余文杰 喬俊卿 易厚天 左楊 劉永鋒 劉郵洲

摘要：綠針假單胞菌（Pseudomonas chlororaphis）YL-1是一種對(duì)多種病原菌均有良好防治效果的生防菌株，前期研究結(jié)果表明，在室內(nèi)缺鐵培養(yǎng)基和自然環(huán)境中，綠針假單胞菌的主要抑菌物質(zhì)是其分泌的熒光性嗜鐵素（Pyoverdine，簡(jiǎn)稱PVD）。為提高其嗜鐵素的產(chǎn)量，采用搖瓶培養(yǎng)發(fā)酵，通過 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)、中心組合（CCD）試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)曲面法，優(yōu)化YL-1菌株高產(chǎn)嗜鐵素的發(fā)酵培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件，最終獲得YL-1菌株高產(chǎn)嗜鐵素的最佳培養(yǎng)基成分為1.52 g/L丁二酸、2.00 g/L丁二酸鈉、0.88 g/L MgSO4·7H2O、0.50 g/L （NH4）2SO4、0.50 g/L蔗糖、3.49 g/L KH2PO4，5.44 g/L K2HPO4，最佳培養(yǎng)條件：溫度為26 ℃，pH值為7.0，發(fā)酵時(shí)間為36 h，接種量為2%，轉(zhuǎn)速為180 r/min，裝液量為250 mL三角瓶裝50 mL液體。搖瓶試驗(yàn)結(jié)果表明，優(yōu)化培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件后，菌株YL-1嗜鐵素的產(chǎn)量提高43.18%，D405 nm/D600 nm值為2.36，優(yōu)化效果明顯。

關(guān)鍵詞：綠針假單胞菌;熒光性嗜鐵素PVD;發(fā)酵培養(yǎng)基;發(fā)酵條件;工藝優(yōu)化

中圖分類號(hào)：S182 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）24-0225-08

收稿日期：2021-04-09

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金 （編號(hào)：31672076）;蘇州市科技計(jì)劃 （編號(hào)：SNG2018095） 。

作者簡(jiǎn)介：余文杰（1997—），男，安徽淮南人，碩士研究生，主要從事植物病害生物防治研究。E-mail：260717453@qq.com。

通信作者：劉郵洲，博士，研究員，主要從事植物病害生物防治與農(nóng)藥開發(fā)研究。E-mail：shitouren88888@163.com。

鐵是一種地殼中廣泛存在的微量元素，同時(shí)也是許多生物體維持正常生命活動(dòng)所必需的，但由于鐵元素的特性導(dǎo)致自然環(huán)境中可以使用的自由鐵濃度遠(yuǎn)低于大部分微生物的生理需求[1]。為吸收土壤中的鐵元素以滿足自身需求，生物體需要形成一套高效的鐵吸收機(jī)制來維持自身生命活動(dòng)，包括還原機(jī)制、螯合機(jī)制以及質(zhì)子化機(jī)制，其中，利用嗜鐵素（siderophore，別稱鐵載體）來運(yùn)轉(zhuǎn)外界鐵離子是生物體較為重要的一種螯合機(jī)制[2]。

