袁銘，劉向慧，張靜曉，胡曉盈

（洛陽師范學(xué)院 食品與藥品學(xué)院，河南洛陽 471934）

抑郁癥是一種情感性精神障礙疾病，患者以顯著而持久的心境低落、思維遲緩、意志活動減退為臨床表現(xiàn)[1]。近30年間，抑郁癥的發(fā)病率逐年上升，且呈低齡化趨勢，嚴重影響人們的生活質(zhì)量并對社會造成相當(dāng)大的經(jīng)濟負擔(dān)。目前，臨床一線的抗抑郁藥有選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑、5-羥色胺和去甲腎上腺素再攝取抑制劑、去甲腎上腺素和特異性5-羥色胺能抗抑郁藥等，主要針對中度以上抑郁癥發(fā)作，且存在復(fù)發(fā)率高、副作用大等問題。近年來，中醫(yī)藥抗抑郁癥研究逐漸受到人們的關(guān)注，如柴胡、厚樸、黃芩等，取得了較好的效果[2-3]。

白芍（Paennia lactiflora pall）為毛茛科植物芍藥的干燥根，其味苦且酸，性微寒，歸肝脾經(jīng)，對人體有溫血止痛、斂陰收津、平抑肝陽的療效。白芍的主要活性成分有芍藥苷、羥基芍藥苷、芍藥花苷、苯甲酰芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷等，有抗炎、止痛、抗氧化、抗心腦血管疾病及抑制自身免疫反應(yīng)等多種藥理作用。隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)白芍中的白芍總苷具有良好的抗抑郁效果，其藥理作用機制與5-HT神經(jīng)功能相關(guān)[4]。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法建立網(wǎng)絡(luò)模型預(yù)測關(guān)于白芍治療抑郁癥的藥理靶點。利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫查詢獲得白芍化學(xué)成分，并通過吸收、分布、代謝和排泄（ADME）的有效標(biāo)準(zhǔn)評估篩選出具有良好藥代動力學(xué)性質(zhì)的活性成分。采用Cytoscape軟件構(gòu)成白芍活性分子-靶點通路數(shù)據(jù)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)圖，最后對靶點進行基因本體生物學(xué)過程（Gene Ontology Biology process，GO-BP）富集分析及基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析?；谝陨侠碚摲治霭咨址肿幼饔糜谝钟舭Y疾病的藥理作用機制，預(yù)測出與藥理作用機制直接聯(lián)系的有效靶點和通路。

1 材料和方法

1.1 白芍數(shù)據(jù)庫構(gòu)建

通過查詢中藥系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫分析平臺（TCMSP）、中國天然產(chǎn)物化學(xué)成分數(shù)據(jù)庫（http://pharmdata.ncmi.cn/cnpc/）以及大量文獻收集白芍化學(xué)成分以及相關(guān)數(shù)據(jù)。其中，大部分化學(xué)成分數(shù)據(jù)來自TCMSP數(shù)據(jù)庫，并通過中國天然產(chǎn)物化學(xué)數(shù)據(jù)庫和文獻挖掘補充白芍的化學(xué)成分，最后根據(jù)所得化學(xué)成分數(shù)據(jù)，構(gòu)建白芍化學(xué)成分數(shù)據(jù)庫。

1.2 白芍活性成分篩選

通過以上中藥數(shù)據(jù)庫分析平臺所搜集到的白芍化學(xué)成分，根據(jù)相關(guān)藥代動力學(xué)參數(shù)，即口服利用度（OB≥30%）和類藥性（DL≥0.18）篩選白芍分子的活性成分[5]。由于抑郁癥病理機制不僅與中樞神經(jīng)系統(tǒng)有關(guān)，還與腦-腸軸的功能失調(diào)等相關(guān)，因此ADME/T參數(shù)中血腦屏障（BBB）在本研究中不作為活性分子的篩選條件。

1.3 白芍藥物靶點預(yù)測

在白芍活性成分篩選的基礎(chǔ)上進行藥物靶點預(yù)測，本研究采用綜合的靶點預(yù)測方法：通過成分名稱或CAS號檢索TCMSP、TTD數(shù)據(jù)庫或采用SMILES號檢索SEA數(shù)據(jù)庫（http://sea.bkslab.org/）篩選白芍活性化學(xué)成分的作用靶點，進行活性成分潛在靶點數(shù)據(jù)集建立，并將篩選得到的靶點經(jīng)過UniProt數(shù)據(jù)庫查詢轉(zhuǎn)換為基因名稱。

