朱永生 李漢仁 陳紀(jì)鵬

摘要：蕓薹屬包括多種蔬菜和油料作物，是與人類生產(chǎn)、生活關(guān)系最密切的一個(gè)屬。為了研究白菜型油菜與其近緣種間的雜交親和性及雜種后代的遺傳特征，采用剝蕾去雄和人工授粉方法進(jìn)行小白菜與甘藍(lán)型油菜種間雜交AACC×AcAc以及小白菜與黃芽白不同栽培種間雜交AcAc×AhAh，并分析雜種后代的表型、花粉育性和細(xì)胞學(xué)等遺傳特征。結(jié)果表明，AACC×AcAc雜交組合雜交授粉親和性差，在授粉后出現(xiàn)胚發(fā)育夭亡現(xiàn)象，以較低的比例獲得了雜種后代，雜種后代表現(xiàn)出生物產(chǎn)量高、生命力旺盛、生長(zhǎng)勢(shì)較強(qiáng)等特點(diǎn)。雜交組合AcAc×AhAh獲得雜種后代的比例較高，雜種后代植株較矮小。AACC×AcAc雜種后代花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中有單價(jià)體、不均等分離等異常現(xiàn)象出現(xiàn)，與之相應(yīng)其花粉育性和結(jié)實(shí)率也較差。AcAc×AhAh雜種后代花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中染色體聯(lián)會(huì)正常，所有染色體都形成二價(jià)體，后期I染色體也是均等分離，因此花粉育性好，結(jié)實(shí)率高。蕓薹屬雜種后代合成及其遺傳特征研究有助于蕓薹屬栽培植物遺傳資源拓展和新品種培育。

關(guān)鍵詞：白菜型油菜;甘藍(lán)型油菜;遠(yuǎn)緣雜交;細(xì)胞遺傳

中圖分類號(hào)：S634.303 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）24-0085-05

收稿日期：2021-03-27

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31460357）;江西省自然科學(xué)基金（編號(hào)：20202BABL205017）;江西省教育廳科研項(xiàng)目（編號(hào)：GJJ170908）。

作者簡(jiǎn)介：朱永生（2000—），男，江西新干人，主要從事植物遺傳育種研究。E-mail： 2991753843@qq.com。

通信作者：陳紀(jì)鵬，博士，副教授，主要從事油菜遠(yuǎn)緣雜交和細(xì)胞遺傳研究。E-mail：chensi20020606@163.com。

隨著現(xiàn)代育技術(shù)的不斷發(fā)展，蕓薹屬植物中現(xiàn)有的遺傳資源卻越來越稀少，而遠(yuǎn)緣雜交在近緣物種基因資源拓展、改良植物新品種和創(chuàng)造植物新類型方面具有重要作用[1-2]。蕓薹屬植物雜交后代常表現(xiàn)出較高的生物產(chǎn)量、旺盛的生長(zhǎng)活力、生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)等雜種優(yōu)勢(shì)，并可將近緣種的優(yōu)良基因引入栽培種[3-5]。當(dāng)前蕓薹屬栽培種由于不斷地進(jìn)行人工選擇以及氣候環(huán)境的影響，導(dǎo)致其種內(nèi)的遺傳多樣性顯著減少，而用于品種選育的親本資源也不斷下降。采用不同栽培種間雜交以及不同種間雜交甚至親緣關(guān)系更遠(yuǎn)的雜交，合成蕓薹屬遠(yuǎn)緣雜種，即為蕓薹屬栽培種，創(chuàng)造新的遺傳類型、轉(zhuǎn)入有利基因用于植物的遺傳改良、提高栽培種的品質(zhì)及產(chǎn)量[6-9]。

蕓薹屬植物種類繁多，物種豐富廣泛，包含很多的亞種、變種和栽培種，是重要的蔬菜、油料和藥用植物。甘藍(lán)型油菜是重要的油料作物之一，起源于歐洲，培育年限較短，遺傳基礎(chǔ)較窄，但是它角果大、籽粒大、結(jié)籽數(shù)多。白菜型油菜栽培歷史悠久，遺傳資源非常豐富，具有耐貧瘠、耐旱、耐寒等特性，可根據(jù)這些物種之間的差異，來豐富我國(guó)油菜育種的遺傳基礎(chǔ)[10]。利用甘藍(lán)型油菜與白菜型油菜二者進(jìn)行種間雜交和種內(nèi)雜交豐富甘藍(lán)型油菜的遺傳資源是當(dāng)前常用的育種方法[11，12]。本試驗(yàn)采用人工去雄和輔助授粉的方式進(jìn)行甘藍(lán)型油菜與小白菜雜交和小白菜與黃芽白之間雜交，并結(jié)合胚培養(yǎng)的方式獲得雜種后代，觀察雜種后代的遺傳學(xué)特征，創(chuàng)建蕓薹屬育種新材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