假單胞菌（Pseudomonas spp.）是一種常見的革蘭氏陰性菌，廣泛存在于自然環(huán)境中，可以抑制多種植物病原菌的生長(zhǎng)[3]。假單胞菌可以產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，已報(bào)道的主要是吩嗪類 （Phenazine，簡(jiǎn)稱PHZ）、硝吡咯菌素 （Pyrrolnitrin，簡(jiǎn)稱PRN）、藤黃綠膿菌素 （Pyoluteorin，簡(jiǎn)稱PLT）、氫氰酸（HCN）和熒光性嗜鐵素（Pyoverdine，簡(jiǎn)稱PVD）等[4-5]。PVD作為一種鐵螯合劑，可以螯合周圍環(huán)境中的鐵離子，使病原菌無(wú)法獲得生長(zhǎng)所必需的鐵營(yíng)養(yǎng)，生長(zhǎng)發(fā)育受到抑制[6]。Chen等發(fā)現(xiàn)，臺(tái)灣假單胞菌（P. taiwanensis）可以產(chǎn)生PVD，對(duì)水稻白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）生長(zhǎng)有抑制作用[7];Chlebek 等發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)嗜鐵素的熒光假單胞菌（P. fluorescens）BRZ63對(duì)多種病原真菌均有抑制作用[8];Ran等從馬鈴薯根際中分離出生防細(xì)菌-惡臭假單胞桿菌（P. putida）WCS358r菌株，該菌株產(chǎn)生的嗜鐵素可以抑制桉樹灰霉病的發(fā)生[9]。假單胞菌分泌的PVD的基本結(jié)構(gòu)由二羥基喹啉集團(tuán)、1條肽鏈、1條脂肪酸側(cè)鏈組成，在自然光下呈黃綠色，紫外光激發(fā)時(shí)可以發(fā)生熒光反應(yīng)，這一特性是其種屬所特有的[10]。

綠針假單胞菌（P. chlororaphis）YL-1是筆者所在實(shí)驗(yàn)室從大豆根圍分離獲得的一株對(duì)多種病原菌均有良好抑制作用的生防菌[11]。前期研究結(jié)果表明，在室內(nèi)缺鐵培養(yǎng)基和自然環(huán)境中，菌株 YL-1 分泌的PVD具有明顯的抑菌作用，且結(jié)構(gòu)新穎[10]。本研究首先比較8種常見嗜鐵素發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)菌株YL-1產(chǎn)生嗜鐵素的影響，篩選出最佳的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，通過Plackett-Burman試驗(yàn)、中心組合（central composite design，簡(jiǎn)稱CCD）試驗(yàn)和響應(yīng)曲面法對(duì)菌株YL-1基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化;同時(shí)，采用單因素篩選的方法，探明菌株YL-1產(chǎn)嗜鐵素的最佳培養(yǎng)條件，旨在為菌株YL-1的田間應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和培養(yǎng)基

綠針假單胞菌YL-1由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所水稻病害與生物防治研究室保存。

8種常見培養(yǎng)基及配方：（1）1/2胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）培養(yǎng)基：15.00 g胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，1 000 mL蒸餾水;（2）LB培養(yǎng)基：10.00 g胰蛋白胨、5.00 g酵母提取物、10.00 g NaCl、1 000 mL蒸餾水;（3）SM培養(yǎng)基：3.00 g KH2PO4、6.00 g K2HPO4、0.10 g MgSO4·7H2O、1.00 g （NH4）2SO4、4.00 g丁二酸、1 000 mL蒸餾水，pH值為7.0;（4）Iron-limited medium：12.80 g Na3PO4·7H2O、3.00 g KH2PO4、0.50 g NaCl、1.00 g NH4Cl、0.50 g MgSO4·7H2O、21.90 mg CaCl2、4.00 g葡萄糖、10.00 g酸水解酪蛋白、5 mL丙三醇、1 000 mL蒸餾水;（5）Succinate medium：3.00 g KH2PO4、6.00 g K2HPO4、0.10 g MgSO4·7H2O、1.00 g （NH4）2SO4、4.00 g丁二酸鈉、1 000 mL蒸餾水、pH值為7.0;（6）金氏培養(yǎng)基甲：20.00 g蛋白胨、1.40 g MgCl2、10.00 g K2SO4、10 mL 丙三醇、1 000 mL蒸餾水;（7）金氏培養(yǎng)基乙：20.00 g蛋白胨、1.50 g K2HPO4、1.50 g MgSO4·7H2O、10 mL丙三醇、1 000 mL蒸餾水;（8）WW[12]培養(yǎng)基：1.50 g丙三醇、1.00 g酸水解酪蛋白、2.50 g MgSO4·7H2O、2.50 g K2HPO4、1 000 mL 蒸餾水、pH值為6.5。

