楊琛，王利，張瑞，李春峰，冷同愛

嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）引起的新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）自暴發(fā)以來迅速蔓延[1]，目前已成為全球公共衛(wèi)生事件。截至2020年12月，全球累計確診COVID-19患者8 000余萬例，累計死亡患者170余萬例。危重型COVID-19患者死亡率較高，其中免疫系統(tǒng)過度激活引起的急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）及多器官功能衰竭是其死亡的主要原因之一[2-3]。目前，COVID-19的治療仍以抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、支持治療為主[4]，暫無特效治療方法，故探尋安全、高效的治療策略迫在眉睫。

間充質(zhì)干細(xì)胞來源胞外囊泡（mesenchymal stem cells derived extracellular vesicles，MSC-EV）能夠選擇性聚集間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）來源的蛋白、mRNA、微小RNA（miRNA）、細(xì)胞因子、脂質(zhì)等物質(zhì)，并靶向投遞其內(nèi)容物至目標(biāo)細(xì)胞，進(jìn)而發(fā)揮抗微生物、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、組織修復(fù)、促血管生成、抗纖維化等作用，在免疫相關(guān)疾病及再生醫(yī)學(xué)中發(fā)揮著重要作用[5-6]。理論上，MSC-EV能夠促進(jìn)SARS-CoV-2清除，抑制患者過度激活的免疫狀態(tài)，并促進(jìn)受損組織、器官修復(fù)。此外，MSC-EV在保留MSC免疫調(diào)節(jié)及組織修復(fù)等功能的同時[7]還能夠規(guī)避MSC作為細(xì)胞組分相關(guān)的一些不良反應(yīng)[6]。本文主要綜述了MSC-EV在COVID-19中的潛在應(yīng)用價值，以期為COVID-19患者提供一種安全、高效的治療策略。

1 COVID-19發(fā)病機(jī)制

SARS-CoV-2通過棘突蛋白與Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞表面的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2受體結(jié)合并進(jìn)入宿主細(xì)胞[8]，病毒RNA釋放入細(xì)胞內(nèi)并轉(zhuǎn)錄病毒相關(guān)組分，進(jìn)而引起宿主細(xì)胞損傷甚至死亡。SARS-CoV-2結(jié)構(gòu)蛋白在宿主細(xì)胞內(nèi)形成并組裝完成病毒復(fù)制，經(jīng)過胞吐作用從宿主細(xì)胞內(nèi)釋放出來，并通過呼吸道飛沫等途徑迅速在人群中傳播。SARS-CoV-2能激活機(jī)體固有及適應(yīng)免疫應(yīng)答。固有免疫系統(tǒng)的干擾素（interferon，IFN）、自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞可識別病原體相關(guān)分子模式并引起細(xì)胞毒免疫反應(yīng)，形成抗SARS-CoV-2的第一道防線。SARS-CoV-2可激活免疫細(xì)胞，而活化的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞及B淋巴細(xì)胞是適應(yīng)免疫應(yīng)答的主要參與者，可分別破壞病毒感染細(xì)胞、產(chǎn)生抗體并清除病毒。

眾所周知，機(jī)體的適應(yīng)免疫應(yīng)答在清除SARS-CoV-2方面發(fā)揮著積極作用，但不被控制的固有炎性反應(yīng)及受損的適應(yīng)免疫應(yīng)答常會導(dǎo)致負(fù)面影響。研究表明，SARS-CoV-2可使CD4+T淋巴細(xì)胞分化為輔助性T（helper T，Th）1細(xì)胞，危重癥患者CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞明顯減少[9]，CD14+CD16+單核細(xì)胞、Th17細(xì)胞及表達(dá)穿孔素、顆粒酶的CD8+T淋巴細(xì)胞增多[10]，白介素（interleukin，IL）-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-17、粒細(xì)胞集落刺激因子、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子、肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）、IFN-γ誘導(dǎo)蛋白10、單核細(xì)胞趨化蛋白（monocyte chemotactic protein，MCP）-1、MCP-3、 巨 噬 細(xì) 胞 炎 癥 蛋 白（macrophage inflammatory protein，MIP）-1α、單核因子誘導(dǎo)IFN-γ、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α等促炎性細(xì)胞因子水平明顯升高并形成細(xì)胞因子風(fēng)暴[9，11-12]，細(xì)胞因子及趨化因子募集大量中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞并在肺部浸潤、釋放有毒遞質(zhì)，引起肺泡上皮細(xì)胞及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及通透性增加，炎性細(xì)胞及大量液體滲透至肺泡內(nèi)及肺泡間隙，可導(dǎo)致纖維組織沉積、透明膜形成及肺泡壁彌漫性增厚[10，13]。研究表明，SARS-CoV-2所致的細(xì)胞因子風(fēng)暴可引起心臟、肝臟、腎臟等多器官功能損傷甚至衰竭[14]，嚴(yán)重時甚至導(dǎo)致患者死亡[3]。