1.4 白芍網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

本研究白芍相關(guān)網(wǎng)絡(luò)主要是“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，深入研究白芍活性成分所對應(yīng)靶點的作用機制。運用Cytoscape軟件將收集的相關(guān)數(shù)據(jù)生成可視化網(wǎng)絡(luò)，并結(jié)合數(shù)據(jù)庫（疾病、通路、蛋白質(zhì)）進行網(wǎng)絡(luò)參數(shù)分析和生物功能注釋[6]。網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建可視化圖中不同屬性節(jié)點的聯(lián)系并非是單一的，而是多項發(fā)散的，一個節(jié)點的度代表了白芍活性分子連接的靶點數(shù)目，這也證實了構(gòu)圖中一個節(jié)點可影響多個節(jié)點之間的信號交流，從而使得這種靶點作用機制呈現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)化。

1.5 基因本體論和通路富集分析

將白芍活性分子對抑郁癥的作用靶點導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫，選擇從三個方面對白芍活性成分與抑郁癥的交叉作用靶點進行GO生物功能富集分析，同時選擇KEGG通路富集進行靶點基因通路注釋分析。基因本體論（GO）的分析又可以稱為GO生物學(xué)功能富集分析，是一個在生物學(xué)領(lǐng)域中廣泛用于基因功能分類的系統(tǒng)，主要用于描述基因產(chǎn)物的功能，一般分為三個部分：細胞組分（Cellular Component，CC）、分子功能（Molecular Function，MF）、生物功能（Biological Process，BP）[7]。細胞組分主要分析研究基因產(chǎn)物在細胞中的位置；生物功能指的是與靶點基因密切的多步驟有序的生物功能，如細胞凋亡、細胞分化、信號傳導(dǎo)等；分子功能則描述單基因產(chǎn)物的功能。KEGG是與通路相關(guān)的一個數(shù)據(jù)庫，基于基因參與人體的各個通路而形成的數(shù)據(jù)庫，也是對基因本身功能的注釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 白芍活性成分篩選

通過檢索TCMSP、中藥天然產(chǎn)物化學(xué)數(shù)據(jù)庫結(jié)合文獻查詢，得出白芍119個化學(xué)成分，并通過兩個關(guān)鍵參數(shù)OB和DL分析，共篩選出具有良好ADME性質(zhì)的白芍活性分子16個，具體如表1所示。

以上篩選出的白芍活性成分中，有不少化合物已被證實具有多方面的藥理作用。4-鄰甲基芍藥苷（OB=56.7，DL=0.43）和芍藥苷（OB=53.87，DL=0.79）屬于芍藥總苷成分，被眾多實驗證實具有抗抑郁、抗炎、補血、抑制糖尿病和保護神經(jīng)組織等藥理學(xué)性質(zhì)[8]；谷甾醇（OB=36.91，DL=0.75）已被研發(fā)成為一種藥物，具有預(yù)防動脈粥樣硬化、降低高脂血癥的藥理作用；山奈酚（OB=41.88，DL=0.24）已經(jīng)被證明具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗菌等多種藥理學(xué)作用。這些實驗數(shù)據(jù)也證實了本研究所用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建模型的可靠性[9-10]。

表1 白芍活性成分篩選

2.2 白芍靶點預(yù)測

通過藥代動力學(xué)參數(shù)篩選出16個活性成分，其中有7個活性成分目前靶點數(shù)目為0，借助SEA數(shù)據(jù)庫預(yù)測白芍作用靶點，共得到184個靶點蛋白，利用Uniprot網(wǎng)站整理靶點信息。同時，檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫[11]共查詢11 479個靶點蛋白，選擇關(guān)聯(lián)度≥4.18，共得到1 946個與抑郁癥關(guān)聯(lián)度高的靶點。最后，對獲得的白芍成分靶點和疾病靶點進行映射，選擇兩者中共有的靶點，將共有靶點和白芍活性成分進行映射，共得到白芍中與抗抑郁機制相關(guān)的75個靶點蛋白。