1.2 主要試劑和儀器

主要試劑包括CuSO4、NH4Cl、NaCl、KH2PO4、MgSO4·7H2O均購(gòu)自西隴化工股份有限公司;瓊脂粉、胰蛋白胨、酵母提取物均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司;丁二酸、K2HPO4、（NH4）2SO4均購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司;胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基購(gòu)自杭州百思生物技術(shù)有限公司;K2SO4、MgCl2、丁二酸鈉、檸檬酸鈉、甘油、葡萄糖、丙三醇均購(gòu)自西隴化工股份有限公司;蔗糖、酸水解酪蛋白、蛋白胨、Na3PO4·7H2O、CaCl2、MnSO4均購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司。

主要儀器包括電子天平（JM-A6002 余姚市紀(jì)銘稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司）、離心機(jī)（Eppendorf AG Germany）、分光光度計(jì)（UVmini-1240 SHIMADZU）、恒溫培養(yǎng)振蕩器（ZWY-240 上海智城分析儀器制造有限公司）、光照培養(yǎng)箱（寧波東南儀器有限公司）、立式高壓蒸汽滅菌器（LDZF-50L-Ⅱ 上海申安醫(yī)療器械廠）、超凈工作臺(tái)（SW-CJ-1CU 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、微量移液槍（德國(guó)Eppendorf公司）、pH值儀[Starter 2100奧豪斯儀器（上海）有限公司]。

1.3 發(fā)酵種子液的制備

試驗(yàn)于2021年1月在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所進(jìn)行。首先取-70 ℃冰箱保存的 YL-1 菌種于LB平板活化，28 ℃倒置培養(yǎng)，待平板上長(zhǎng)出單菌落后，挑取單菌落接種于20 mL LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min過夜培養(yǎng)，待培養(yǎng)液D600 nm≈1.0，即為發(fā)酵種子液。

1.4 培養(yǎng)基中嗜鐵素產(chǎn)量的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[12]測(cè)定嗜鐵素產(chǎn)量，將發(fā)酵種子液以1 ∶100比例轉(zhuǎn)接至100 mL培養(yǎng)基中，28 ℃，180 r/min 搖菌培養(yǎng)48 h。取2 mL菌液于2 mL EP管中，6 000 r/min離心10 min，分離上清液和菌體。將上清液移入新的2 mL EP管中，菌體用2 mL PBS緩沖液充分懸浮。以無(wú)菌培養(yǎng)基為對(duì)照，測(cè)其上清液D405 nm值;以PBS緩沖液為對(duì)照，測(cè)其菌體D600 nm值。計(jì)算D405 nm/D600 nm值，即為嗜鐵素的相對(duì)產(chǎn)量，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 發(fā)酵培養(yǎng)基篩選試驗(yàn)

1.5.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的篩選

比較菌株YL-1在8種常見培養(yǎng)基中的D405 nm/D600 nm值，篩選最佳的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

1.5.2 發(fā)酵培養(yǎng)基單因素篩選

根據(jù)基礎(chǔ)培養(yǎng)基篩選結(jié)果可知，菌株YL-1在SM培養(yǎng)基中嗜鐵素產(chǎn)量最高，以SM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，研究不同碳源、氮源、金屬離子以及鹽離子對(duì)菌株YL-1產(chǎn)生嗜鐵素的影響。

1.5.2.1 碳源對(duì)菌株YL-1產(chǎn)生嗜鐵素的影響 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，不改變其他成分，向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入丁二酸鈉、蔗糖、甘油、葡萄糖;同時(shí)，將丁二酸替換為丁二酸鈉、蔗糖、甘油、葡萄糖、嗜鐵素產(chǎn)量測(cè)定同“1.4”節(jié)，觀察碳源的增加或改變對(duì)菌株YL-1產(chǎn)生嗜鐵素的影響。

