何洋，張蓓，龍玲艷

1徐州醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，江蘇徐州 221000；2徐州醫(yī)科大學(xué)徐州臨床學(xué)院

宮頸癌(CC)是常見的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅女性生命安全[1]。正常宮頸組織→宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)→CC進(jìn)展不但涉及高危型人乳頭瘤病毒持續(xù)感染、基因組學(xué)、表觀遺傳修飾的參與，最近發(fā)現(xiàn)多種癌基因激活、抑癌基因失活和一系列信號(hào)通路異常也發(fā)揮著重要的作用[2]，因此深入了解CC致病基因?qū)μ剿鰿C發(fā)生機(jī)制、診斷治療、預(yù)后評(píng)估意義重大。細(xì)胞遷移誘導(dǎo)的透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白(CEMIP)又稱KIAA1199蛋白，最初被認(rèn)為是一種內(nèi)耳蛋白，其突變是造成非綜合征聽力損失的原因之一，近年研究發(fā)現(xiàn)CEMIP是一種Wnt調(diào)控蛋白，廣泛參與腫瘤細(xì)胞分化、增殖、侵襲轉(zhuǎn)移等過程[3]。β-連環(huán)蛋白(β-catenin)是Wnt/β-catenin信號(hào)通路核心蛋白，通過上調(diào)靶基因Cyclin D1的表達(dá)從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖失控[4]。細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，正向精密調(diào)控G1/S期的轉(zhuǎn)化，在腫瘤中經(jīng)常被上調(diào)或擴(kuò)增[5]。近年有關(guān)CEMIP在激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，調(diào)控下游靶基因(c-myc、Cyclin D1)的表達(dá)，從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的作用中日漸受到關(guān)注，但目前鮮有在宮頸鱗癌中的相關(guān)報(bào)道。2019年12月-2020年5月，我們觀察了宮頸鱗癌組織中CEMIP、β-catenin、Cyclin D1的表達(dá)變化，并探討其意義。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2013年1月—2015年1月徐州市中心醫(yī)院病理科存檔的宮頸組織蠟塊186例份。蠟塊中宮頸鱗癌組織96例份，病例均經(jīng)病理證實(shí)，且均未行放化療或其他藥物治療；納入標(biāo)準(zhǔn)：病理確診，臨床資料完善，獲得患者知情同意并進(jìn)行隨訪(包括門診、短信及電話隨訪)；排除標(biāo)準(zhǔn)：來源其他惡性腫瘤或轉(zhuǎn)移癌，術(shù)前進(jìn)行放化療或其他治療；患者年齡22～77歲，平均年齡48.01歲；年齡<50歲54例，≥50歲42例；FIGO分期[6]Ⅰ期56例，Ⅱ期32例，Ⅲ+Ⅳ期8例；腫瘤分化程度為高分化9例，中分化74例，低分化13例；腫瘤 直徑<4 cm 79例，≥4 cm 17例；浸潤深度<1/2肌層59例，≥1/2肌層37例；SCC值<2.5 ng/mL 49例，≥2.5 ng/mL 47例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移68例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例。Ⅱ～Ⅲ期CIN組織30例份，患者年齡22～69歲，平均年齡41.93歲。Ⅰ期CIN組織30例份，患者年齡22～65歲，平均年齡42.53歲。慢性宮頸炎組織30例份，患者年齡32～66歲，平均年齡47.26歲。本研究征得患者及家屬知情同意并簽署知情同意書，并獲得徐州市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 宮頸組織CEMIP、β-catenin、Cyclin D1檢測(cè)方法 取各宮頸組織標(biāo)本，在10%甲醛中浸泡固定，石蠟包埋，按照4 μm厚度連續(xù)切片。將石蠟切片進(jìn)行70 ℃烤片1 h、二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟2次，每次10 min，梯度乙醇100%→95%→85%→75%→50%各5 min，檸檬酸鹽高溫修復(fù)抗原，內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑室溫孵育10 min。鼠抗人CEMIP單抗，按照1∶75抗體稀釋液稀釋后4 ℃孵育過夜，37 ℃復(fù)溫45 min，滴加反應(yīng)增強(qiáng)劑，孵育二抗后進(jìn)行DAB顯色，蘇木素復(fù)染，酒精梯度(50%→75%→85%→95%→100%)各5 min脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。β-catenin、Cyclin D1采用上述同樣的方法進(jìn)行檢測(cè)，β-catenin與抗體稀釋液按1∶50配比，Cyclin D1與抗體稀釋液按1∶75配比。以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為空白對(duì)照。陽性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：CEMIP陽性結(jié)果為棕黃色顆粒表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中；β-catenin正常表達(dá)于細(xì)胞膜上，陽性結(jié)果為棕黃色顆粒異位表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核中；Cyclin D1陽性結(jié)果為棕褐色顆粒表達(dá)于細(xì)胞核中。免疫組化結(jié)果由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)生采用雙盲法進(jìn)行判讀計(jì)分，在高倍鏡(×400)下隨機(jī)選取10個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，按陽性細(xì)胞所占比例及染色強(qiáng)度計(jì)分：①陽性細(xì)胞比例：陽性細(xì)胞比例<5%記0分，5%～25%記1分，26%～49%記2分，50%～75%記3分，>75%記4分；②染色強(qiáng)度：無著色記0分，淡黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分；總得分=陽性細(xì)胞比例×染色強(qiáng)度，>3分為陽性表達(dá)，≤3分為陰性表達(dá)[7]。