采用甘藍(lán)型油菜湘油15（Brassica napus var. xiangyou15）與白菜型油菜栽培種小白菜（B. rapa var. chinensis）進(jìn)行種間雜交獲取種間雜種后代AACC×AcAc。以小白菜和黃芽白（B. rapa var. huangyabai）做親本進(jìn)行不同栽培種間雜交獲取種內(nèi)雜種AcAc×AhAh。于2017年10月上旬在田間種植上述親本材料。由于白菜型油菜生育期較短，所以白菜型油菜適當(dāng)晚播以使父母本花期相遇。

1.2 人工雜交

第2年春季油菜盛花期，采用人工去雄和輔助授粉的方法進(jìn)行雜交。選擇晴朗天氣，對(duì)母本進(jìn)行人工剝蕾去雄，并立即用牛皮紙袋套上，別好回形針，做好標(biāo)記，同時(shí)對(duì)父本也用牛皮紙?zhí)缀?，以防止花粉被污染。?天上午取前1 d套好袋且剛剛開放的父本花朵對(duì)前1 d去雄的母本進(jìn)行授粉，授粉之后再用紙袋套好，做好標(biāo)記。后期進(jìn)行胚培養(yǎng)或收獲種子，以獲得雜種數(shù)與授粉花雜數(shù)之比作為親和指數(shù)，代表雜交親和性。

1.3 胚培養(yǎng)

授粉大約15 d左右（具體時(shí)間視雜種胚發(fā)育時(shí)期確定），從母本植株上取下授粉后膨大的角果進(jìn)行胚培養(yǎng)。先用70%乙醇對(duì)角果表面消毒 2～3 min，然后浸入0.1%的氯化汞溶液中浸泡 15 min，從氯化汞溶液中取出后用無菌水漂洗3次，將角果表面殘留的有害藥劑洗凈。在超凈工作臺(tái)的無菌環(huán)境下，輕輕將角果剝開后，從胚珠中取出幼胚接種于MS培養(yǎng)基表面，置于20 ℃，光周期為 12 h/24 h 的環(huán)境下培養(yǎng)。待幼胚長(zhǎng)出芽時(shí)，把芽轉(zhuǎn)接種在 MS+0.25 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基擴(kuò)繁。最后將幼苗轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基中生根培養(yǎng)，待幼芽的根長(zhǎng)出較多后移栽到田間。

1.4 雜種后代花粉育性觀察

在雜種植株盛花期觀察雜種植株花粉育性。在天氣晴朗的上午取雜種植株剛開放的花藥，每株2枚放在載玻片上，滴醋酸洋紅染色液，再用攝子將花藥壓破使花粉粒散出，并去除花藥壁殘片。蓋上蓋玻片，輕輕按壓后置于顯微鏡下觀察。有活力的花粉粒在顯微鏡下是大而圓的，而且著色比較深，而不育的花粉則表現(xiàn)為小而癟，不容易被染色，顏色較淺，從而可以區(qū)分可育花粉和不育花粉。每個(gè)雜交組合選10株進(jìn)行花粉育性觀察，每株觀察花粉至少100粒，統(tǒng)計(jì)可育花粉所占的比例。

1.5 雜種后代減數(shù)分裂細(xì)胞學(xué)觀察

為了觀察花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂，在雜種植株初花期摘取其幼嫩花蕾，用卡諾固定液（無水乙醇與冰乙酸體積比為3 ∶1混合溶液）進(jìn)行處理，處理時(shí)間≥24 h，處理完成后浸泡于75%乙醇中并貯藏于-20 ℃的冷凍箱中備用。觀察時(shí)取出備用的幼嫩花蕾放入盛有清水的培養(yǎng)皿中清洗殘留花蕾表面的乙醇，接著用鑷子從花蕾中取出1～2個(gè)花藥放于盛有1 mol/L HCl溶液的燒杯中，并在溫度為60 ℃水溫中水浴加熱水解2 min，然后取出花藥用清水漂洗去HCl，最后將處理完成的花藥放于蓋玻片上并用鑷子將花藥壓破使花粉母細(xì)胞散出，再用卡寶品紅進(jìn)行染色，蓋上蓋玻片并壓片，放于高倍顯微鏡下觀察花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂。將所觀察到的花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂圖片拍照保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交親和性比較