1.5.2.2 氮源對(duì)菌株YL-1產(chǎn)生嗜鐵素的影響 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，不改變其他成分，向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入酸水解酪蛋白、蛋白胨;同時(shí)將（NH4）2SO4替換為酸水解酪蛋白、蛋白胨，嗜鐵素產(chǎn)量測(cè)定同“1.4”節(jié)，觀察氮源的增加或改變對(duì)菌株YL-1產(chǎn)生嗜鐵素的影響。

1.5.2.3 金屬離子及鹽離子對(duì)菌株YL-1產(chǎn)生嗜鐵素的影響 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，不改變其他成分，向培養(yǎng)基中加入一定濃度的CaCl2、CuSO4、MnSO4、NaCl，嗜鐵素產(chǎn)量測(cè)定同“1.4”節(jié)，觀察金屬離子以及鹽離子的加入對(duì)菌株YL-1產(chǎn)生嗜鐵素的影響。

1.5.3 Plackett-Burman試驗(yàn)與最陡爬坡試驗(yàn)

選取單因素篩選試驗(yàn)對(duì)嗜鐵素產(chǎn)量有較大提高作用的影響因子，采用Design Expert 10軟件設(shè)計(jì)PB搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)，試驗(yàn)中每個(gè)因子設(shè)計(jì)高低2個(gè)水平，觀察其對(duì)嗜鐵素產(chǎn)生是否有顯著影響，試驗(yàn)重復(fù)3次。根據(jù)PB試驗(yàn)結(jié)果，篩選出對(duì)嗜鐵素產(chǎn)量有顯著影響的培養(yǎng)基關(guān)鍵成分并采用最陡爬坡試驗(yàn)確定關(guān)鍵因素的用量，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5.4 中心組合試驗(yàn)

在PB、最陡爬坡試驗(yàn)后，采用中心組合（CCD）試驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基關(guān)鍵成分進(jìn)行響應(yīng)曲面法優(yōu)化，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 培養(yǎng)條件篩選

1.6.1 溫度對(duì)菌株YL-1產(chǎn)嗜鐵素的影響

培養(yǎng)基初始pH值為7.0，在含100 mL培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中接種1%種子液，分別在24.0、25.0、25.5、26.0、26.5、27.0、27.5、28.0、30.0、32.0、34.0 ℃，180 r/min條件下培養(yǎng)48 h后測(cè)定嗜鐵素產(chǎn)量，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6.2 pH值對(duì)菌株YL-1產(chǎn)嗜鐵素的影響

培養(yǎng)基初始pH值分別設(shè)定為6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4，共計(jì)6個(gè)處理，在含100 mL培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中接種1%種子液，在26 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)48 h后測(cè)定嗜鐵素產(chǎn)量，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株YL-1產(chǎn)嗜鐵素的影響

培養(yǎng)基初始pH值為7.0，在含100 mL培養(yǎng)液的250 mL 三角瓶中接種1%種子液，26 ℃，180 r/min條件下培養(yǎng)，取不同時(shí)間段的發(fā)酵液測(cè)定嗜鐵素產(chǎn)量，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6.4 接種量對(duì)菌株YL-1產(chǎn)嗜鐵素的影響

培養(yǎng)基初始pH值為7.0，在含100 mL培養(yǎng)液的 250 mL 三角瓶中接種比例分別設(shè)定為0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%，共計(jì)5個(gè)處理，26 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)36 h后測(cè)定嗜鐵素產(chǎn)量，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6.5 轉(zhuǎn)速對(duì)菌株YL-1產(chǎn)嗜鐵素的影響

培養(yǎng)基初始pH值為7.0，在含100 mL培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中接種2%種子液，轉(zhuǎn)速分別設(shè)定為140、160、180、200 r/min，共計(jì)4個(gè)處理，26 ℃培養(yǎng)36 h后測(cè)定嗜鐵素產(chǎn)量，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6.6 裝液量對(duì)菌株YL-1產(chǎn)嗜鐵素的影響