1.3 隨訪方法 對(duì)96例宮頸鱗癌患者以門診、短信、電話等方式進(jìn)行隨訪，隨訪指標(biāo)包括患者術(shù)后生活質(zhì)量、是否行輔助治療(放化療、藥物)、是否定期復(fù)查、是否有轉(zhuǎn)移灶形成及復(fù)發(fā)、是否失訪(拒絕隨訪、失去聯(lián)系、死于該病或其他疾病)等，并對(duì)收集的結(jié)果進(jìn)行生存分析。以患者開始治療的時(shí)間為隨訪起始時(shí)間，2020年4月30日為隨訪截止時(shí)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，CEMIP、β-catenin、Cyclin D1間的相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析法，Kaplan-Meier生存分析法分析上述三指標(biāo)表達(dá)與宮頸鱗癌患者生存期的關(guān)系,Cox回歸分析法分析宮頸鱗癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各宮頸組織CEMIP、β-catenin、Cyclin D1陽性率比較 各宮頸組織中CEMIP、β-catenin、Cyclin D1陽性率比較見表1，CEMIP、β-catenin、Cyclin D1在各宮頸組織中的表達(dá)情況見圖1～圖3。

表1 各宮頸組織中CEMIP、β-catenin、Cyclin D1陽性率比較(%)

注：A為慢性宮頸炎組織，B為Ⅰ期CIN組織，C為Ⅱ～Ⅲ期CIN組織，D為宮頸鱗癌組織。

注：A為慢性宮頸炎組織，B為Ⅰ期CIN組織，C為Ⅱ～Ⅲ期CIN組織，D為宮頸鱗癌組織。

注：A為慢性宮頸炎組織，B為Ⅰ期CIN組織，C為Ⅱ～Ⅲ期CIN組織，D為宮頸鱗癌組織。

2.2 CEMIP、β-catenin、Cyclin D1表達(dá)與宮頸鱗癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 CEMIP、β-catenin、Cyclin D1表達(dá)與宮頸鱗癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系見表2，由表2可知，CEMIP、Cyclin D1陽性表達(dá)與宮頸鱗癌FIGO分期、分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，β-catenin陽性表達(dá)與宮頸鱗癌FIGO分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)。

2.3 宮頸鱗癌組織中CEMIP、β-catenin、Cyclin D1表達(dá)的相關(guān)性 宮頸鱗癌組織中CEMIP與β-catenin、Cyclin D1表達(dá)呈正相關(guān)(r分別為0.301、0.453，P均<0.05)，β-catenin與Cyclin D1表達(dá)呈正相關(guān)(r為0.495，P<0.05)。