2.3 白芍成分-靶點網(wǎng)絡(luò)分析

將白芍成分作用于抑郁癥的靶點蛋白導(dǎo)入Cytoscape軟件[12]，構(gòu)建成分-靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，八邊形代表白芍的有效成分，圓形代表靶點基因。構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖形時由degree值決定靶點有效成分圖形的大小，成分聯(lián)結(jié)靶點越多，則圖形形狀越大。由此可知，該網(wǎng)絡(luò)有84個節(jié)點，其中9個成分節(jié)點，75個靶點基因節(jié)點。根據(jù)圖1可知，白芍有效成分抗抑郁癥排名前四的有谷甾醇、芍藥二酮、4-鄰甲基芍藥苷以及山奈酚，這些成分可能是白芍抗抑郁的關(guān)鍵性活性成分。在有效成分中關(guān)聯(lián)度較大的節(jié)點有AR（雄激素受體）、ESR1（雌激素受體1）和CYP19A1（細胞色素P450家族19亞家族A成員1）等靶點，這些靶點可能在白芍治療抑郁癥中起到重要作用。

圖1 白芍活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 GO富集分析

將白芍對抑郁癥發(fā)揮作用的75個基因靶點導(dǎo)入Metascape軟件，進行基因本體功能分析[13]。通過Metascape軟件自動篩選出靶點蛋白在分子功能、生物進程、細胞組分3個方面聯(lián)系較密切的通路途徑分別有19條目、20條目、16條目。結(jié)果表明，白芍對抑郁癥作用的靶點蛋白在分子功能方面，與類固醇結(jié)合（Steroid binding）、血紅素結(jié)合（Heme binding）、蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性（Protein tyrosine kinase activity)作用最為顯著，這三個途徑分別涉及12、11、11個作用靶點，如圖2所示。同時與抑郁癥作用相關(guān)其他單分子基因的表達途徑還有生長因子受體結(jié)合（Protein tyrosine kinase activity）、激酶或激素結(jié)合（Kinase or Hormone binding）、單胺跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性（Monoamine transmembrane transporter activity)、蛋白質(zhì)均二聚活性（Protein homodimerization activity)、SH2域綁定（SH2 domain binding)等。結(jié)果顯示，激素水平的調(diào)節(jié)（Regulation of hormone levels）是白芍治療抑郁癥最重要的生物過程，其通路過程與24個作用靶標(biāo)相聯(lián)系，是生物過程中靶標(biāo)連線最多的途徑，如圖3所示。此外，絲裂原活化蛋白激酶級聯(lián)反應(yīng)的正調(diào)控（Positive regulation of MAPK cascade）、對脂多糖的反應(yīng)（Response to lipopolysaccharide）和細胞對有機環(huán)狀化合物的反應(yīng)（Cellular response to organic cyclic compound）對抑郁癥的影響僅次于激素調(diào)節(jié)，這些生物過程所連靶標(biāo)及富集百分度已達到80%以上。細胞中的靶點作用集中于膜筏（Membrane raft）、受體復(fù)合體（Receptor complex）、突觸前膜的組成部分（Integral component of presynaptic membrane）和溶泡（Lytic vacuole）等介質(zhì)的傳導(dǎo)，如圖4所示。通過多方面分析可知，白芍對抑郁癥的靶點作用可調(diào)控以上途徑達到治療效果。

2.5 KEGG通路分析

將75個潛在作用靶點映射到Metascape數(shù)據(jù)庫中，進行KEGG通路富集分析，得到16個與抗抑郁作用機制密切相關(guān)的信號通路，詳細如表2所示。KEGG結(jié)果顯示，癌癥通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、鈣信號通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用這4個通路是最為顯著的途徑，也是白芍治療抑郁癥最有依據(jù)的作用通路，其中有18個靶點蛋白參與癌癥通路的相關(guān)基因調(diào)控，也是靶點蛋白聯(lián)系最多的通路傳導(dǎo)途徑。此外，癌癥的中央碳代謝、內(nèi)分泌抵抗、Th17細胞分化和MAPK信號通路是僅次于以上4個通路的傳導(dǎo)途徑，皆有7個靶點蛋白聯(lián)系作用。