培養(yǎng)基初始pH值為7.0，分別在含50、75、100、125、150 mL 培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中接種2%種子液，26 ℃、180 r/min培養(yǎng)36 h后測(cè)定嗜鐵素產(chǎn)量，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證

根據(jù)CCD試驗(yàn)結(jié)果以及培養(yǎng)條件篩選結(jié)果，配制優(yōu)化后的培養(yǎng)基，運(yùn)用新的培養(yǎng)條件，與原始培養(yǎng)基進(jìn)行比較，驗(yàn)證優(yōu)化結(jié)果，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 數(shù)據(jù)分析

Plackett-Burman試驗(yàn)、中心組合試驗(yàn)及響應(yīng)曲面試驗(yàn)均利用Design Expert 10軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的篩選

由圖1可知，在8種培養(yǎng)基中，菌株YL-1在SM液體培養(yǎng)基中D405 nm/D600 nm值最高，達(dá)到1.61;其次是WW培養(yǎng)基，D405 nm/D600 nm值為1.08;菌株YL-1在金氏培養(yǎng)基甲、LB和1/2 TSA液體培養(yǎng)基中產(chǎn)生的嗜鐵素較少，D405 nm/D600 nm值分別為0.23、0.21、0.18。試驗(yàn)結(jié)果說明，在8種常見培養(yǎng)基中，SM培養(yǎng)基最適合菌株YL-1產(chǎn)生嗜鐵素。

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基單因素篩選

2.2.1 碳源對(duì)菌株YL-1產(chǎn)生嗜鐵素的影響

由圖2可知，單一碳源時(shí)，菌株YL-1在以丁二酸為碳源的SM液體培養(yǎng)基中嗜鐵素產(chǎn)量最高，D405 nm/D600 nm值為1.61，其他碳源替換處理情況下，D405 nm/D600 nm值均明顯下降;如果維持培養(yǎng)液中丁二酸成分不變，向其中加入丁二酸鈉，D405 nm/D600 nm值為2.13，嗜鐵素的產(chǎn)量提高32.29%，加入蔗糖時(shí)，D405 nm/D600 nm比值為1.64，嗜鐵素產(chǎn)量也略有提升。因此，接下來的研究將以丁二酸、丁二酸鈉、蔗糖為碳源進(jìn)一步優(yōu)化。

2.2.2 氮源對(duì)菌株YL-1產(chǎn)生嗜鐵素的影響

由圖3可知，（NH4）2SO4為菌株YL-1產(chǎn)嗜鐵素的最佳氮源，D405 nm/D600 nm值為1.61。當(dāng)?shù)刺鎿Q為酸水解酪蛋白時(shí)，D405 nm/D600 nm值為0.84，氮源替換為蛋白胨時(shí)，D405 nm/D600 nm值僅為0.48。此外，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中增加氮源會(huì)降低菌株YL-1嗜鐵素的產(chǎn)量。因此，將以（NH4）2SO4為氮源進(jìn)行使用量的優(yōu)化。

2.2.3 金屬離子及鹽離子對(duì)菌株YL-1產(chǎn)生嗜鐵素的影響

由圖4可知，SM培養(yǎng)基中加入金屬離子及鹽離子反而降低了菌株YL-1嗜鐵素的產(chǎn)量，如在SM培養(yǎng)基中加入NaCl時(shí)，D405 nm/D600 nm值下降為0.55，加入MnSO4時(shí)，D405 nm/D600 nm值下降為0.46，加入CuSO4時(shí)，D405 nm/D600 nm值下降為0.41，加入CaCl2時(shí)，D405 nm/D600 nm值下降為0.21。據(jù)此說明，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中不需要再額外添加金屬離子及鹽離子。