通過人工去雄、輔助授粉和胚培養(yǎng)，在以小白菜為母本、黃芽白為父本的雜交組合（AcAc×AhAh）以較高的親和指數(shù)（1.91）獲得雜種后代植株。而以甘藍(lán)型油菜為母本、小白菜為父本的雜交組合（AACC×AcAc）親和指數(shù)只有0.29）。AcAc×AhAh組合通過人工授粉進(jìn)行雜交，觀察雜交親和性，共調(diào)查225莢，在這些莢中空莢的數(shù)目有13個(gè)，占總數(shù)的 5.7%，有種子的莢中平均每莢結(jié)籽數(shù)目有1～5粒，占總數(shù)的8.7%籽粒不飽滿，不能正常發(fā)芽。AACC×AcAc組合授粉的花朵只有不到50%種子發(fā)育形成角果，其他的由于沒有繼續(xù)發(fā)育而凋落。發(fā)育的種子也有較多不飽滿不能正常發(fā)芽，雜交成功率較低（表1）。

授粉后15 d左右，取部分角果進(jìn)行胚培養(yǎng)，培養(yǎng)5 d后幼胚開始成長(zhǎng)出濃密的白色根毛，10 d左右就開始形成真葉，但多數(shù)幼苗生長(zhǎng)畸形。生長(zhǎng) 20～30 d時(shí)剪幼芽繼代培養(yǎng)便獲得生長(zhǎng)旺盛的幼苗。移栽前30 d轉(zhuǎn)入不加任何激素的MS生根培養(yǎng)基，全部幼苗都能正常生根。AcAc×AhAh組合和AACC×AcAc組合分別以0.80和0.62的成功率獲得雜種植株（表2）。

2.2 雜種后代形態(tài)學(xué)特征

AACC×AcAc雜交后代植株的葉片形態(tài)和葉片大小接近甘藍(lán)型油菜，苗期葉裂比甘藍(lán)型油菜更深，葉的長(zhǎng)度長(zhǎng)于甘藍(lán)型油菜，葉的顏色與甘藍(lán)型油菜相似，在葉片表面還覆蓋了一層薄薄的蠟質(zhì)（圖1-A、B）。雜種植株花呈黃色，形態(tài)與甘藍(lán)型油菜相似，開花較早，花期與親本相比較長(zhǎng)。推測(cè)可能是由于雜種結(jié)實(shí)率低，在生長(zhǎng)過程中生殖生長(zhǎng)時(shí)間短從而消耗營(yíng)養(yǎng)較少。雜種植株雌蕊外觀形態(tài)發(fā)育正常，但雄蕊發(fā)育不完全，花絲短，花藥中花粉含量少，可育花比例低（圖1-C）。成熟期雜種植株形態(tài)與甘藍(lán)型油菜相似，分枝較多，生長(zhǎng)旺盛，表現(xiàn)出一定的雜種優(yōu)勢(shì);花期較長(zhǎng)，田間自由授粉情況下能產(chǎn)生少量種子，每個(gè)角果5～10粒種子發(fā)育成熟。

AcAc×AhAh雜交組合中，雜種植株的葉片形態(tài)和大小與親本相似，有些雜種植株表面都覆蓋一層長(zhǎng)毛，表面粗糙（圖2-A、圖2-B、圖2-C）。雜種植株株高接近雙親，第一分枝高度卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于兩親本，一級(jí)分支數(shù)高于兩親本，每株角果數(shù)介于兩親本之間，大部分種子都能發(fā)育成熟（表3）。

