗室硬件等綜合考慮選擇適合的提取方法。除核酸提取方法以外，熒光PCR 擴(kuò)增也非常重要。自2018 年底中國動物疫病預(yù)防控制中心第一批ASFV 快速檢測試劑盒比對公布以來，國內(nèi)已有數(shù)十家生產(chǎn)廠商取得比對認(rèn)可，有的廠家已經(jīng)獲得農(nóng)業(yè)農(nóng)村部批準(zhǔn)，這些廠家均可以提供ASFV熒光PCR 檢測試劑盒。因此，用戶在選擇檢測試劑盒時絕不能貪圖便宜選擇一些“三無”產(chǎn)品，特別要避免使用偽劣、過期或失效試劑盒。另外，熒光PCR 方法極其敏感，用戶在使用熒光PCR 檢測試劑盒時要仔細(xì)對照試劑盒的說明書操作，每次使用時應(yīng)將試劑盒置于冰上，用完后盡快將試劑盒冷凍保存，試劑盒的凍融次數(shù)也不宜過多。

5 檢測環(huán)境

檢測環(huán)境是指開展熒光PCR 檢測的環(huán)境，包括檢測實驗室的選址布局、分區(qū)設(shè)計、室內(nèi)裝修、通風(fēng)等。如果實驗室選址布局科學(xué)合理，出現(xiàn)污染的概率就會大大降低。PCR 實驗室的設(shè)計應(yīng)當(dāng)遵循“各區(qū)獨立，注意風(fēng)向，因地制宜，方便工作”的十六字方針[9]。

“各區(qū)獨立”是指要將實驗室嚴(yán)格分隔成試劑配制區(qū)、核酸提取區(qū)、核酸擴(kuò)增區(qū)等3 個物理上完全獨立的功能室，各功能室間不能直接相通。如果各區(qū)之間的傳遞采用傳遞窗，則傳遞窗應(yīng)為密封嚴(yán)實的雙開門且?guī)в羞B鎖裝置，傳遞窗內(nèi)要有紫外燈照射裝置，每次打開使用傳遞窗后都要進(jìn)行紫外燈消毒，且物品經(jīng)傳遞窗傳遞的路線應(yīng)該是單向的，要特別注意避免不同區(qū)之間的直接相通。各區(qū)內(nèi)都應(yīng)有緩沖間，避免直接進(jìn)入試驗區(qū)域。

“注意風(fēng)向”是指注意各區(qū)的壓力和氣流的流向是不同的。試劑配制區(qū)主要用于配制試驗用試劑，如裂解液、提取液、引物探針、PCR 反應(yīng)液等。這些試劑應(yīng)保持無污染，遠(yuǎn)離陽性樣品、陽性PCR 產(chǎn)物、陽性對照等污染源，應(yīng)嚴(yán)格管控其他區(qū)域的材料和設(shè)備（有可能攜帶污染成分）進(jìn)入本區(qū)域，因此這一區(qū)域的壓力應(yīng)保持正壓，保證氣流的流向始終從試劑配制區(qū)流向其他區(qū)域。核酸提取區(qū)涉及樣品的剪切、研磨、粉碎、勻漿、離心、提取等步驟，如果處理的樣品為陽性樣品，就會存在陽性樣品形成氣溶膠污染環(huán)境的風(fēng)險，因此該區(qū)域應(yīng)與其他區(qū)域嚴(yán)格隔離，區(qū)域內(nèi)的一切物品不得帶入其他區(qū)域。為防止陽性樣品形成的氣溶膠溢出，本區(qū)域的壓力應(yīng)設(shè)為負(fù)壓。核酸擴(kuò)增區(qū)是用來擴(kuò)增核酸的區(qū)域，在此區(qū)域核酸會大量擴(kuò)增，這一區(qū)域管控的關(guān)鍵是防止擴(kuò)增產(chǎn)物的溢出和污染，因此該區(qū)域的壓力應(yīng)為負(fù)壓，所有設(shè)備材料均專用，不得移出該區(qū)域。

“因地制宜，方便工作”是指在生產(chǎn)實際中，實驗室的建設(shè)和設(shè)計應(yīng)根據(jù)使用者的用途和費用不同而有所差異，只要實驗室符合標(biāo)準(zhǔn)，就沒有必要要求所有實驗室都完全一樣。各實驗室在設(shè)計和布局時，應(yīng)以最大限度地考慮日常檢測工作更方便為目的[5]。

6 結(jié)語

熒光PCR 作為一種成熟的技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于ASFV 檢測。由于熒光PCR 技術(shù)的檢測靈敏度極高，因此檢測過程的很多因素都會嚴(yán)重影響檢測結(jié)果，如樣品中含有反應(yīng)抑制物、熒光PCR 儀存在故障、檢測人員出現(xiàn)操作誤差、實驗室內(nèi)存在交叉污染等，都很容易出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果[10]。防止實驗室出現(xiàn)“假陽性、假陰性”是一個長期艱巨而細(xì)致的工作。盡管本文從“人、物、料、法、環(huán)”等環(huán)節(jié)進(jìn)行了分析，但每一個檢測實驗室的情況都不同，因此僅能提供一些基礎(chǔ)的原則，相關(guān)檢測實驗室應(yīng)根據(jù)自己實驗室的特點，結(jié)合“人、物、料、法、環(huán)”等環(huán)節(jié)提供的措施，在此基礎(chǔ)上建立和實施針對性更強(qiáng)的實驗室質(zhì)量管理體系，把檢測實驗室中的所有操作都以標(biāo)準(zhǔn)的管理文件表述出來，形成質(zhì)量手冊、質(zhì)量體系程序文件及標(biāo)準(zhǔn)操作程序，規(guī)范各種操作和管理行為，更好地控制和預(yù)防各種污染[11]。