2.3 PB試驗(yàn)與最陡爬坡試驗(yàn)

由表1可知，KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、丁二酸這4個(gè)因子對(duì)嗜鐵素的產(chǎn)量有顯著影響（P<0.05）。隨后進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)來確定關(guān)鍵因子的最佳用量，當(dāng)丁二酸、MgSO4·7H2O、KH2PO4、K2HPO4的用量分別為3.00、2.00、3.00、5.00 g/L時(shí)，培養(yǎng)液D405 nm/D600 nm值達(dá)到爬坡試驗(yàn)的最高值2.23。

2.4 CCD試驗(yàn)以及相應(yīng)曲面分析

在基于PB試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)4因素5水平的CCD試驗(yàn)來確定各因素的最佳用量，對(duì)培養(yǎng)基成分進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多重回歸分析后，得出產(chǎn)物產(chǎn)率的二次多項(xiàng)方程式：Y=-5.571 27+2.227 71X1+1.350 63X2+0.417 39X3+1.610 56X4+0.059 861X1X2-0.235 19X1X3 -0.323 44X1X4-0.174 03X2X3-0.044 028X2X4+0.158 81X3X4-0.117 55X21-0.452 11X22-0.0703 02X23-0.132 93X24，校正系數(shù)R2=0.974 9。

式中：Y是嗜鐵素產(chǎn)量的預(yù)測(cè)值;X1、X2、X3、X4分別是丁二酸、MgSO4·7H2O、KH2PO4、K2HPO4。方差分析結(jié)果見表2。試驗(yàn)中變異系數(shù)（CV）為9.14%（<10%），屬于弱變異，證明試驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性，表2中P、R2、F值都進(jìn)一步證明了模型對(duì)嗜鐵素產(chǎn)量預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。

根據(jù)得到的二次多項(xiàng)方程式求得4個(gè)因素的最優(yōu)值，即丁二酸、MgSO4·7H2O、KH2PO4、K2HPO4的用量分別為1.52、0.88、3.49、5.44 g/L時(shí)，嗜鐵素產(chǎn)量預(yù)測(cè)能達(dá)到最大，預(yù)測(cè)D405 nm/D600 nm值為2.25。

2.5 培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.5.1 溫度和pH值對(duì)菌株YL-1產(chǎn)嗜鐵素的影響

當(dāng)溫度處于25.5～26.5 ℃這一范圍內(nèi)時(shí)，嗜鐵素產(chǎn)量較高，其中溫度為26 ℃時(shí)，D405 nm/D600 nm值為2.39。當(dāng)溫度高于28 ℃時(shí)，菌株YL-1產(chǎn)嗜鐵素的能力會(huì)迅速降低，32 ℃時(shí)，D405 nm/D600 nm值降低至1.56（圖5）。培養(yǎng)液pH值對(duì)菌株YL-1產(chǎn)嗜鐵素的影響較大。由圖6可知，產(chǎn)嗜鐵素的最適pH值出現(xiàn)在6.6～7.4這一范圍內(nèi)，其中培養(yǎng)液pH值為7.0時(shí)，D405 nm/D600 nm值為2.23，pH值為6.6、7.4時(shí)，D405 nm/D600 nm值分別為1.70、1.42。據(jù)此，研究中培養(yǎng)溫度設(shè)定為26 ℃，pH值設(shè)定為7.0。