2.3 花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂

AACC×AcAc雜交后代雖然營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)旺盛，在形態(tài)上表現(xiàn)出較強(qiáng)的雜種優(yōu)勢(shì)，但花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中出現(xiàn)較多的染色體行為異常。如染色體聯(lián)會(huì)時(shí)出現(xiàn)單價(jià)體，后期有的細(xì)胞出現(xiàn)落后染色體或染色體橋（圖1-D）。因此，雜種后代花粉育性較低，而且自交結(jié)實(shí)率低。而AcAc×AhAh雜種后代花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂各個(gè)階段染色體行為表現(xiàn)正常，花粉形成過程正常，花粉粒育性良好（圖2D）。從圖2-E可以看出，花粉母細(xì)胞處于減數(shù)第一次分裂后期，細(xì)胞的染色分別移向細(xì)胞的兩級(jí)，沒有出現(xiàn)染色體落后現(xiàn)象，染色均等分離，細(xì)胞的兩級(jí)均得到一個(gè)完整的染色體組。

3 結(jié)論與討論

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)在遺傳育種中應(yīng)用越來越廣泛，克服遠(yuǎn)緣雜交中生殖隔離，并不斷獲得新品種，為蕓薹屬植物遺傳改良提供了豐富的資源基礎(chǔ)[13-15]。為了利用作物種間優(yōu)良的遺傳資源，用小白菜與黃芽白、小白菜與甘藍(lán)型油菜進(jìn)行雜交，并且通過人工去雄、輔助授粉和胚培養(yǎng)等輔助方法獲得了后代雜種。黃芽白和小白菜進(jìn)行雜交，親和性好，結(jié)實(shí)正常，雜交種子沒有出現(xiàn)結(jié)籽異常的現(xiàn)象，表明小白菜型油菜種內(nèi)不同栽培種之間雜交容易進(jìn)行。而甘藍(lán)型油菜與小白菜之間雜交親和性較差。在眾多植物遠(yuǎn)緣雜交中，兩親本的染色體數(shù)目的多少也會(huì)影響雜交的親和性[16]。母本選擇染色體數(shù)量多的雜交后代更容易獲得[17-18]。在本試驗(yàn)中，小白菜與甘藍(lán)型油菜間雜交的組合中，選用染色體少的小白菜做母本，染色體數(shù)量多的甘藍(lán)型油菜做父本，授粉后20 d進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，出現(xiàn)了雜交結(jié)籽異常的情況，雜交不親和，結(jié)籽粒少，莢內(nèi)發(fā)芽數(shù)多等情況，還有些胚乳出現(xiàn)嚴(yán)重?cái)牡默F(xiàn)象，胚死亡而沒有得到雜種種子。而在以甘藍(lán)型油菜為母本的反交組合中，兩親本的親和性表現(xiàn)較好。外界環(huán)境因素是影響油菜遠(yuǎn)緣雜交親和性大小的因素之一[19]。外界環(huán)境因素也會(huì)對(duì)油菜雜交產(chǎn)生一定的影響，長(zhǎng)日照高溫之所以會(huì)提高植物雜交親和力，主要是長(zhǎng)日照高溫促進(jìn)植物受精作用，使得植株受精過程中的生理生化反應(yīng)得以改變[20]。隨著現(xiàn)代科學(xué)和生物科技的不斷發(fā)展，較好地克服了遠(yuǎn)緣雜交的不親和性，并為油菜育種提供了另一方法與途徑。選用的雜交組合不一樣，雜交后代的親和性也不同[21]。雜交親本的選擇和外界環(huán)境因素共同作用影響雜交親和性，在棉花雜交中也出現(xiàn)類似情況[22]。

遠(yuǎn)緣雜交不親合表現(xiàn)在有性繁殖過程的多個(gè)環(huán)節(jié)?；ǚ酃苌L(zhǎng)遲緩且畸形，導(dǎo)致花粉無法到達(dá)胚珠而出現(xiàn)受精受阻的現(xiàn)象;還有一種原因可能是因?yàn)樵谌斯るs交的過程中，花粉的黏合性比較差，花粉很難一直保持在柱頭上;受精后因?yàn)檫h(yuǎn)緣雜交的植株之間產(chǎn)生的不親和性，胚乳又表現(xiàn)出敗壞，最終出現(xiàn)胚死亡的現(xiàn)象。總的來說，一般情況下的人工雜交難以獲得成功，因此，胚培養(yǎng)是克服雜種幼胚夭亡最有效的方法，許多遠(yuǎn)緣雜種通過人工雜交結(jié)合胚培養(yǎng)而獲得[22]。

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