圖2 GO富集分子功能分析圖

圖3 GO富集生物進程分析

圖4 GO富集細胞組分分析圖

表2 白芍抗抑郁作用的KEGG富集通路靶點信息表

2.6 蛋白質(zhì)作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

采用Metascape軟件對靶點蛋白進行GO分子功能富集分析，使用數(shù)據(jù)庫BioGrid 6、InWeb_IM 7、OmniPath 8進行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用富集分析[14-15]。網(wǎng)絡(luò)中密切關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)子集，如果網(wǎng)絡(luò)包含3 ～500種蛋白質(zhì)，則應(yīng)用分子復(fù)雜檢測（MCODE）算法9來識別密集連接的網(wǎng)絡(luò)組件。本研究收集單個基因列表確定的MCODE網(wǎng)絡(luò)，如圖5所示。途徑和過程富集分析已分別應(yīng)用于每個MCODE組件，并且保留了按p≥3的最佳得分項作為相應(yīng)組件的功能描述。

圖5 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖集

由圖5可知，INSR（Insulin Receptor，胰島素受體）與7個靶點蛋白相互作用，分別是SRC（SRC Proto-Oncogene，Non-Receptor Tyrosine Kinase SRC，原癌基因，非受體酪氨酸激酶）、NTRK1（Neurotrophic Receptor Tyrosine Kinase 1，神經(jīng)營養(yǎng)受體酪氨酸激酶1）、VEGFA（Vascular Endothelial Growth Factor A，血管內(nèi)皮生長因子A）、PLCG1（Phospholipase C Gamma 1，磷脂酶Cγ1）、EGFR（Epidermal Growth Factor Receptor，表皮生長因子受體）、KIT（KIT Proto-Oncogene，Receptor Tyrosine Kinase，原 癌 基因，受體酪氨酸激酶）和JAK2（Janus Kinase 2，酪氨酸蛋白激酶JAK2）。SRC基因也與7個靶點相互作用，除去以上提到的6個靶點蛋白外，還與RET（Ret Proto-Oncogene，Ret原癌基因）協(xié)同作用。CYP家族（細胞色素P450）蛋白間相互聯(lián)系，參與了甾體激素的合成，甾體激素的含量在抑郁癥治療中起到重要作用。OPRD1（Opioid Receptor Delta 1，阿片受體 Delta 1）、ADORA1（Adenosine A1 Receptor，腺苷A1受體）、CCR4（C-C Motif Chemokine Receptor 4，CC Motif趨化因子受體4）、OPRM1（Opioid Receptor Mu 1，阿片受體Mu1）和HRH3（Histamine Receptor H3，組胺受體H3）這5個靶點蛋白之間相互作用，每個靶點均與其他4個靶點連接。ESR1（Estrogen Receptor 1，雌激素受體1）和IL6（Interleukin 6，白介素6）都有3個靶點聯(lián)系，這兩者之間也相互作用。

3 結(jié)論

本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析了白芍分子作用于抑郁癥靶點的藥理機制，構(gòu)建了成分-靶標(biāo)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，并通過基因功能的分析和通路分析，闡述了白芍分子抗抑郁癥的多種分子作用機制，共得到以下5個結(jié)論，為研究白芍抗抑郁癥的臨床研究和創(chuàng)新藥物提供了理論依據(jù)和科學(xué)支持。

（1）檢索白芍相關(guān)數(shù)據(jù)庫共收集119個白芍化學(xué)成分，以O(shè)B值和DL值篩選出16個白芍潛在有效成分，如芍藥苷、4-鄰甲基芍藥苷、山奈酚、兒茶素、谷甾醇和丁子香萜等。

（2）預(yù)測得到75個白芍活性分子作用的抑郁癥相關(guān)靶點蛋白，如INSR、CYP19A1、RET和NTRK1。

（3）利用白芍活性分子與其作用的抑郁癥潛在靶點，建立成分-靶點網(wǎng)絡(luò)。芍藥二酮、4-鄰甲基芍藥苷和芍藥苷等都是白芍活性成分中治療抑郁癥的關(guān)鍵成分；靶點AR、ESR1和CYP家族等靶點是白芍抗抑郁癥的關(guān)鍵靶點。

（4）GO富集分析和KEGG通路分析結(jié)果可得，白芍治療抑郁癥調(diào)節(jié)的關(guān)鍵通路主要有類固醇結(jié)合通道、血紅素結(jié)合通道、癌癥通路治療通道、生長因子受體結(jié)合和單胺跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性等通道。

（5）PPI蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系表明白芍作用于抑郁癥靶點可以通過細胞膜內(nèi)CPY家族對激素水平的調(diào)節(jié)以及其他受體的調(diào)節(jié)達到抑郁癥治療的期望療效。