2.5.2 發(fā)酵時(shí)間、接種量、轉(zhuǎn)速和裝液量對(duì)菌株 YL-1 產(chǎn)嗜鐵素的影響

菌株YL-1嗜鐵素的產(chǎn)量隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而不斷提高，接種后12 h時(shí)，D405 nm/D600 nm值為0.65;24 h時(shí)，D405 nm/D600 nm值為1.25;36 h時(shí)，D405 nm/D600 nm值為1.68;48 h 時(shí)，D405 nm/D600 nm值達(dá)到1.69，與36 h相比，無(wú)顯著差異，因此選擇36 h為最佳發(fā)酵時(shí)間（圖7）。隨著接種量的提高，菌株YL-1嗜鐵素的產(chǎn)量呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)接種量為2%時(shí)，嗜鐵素的產(chǎn)量最高，D405 nm/D600 nm值為2.30。當(dāng)接種量繼續(xù)上升后，菌株YL-1產(chǎn)嗜鐵素的能力快速下降，當(dāng)接種量為4%時(shí)，D405 nm/D600 nm值為1.31。這可能是由于嗜鐵素的合成和菌株YL-1的生長(zhǎng)處于一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，當(dāng)接種量增大時(shí)，菌株較多地利用培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分供自身生長(zhǎng)，從而影響了嗜鐵素的合成（圖8）。當(dāng)轉(zhuǎn)速為180 r/min時(shí)，嗜鐵素的產(chǎn)量最高，D405 nm/D600 nm值為2.05，其他過高或過低的3個(gè)轉(zhuǎn)速反而會(huì)影響菌株YL-1產(chǎn)生嗜鐵素的能力，當(dāng)轉(zhuǎn)速為140 r/min時(shí)，D405 nm/D600 nm值為1.22，當(dāng)轉(zhuǎn)速為200 r/min時(shí)，D405 nm/D600 nm值為1.69（圖9）。當(dāng)在250 mL三角瓶中裝液50 mL時(shí)，菌株YL-1產(chǎn)嗜鐵素的能力最高，D405 nm/D600 nm值為2.33。推測(cè)較少的裝液量提高了瓶中的氧含量，因此提高了菌株YL-1生長(zhǎng)繁殖的速度，進(jìn)而增加了嗜鐵素的產(chǎn)量（圖10）。

2.6 搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證

菌株YL-1在優(yōu)化培養(yǎng)基中培養(yǎng) 36 h、溫度為26 ℃、pH值為7.0、接種量為2%、轉(zhuǎn)速為180 r/min以及裝液量為50 mL（250 mL三角瓶中），D405 nm/D600 nm值為2.36（圖11），與模型預(yù)測(cè)值接近。與原始出發(fā)培養(yǎng)基（SM培養(yǎng)基）相比，培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化后菌株YL-1的嗜鐵素產(chǎn)量提升43.18%，肉眼觀察發(fā)酵液的顏色更加黃綠，紫外光下觀察發(fā)酵液的熒光反應(yīng)更加強(qiáng)烈（圖12）。

3 討論與結(jié)論

嗜鐵素是假單胞菌產(chǎn)生的重要抗菌物質(zhì)，通過螯合周圍環(huán)境中的鐵離子，形成不能為其他病原菌所利用的鐵-嗜鐵素復(fù)合物，從而起到抑制病原菌生長(zhǎng)的作用。同時(shí)，嗜鐵素也有促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用，武雯雯等發(fā)現(xiàn)，用嗜鐵素處理黑麥草種子后，種子發(fā)芽率提高150.92%，提升效果顯著[13]。Trapet等發(fā)現(xiàn)，熒光假單胞菌C7R12分泌的嗜鐵素能促進(jìn)擬南芥的生長(zhǎng)[14]。而在臨床醫(yī)學(xué)上，嗜鐵素作為一種鐵螯合劑，可以用來治療人體內(nèi)鐵過量而引發(fā)的疾病，如地中海貧血癥[15]。除此之外，越來越多的醫(yī)學(xué)研究人員對(duì)微生物的鐵吸收系統(tǒng)非常有興趣，由此引發(fā)藥物的“特洛伊木馬策略”，即利用鐵載體攝取機(jī)制，將藥物和鐵載體偶聯(lián)，使藥物更容易進(jìn)入靶向病原微生物，同時(shí)還不會(huì)產(chǎn)生抗藥性[16-17]。因此，開發(fā)利用高產(chǎn)嗜鐵素的生防菌、提高嗜鐵素產(chǎn)量均具有重要意義。