2 MSC-EV治療COVID-19的潛在作用機(jī)制

2.1 MSC-EV可促進(jìn)病毒及細(xì)菌清除 MSC-EV可增強(qiáng)機(jī)體抗微生物作用，理論上能促進(jìn)SARS-CoV-2清除。MSC-EV能夠投遞RNA至肺上皮細(xì)胞，阻止流感病毒復(fù)制并抑制其紅細(xì)胞凝集，進(jìn)而抑制病毒引起的細(xì)胞凋亡[15]。在豬流感模型中，MSC-EV能夠明顯減少豬鼻拭子及肺部病毒載量，減輕流感病毒引起的急性肺損傷[15]。在細(xì)胞實驗中，MSC-EV能夠通過投遞 let-7f、miRNA-145、miRNA-199a、miRNA-221等miRNA至靶細(xì)胞而阻止丙型肝炎病毒復(fù)制[16]；MSC-EV能通過投遞線粒體至巨噬細(xì)胞而上調(diào)其氧化磷酸化水平并增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能[17-18]。在小鼠大腸埃希菌肺炎模型中，MSC-EV通過投遞miRNA-145而抑制多藥耐藥相關(guān)蛋白1 RNA及蛋白表達(dá)，促進(jìn)白三烯B4的產(chǎn)生[19]，增強(qiáng)單核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞吞噬功能及抗菌活性，減少小鼠肺部細(xì)菌含量并降低菌血癥發(fā)生風(fēng)險，進(jìn)而有效減輕肺炎嚴(yán)重程度[7，19]。

2.2 MSC-EV可促進(jìn)病毒及細(xì)菌感染所致肺損傷的修復(fù)與免疫調(diào)節(jié) SARS-CoV-2感染后患者免疫系統(tǒng)過度激活，從而引起ARDS。理論上MSC-EV能夠通過多種免疫調(diào)節(jié)機(jī)制而抑制COVID-19患者免疫系統(tǒng)激活，從而改善患者肺內(nèi)皮及上皮細(xì)胞通透性，加快肺泡液的清除，促進(jìn)患者肺部炎癥的消失。MSC-EV能夠投遞環(huán)氧化酶2 mRNA、線粒體至靶細(xì)胞，促進(jìn)前列腺素E2分泌、誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞由促炎癥的M1表型向抗炎癥的M2表型極化[7，17，20]，抑制T淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞功能，并促進(jìn)抗炎性細(xì)胞因子的分泌。MSC-EV能夠投遞mRNA、miRNA等物質(zhì)，減少肺部中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的浸潤[7，21]，抑制 IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17、TNF-α 等促炎性細(xì)胞因子的分泌，促進(jìn)IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子β等抗炎性細(xì)胞因子的分泌[7，20-24]，從而減輕流感病毒引起的急性肺損傷[15]。此外，MSC-EV還能誘導(dǎo)Th1細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Th2細(xì)胞，減少T淋巴細(xì)胞分化為Th17細(xì)胞，同時增加調(diào)節(jié)性T細(xì)胞[22]，減少肺泡液中蛋白及MIP-2含量，減輕肺水腫及內(nèi)皮細(xì)胞通透性，從而降低大腸埃希菌所致肺炎小鼠的死亡率[7，18]。在小鼠ARDS模型中，MSC-EV可通過投遞血管生成素1（angiopoietin 1，Ang1）mRNA至靶細(xì)胞而上調(diào)Ang1表達(dá)[20]，減少中性粒細(xì)胞浸潤并降低MIP-2水平，進(jìn)而發(fā)揮抗炎及保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能、改善肺毛細(xì)血管通透性的作用[21]。在體外人肺大腸埃希菌重癥肺炎模型中，MSC-EV能降低肺內(nèi)皮細(xì)胞蛋白通透性、加快肺泡液的清除，減少肺泡內(nèi)細(xì)菌數(shù)量，從而減輕大腸埃希菌引起的肺損傷[25]。