2.4 CEMIP、β-catenin、Cyclin D1表達(dá)與宮頸鱗癌患者生存及預(yù)后的關(guān)系 CEMIP陽性、陰性表達(dá)者5年生存率分別為26.5%、97.9%，β-catenin陽性、陰性表達(dá)者5年生存率分別為50.0%、95.8%，Cyclin D1陽性、陰性表達(dá)者5年生存率分別為47.8%、96.3%，兩者比較，P均<0.05。宮頸鱗癌患者預(yù)后單因素分析結(jié)果見表3，由表3可知，F(xiàn)IGO分期、分化程度、浸潤深度、SCC值、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及CEMIP、β-catenin、Cyclin D1陽性表達(dá)是宮頸鱗癌患者預(yù)后影響因素；宮頸鱗癌患者預(yù)后多因素分析結(jié)果見表4，由表4可知，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及CEMIP、β-catenin、Cyclin D1陽性表達(dá)是宮頸鱗癌患者預(yù)后危險(xiǎn)因素。

表3 宮頸鱗癌患者預(yù)后單因素分析結(jié)果

表4 宮頸鱗癌患者預(yù)后多因素分析結(jié)果

3 討論

宮頸鱗癌占CC的75%～80%，早期主要臨床表現(xiàn)為接觸性出血、陰道流液等，晚期可發(fā)展為輸尿管梗阻、尿毒癥、癌栓脫落、惡病質(zhì)等全身衰竭癥狀。雖然宮頸篩查不斷普及，但宮頸鱗癌的發(fā)生率和病死率仍較高，積極尋找高效敏感的腫瘤標(biāo)志物刻不容緩。目前，Wnt/β-catenin信號(hào)通路在CC中發(fā)揮促癌作用明確，因此調(diào)控該通路相關(guān)蛋白的因子可為CC治療提供新思路。

CEMIP位于15q25位點(diǎn)，該位點(diǎn)是多種腫瘤富集區(qū)域，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)其在結(jié)直腸癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌[8]等惡性腫瘤中高表達(dá)，并與癌癥進(jìn)展和不良預(yù)后密切相關(guān)。CEMIP可協(xié)調(diào)Wnt信號(hào)通路調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和癌癥擴(kuò)散等。在結(jié)直腸癌中沉默CEMIP會(huì)引起β-catenin表達(dá)降低，改變細(xì)胞周期，降低細(xì)胞增殖能力，同時(shí)發(fā)現(xiàn)CEMIP與Cyclin D1表達(dá)呈正相關(guān)，敲除CEMIP后Cyclin D1下降較通路中其他因子更明顯[9]，因此CEMIP可能是治療惡性腫瘤的一個(gè)新靶點(diǎn)。2019年研究者首先發(fā)現(xiàn)了外泌體CEMIP蛋白促進(jìn)腦轉(zhuǎn)移中的癌細(xì)胞定植現(xiàn)象，即在敲除CEMIP的動(dòng)物模型中，有腦轉(zhuǎn)移傾向的細(xì)胞不能在腦細(xì)胞中定植，提示靶向外泌體CEMIP可能成為預(yù)防和治療腦轉(zhuǎn)移的未來途徑[10]。研究顯示，CEMIP能通過參與PI3K-Akt介導(dǎo)的EMT，導(dǎo)致腫瘤惡性轉(zhuǎn)化[11]。XU等[12]發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌中CEMIP蛋白量表達(dá)高于正常組織，且主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。SHOSTAK等[13]發(fā)現(xiàn)，CEMIP在CC中呈異常高表達(dá)，其通過EGFR途徑誘導(dǎo)CC細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移，在Ⅲ期CIN中的陽性表達(dá)略高于CC。本研究顯示，宮頸鱗癌組織中CEMIP陽性率高于Ⅰ期CIN和慢性宮頸炎，Ⅱ～Ⅲ期CIN陽性率高于慢性宮頸炎；CEMIP陽性表達(dá)與宮頸鱗癌FIGO分期、分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；上述結(jié)果提示，CEMIP在宮頸鱗癌形成過程中扮演著促癌基因的作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，宮頸鱗癌組織中CEMIP與β-catenin、Cyclin D1表達(dá)呈正相關(guān)，提示CEMIP可能通過調(diào)控β-catenin、Cyclin D1的表達(dá)參與宮頸鱗癌的癌變過程，我們推測(cè)CEMIP可成為宮頸鱗癌患者潛在的治療靶點(diǎn)，但具體作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路是腫瘤研究中的經(jīng)典通路，異?；罨烧T導(dǎo)腫瘤分化失控、侵襲轉(zhuǎn)移、耐藥等過程，阻斷Wnt信號(hào)通路可以抑制腫瘤發(fā)生。β-catenin位于3p21上，在多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)[14]，在正常成熟細(xì)胞中，β-catenin大部分位于細(xì)胞膜上，而在腫瘤細(xì)胞中，Wnt信號(hào)通路被激活，β-catenin與該通路上的軸蛋白、糖原合酶激酶3β、大腸腺瘤樣蛋白等形成的復(fù)合體不能被泛素化降解，β-catenin從胞膜上異位至胞質(zhì)和胞核中，與細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子TCF/淋巴樣增強(qiáng)因子LEF家族成員相互作用，增加控制細(xì)胞分裂和生長的關(guān)鍵Wnt靶基因(Cyclin D1、c-myc)的表達(dá)，從而啟動(dòng)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖[15]，因此針對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)是可能治療癌癥的一種有前途的策略。LI等[16]發(fā)現(xiàn)，β-catanin的高表達(dá)參與了乳腺癌的惡性增殖和浸潤轉(zhuǎn)移，降低β-catenin水平可以抑制腫瘤生長。LIN等[17]發(fā)現(xiàn)，HBX誘導(dǎo)的miR-5188損傷FOXO1刺激β-catenin核轉(zhuǎn)位，導(dǎo)致肝癌的腫瘤擴(kuò)散。隨著宮頸病變進(jìn)展，β-catenin表達(dá)增強(qiáng)并異位至胞質(zhì)或胞核中，且與腫瘤分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預(yù)后等密切相關(guān)，在一定程度上反應(yīng)宮頸鱗癌的惡性程度，可作為宮頸鱗癌患者預(yù)后的指標(biāo)[18]。本研究顯示，宮頸鱗癌組織β-catenin陽性率顯著高于CIN和慢性宮頸炎，β-catenin陽性表達(dá)與宮頸鱗癌FIGO分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，充分體現(xiàn)了β-catenin在宮頸鱗癌病變進(jìn)展過程中的致癌作用，抑制β-catenin的表達(dá)可減少宮頸鱗癌的發(fā)生。