2.3 MSC-EV可促進(jìn)受損組織、器官的修復(fù) SARS-CoV-2常引起患者組織、器官功能損傷，甚至發(fā)生多器官功能衰竭，這也是危重型COVID-19患者死亡的主要原因之一。理論上MSC-EV能夠促進(jìn)COVID-19患者受損組織、器官修復(fù)，改善患者預(yù)后，可能的機(jī)制如下：MSC-EV表達(dá)的分化群（cluster of differentiation，CD）29、CD44、CD73等黏附分子能歸巢至損傷組織部位并發(fā)揮作用[6]；MSC-EV能夠投遞新陳代謝關(guān)鍵酶、功能性線粒體等物質(zhì)至受損組織，增強(qiáng)肺泡上皮細(xì)胞線粒體功能及修復(fù)能力[17]，進(jìn)而修復(fù)大腸埃希菌引起的肺泡上皮細(xì)胞損傷[7]；MSC-EV能夠投遞miRNA-21-5p并發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用，減輕氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞死亡[24]；此外，MSC-EV還能通過投遞Ang1 mRNA至內(nèi)皮細(xì)胞而促進(jìn)Ang1分泌，修復(fù)IL-1β、TNF-α、IFN-γ等炎性細(xì)胞因子引起的內(nèi)皮細(xì)胞損傷，改善肺毛細(xì)血管通透性[26]。有動物實驗結(jié)果顯示，MSC-EV通過調(diào)節(jié)單核巨噬細(xì)胞群而減少膠原沉積，預(yù)防及修復(fù)博來霉素引起的肺纖維化[23]。MSC-EV通過產(chǎn)生角質(zhì)細(xì)胞生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、HGF等一系列生長因子[6-7，27]而在心肌梗死、肝損傷、腎損傷、神經(jīng)系統(tǒng)損傷等方面表現(xiàn)出良好的組織修復(fù)作用[6，28]。

3 MSC-EV治療COVID-19的現(xiàn)狀

MSC-EV具備促進(jìn)病原體清除、免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)損傷的肺及其他組織、器官修復(fù)等作用，其在保留MSC作用的同時還能避免MSC相關(guān)不良反應(yīng)，如不存在不受控制增殖及異位分化的風(fēng)險。COVID-19患者常表現(xiàn)為高凝狀態(tài)，而MSC可表達(dá)組織因子并主要在肺毛細(xì)血管聚集，可能增加肺栓塞等血栓栓塞事件發(fā)生風(fēng)險。而MSC-EV體積較小，易通過血管等物理屏障；此外，MSC-EV免疫原性低，其脂質(zhì)雙分子層包膜能夠有效避免內(nèi)容物被循環(huán)中的酶類等物質(zhì)降解，具有良好的生物相容性和穩(wěn)定性，故直接將藥物或miRNA等小分子物質(zhì)裝載到MSC-EV內(nèi)并通過其歸巢作用，有望在藥物投遞載體方面發(fā)揮一定作用。上述優(yōu)勢使MSC-EV在COVID-19治療中具有一定潛力。

筆者以“COVID-19”“間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體”“間充質(zhì)干細(xì)胞胞外囊泡”“MSC exosomes”“MSC extracellular vesicles”為關(guān)鍵詞，檢索國內(nèi)外臨床試驗數(shù)據(jù)庫，共檢索到MSC-EV治療COVID-19的臨床試驗共4項，包括國內(nèi)臨床試驗3項，其中MSC外泌體霧化吸入治療COVID-19的關(guān)鍵技術(shù)研究（ChiCTR2000030261）為隨機(jī)對照研究，但MSC外泌體具體干預(yù)措施尚未報道；MSC外泌體霧化吸入治療COVID-19的初步臨床研究（NCT04276987）為單臂臨床試驗，患者霧化吸入2.0×108個MSC外泌體，1次/d，療程為5 d；臍帶MSC聯(lián)合細(xì)胞外泌體靜脈輸注對COVID-19肺損傷修復(fù)的臨床應(yīng)用研究（ChiCTR2000030484）為隨機(jī)對照研究，干預(yù)組患者靜脈輸注180 mg MSC外泌體，1次/d，共治療14 d，聯(lián)合靜脈輸注5×107個MSC，1次/周，共兩次。國外臨床試驗1項，為MSC外泌體霧化吸入治療SARS-CoV-2相關(guān)性肺炎的安全性和有效性評價（NCT04491240），試驗設(shè)計為隨機(jī)對照研究，MSC外泌體組患者霧化吸入（0.5～2.0）×1010個MSC外泌體，2次/d，療程為10 d。

已發(fā)表的1項前瞻性臨床研究結(jié)果顯示，24例危重型COVID-19患者接受1次骨髓來源MSC-EV靜脈注射后，19例（79.2%）患者臨床癥狀及氧合狀態(tài)明顯改善，17例（70.8%）患者臨床痊愈，3例（12.5%）患者仍危重但病情穩(wěn)定，患者平均治療5.6 d后出院，該組患者存活率為83.0%（20/24）；此外，該組患者治療后CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞絕對值明顯升高，中性粒細(xì)胞絕對值明顯降低，C反應(yīng)蛋白、鐵蛋白、D-二聚體水平明顯降低，治療及隨訪期間未發(fā)現(xiàn)不良事件發(fā)生，初步提示MSC-EV治療COVID-19患者是安全、有效的[29]。

4 小結(jié)與展望

SARS-CoV-2可引起患者免疫系統(tǒng)過度激活，導(dǎo)致ARDS及后續(xù)多器官功能損傷甚至衰竭，是COVID-19患者病情進(jìn)展及死亡的重要原因。理論上MSC-EV能夠促進(jìn)SARSCoV-2清除，抑制機(jī)體免疫系統(tǒng)過度激活，減輕炎性反應(yīng)尤其是細(xì)胞因子風(fēng)暴導(dǎo)致的肺泡上皮及血管內(nèi)皮損傷，并通過組織修復(fù)作用而促進(jìn)損傷的肺及其他組織、器官的功能恢復(fù)。此外，MSC-EV還具有良好的生物相容性和穩(wěn)定性，能夠避免MSC相關(guān)不良反應(yīng)。有臨床試驗初步顯示，MSC-EV治療COVID-19患者是安全、有效的[29]，其可能成為COVID-19的潛在治療策略。

但MSC-EV用于COVID-19患者的治療中仍有許多前期工作需要完成，盡管國際胞外囊泡協(xié)會對胞外囊泡的分離、純化、鑒定等做出一些基本要求[30]，但不同研究間的實驗流程仍存在差異，胞外囊泡的異質(zhì)性及復(fù)雜性對實驗結(jié)果的解讀及進(jìn)一步臨床試驗有一定影響。MSC細(xì)胞接觸方式與旁分泌機(jī)制在其發(fā)揮作用時均起關(guān)鍵作用，故單獨應(yīng)用MSCEV能否達(dá)到MSC同等功效仍有待進(jìn)一步研究。此外，MSCEV組織來源、母體細(xì)胞代數(shù)、內(nèi)容物構(gòu)成差異、是否需要預(yù)處理[7，18]及使用時機(jī)、劑量、頻次、途徑等因素對MSC-EV作用的具體影響均有待進(jìn)一步研究[6]。目前MSC-EV治療COVID-19尚處于臨床試驗階段，其具體療效及安全性尚有待高質(zhì)量臨床試驗進(jìn)一步驗證。

作者貢獻(xiàn)：楊琛、王利、冷同愛進(jìn)行文章的構(gòu)思、設(shè)計及可行性分析，論文及英文的修訂，并負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校；楊琛、王利、張瑞、李春峰進(jìn)行文獻(xiàn)/資料收集、整理；冷同愛對文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。