Cyclin D1是Cyclins家族成員之一，在細(xì)胞周期G0期開始合成，G1中期達(dá)高峰，S期開始降解并維持低水平，與細(xì)胞周期素依賴性激酶和周期素依賴性激酶抑制因子共同調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，對(duì)于維持細(xì)胞生長發(fā)育平衡意義重大，其異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致G1期明顯縮短，導(dǎo)致細(xì)胞惡性增殖[19]。Cyclin D1是目前公認(rèn)的Wnt/β-catenin信號(hào)通路下游靶基因，大量實(shí)驗(yàn)表明Wnt/β-catenin通路激活后Cyclin D1表達(dá)上調(diào)；Cyclin D1蛋白陽性表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌組織學(xué)分級(jí)、臨床分期呈正相關(guān)，患者預(yù)后較差[20]。丁玉梅等[21]發(fā)現(xiàn)，CIN和CC中Cyclin D1表達(dá)升高，且Cyclin D1高表達(dá)與CC患者臨床分期高、分化程度低、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，提示Cyclin D1有潛在的評(píng)估和預(yù)后價(jià)值。LI等[22]發(fā)現(xiàn)，通過靶向Cyclin D1可抑制CC細(xì)胞增殖，減弱細(xì)胞成瘤性和腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等。本研究顯示，宮頸鱗癌組織中Cyclin D1陽性率顯著高于CIN和慢性宮頸炎，Ⅱ～Ⅲ期CIN組織中Cyclin D1陽性率顯著高于慢性宮頸炎；Cyclin D1陽性表達(dá)與宮頸鱗癌FIGO分期、分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示Cyclin D1可作為宮頸鱗癌治療的分子靶點(diǎn)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，CEMIP、β-catenin、Cyclin D1陽性表達(dá)患者5年生存率較陰性患者顯著降低，CEMIP、β-catenin、Cyclin D1亦是宮頸鱗癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，因此我們推測(cè)CEMIP、β-catenin、Cyclin D1可作為宮頸鱗癌的有效預(yù)測(cè)指標(biāo)。

總之，宮頸鱗癌組織中CEMIP、β-catenin、Cyclin D1表達(dá)升高，上述三指標(biāo)可作為宮頸鱗癌的有效預(yù)測(cè)指標(biāo)及潛在治療靶點(diǎn)。