有關(guān)嗜鐵素發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件篩選的研究，目前已有多篇報(bào)道，如伊艷杰等研究了熒光假單胞菌RB5產(chǎn)嗜鐵素的發(fā)酵條件[18]，梁建根等對(duì)惡臭假單孢菌（P. putida）HZ-2產(chǎn)生嗜鐵素的發(fā)酵培養(yǎng)基及條件進(jìn)行了篩選[19]。但這些報(bào)道大多只使用單因素篩選的方法來考察嗜鐵素發(fā)酵條件，而且對(duì)培養(yǎng)基成分未做優(yōu)化。近年來，Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)和中心組合試驗(yàn)被廣泛運(yùn)用于微生物發(fā)酵工藝的篩選和優(yōu)化[20]。許睿娉利用Plackett-Burman試驗(yàn)得到了枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）HG-15菌株發(fā)酵最佳培養(yǎng)基，與基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比，發(fā)酵液菌體數(shù)量提高2.74倍[21]，董文等采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)對(duì)銅綠假單胞菌（P. aeruginosa）DN1產(chǎn)鼠李糖脂的發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后鼠李糖脂的產(chǎn)量提高了73.97%[22]。Sen等通過響應(yīng)曲面法對(duì)影響表面肌動(dòng)蛋白產(chǎn)量的培養(yǎng)基成分以及發(fā)酵條件等進(jìn)行了優(yōu)化研究[23]。本研究通過比較菌株YL-1在不同培養(yǎng)基中嗜鐵素的產(chǎn)量，篩選出基礎(chǔ)培養(yǎng)基SM培養(yǎng)基，D405 nm/D600 nm值為1.61。隨后通過Plackett-Burman試驗(yàn)、CCD試驗(yàn)以及響應(yīng)曲面法優(yōu)化菌株YL-1發(fā)酵培養(yǎng)基的成分，最終得出YL-1菌株高產(chǎn)嗜鐵素的最佳培養(yǎng)基成分：1.52 g/L丁二酸、2.00 g/L 丁二酸鈉、0.88 g/L MgSO4·7H2O、0.50 g/L （NH4）2SO4、0.50 g/L蔗糖、KH2PO4 3.49 g/L、5.44 g/L K2HPO4。模型預(yù)測(cè)的D405 nm/D600 nm值為2.25。隨后利用單因素篩選得出最佳發(fā)酵條件：溫度為26 ℃，pH值為7.0，培養(yǎng)時(shí)間為 36 h，接種量為2%，轉(zhuǎn)速為180 r/min，裝液量為 250 mL 三角瓶裝50 mL。通過實(shí)際搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證可知，與初始SM培養(yǎng)基相比，優(yōu)化后D405 nm/D600 nm值為2.36，嗜鐵素產(chǎn)量提高43.18%，優(yōu)化效果顯著。

本研究結(jié)果顯示，影響菌株YL-1產(chǎn)生嗜鐵素的主要培養(yǎng)基成分是KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、丁二酸，這與王偉的報(bào)道[24]基本一致。此外，還發(fā)現(xiàn)雖然同為假單胞菌，但不同的菌株、不同的培養(yǎng)基成分對(duì)嗜鐵素的產(chǎn)生影響很大。綠針假單胞菌YL-1產(chǎn)嗜鐵素的最適溫度為26 ℃，最適裝液量為50 mL，而夏清強(qiáng)等通過對(duì)假單胞菌P11培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化后，發(fā)現(xiàn)其最適溫度為30 ℃[25];伊艷杰等研究發(fā)現(xiàn)，熒光假單胞菌RB5最適裝液量為 90 mL[18]。當(dāng)然，本研究?jī)H在搖瓶中對(duì)綠針假單胞菌YL-1產(chǎn)嗜鐵素的培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件進(jìn)行了篩選和優(yōu)化，如需工廠化放大，還需要更多試驗(yàn)對(duì)其發(fā)酵工藝進(jìn)行完善，為菌株YL-1的進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Wang Y，Brown H N，Crowley D E，et al. Evidence for direct utilization of a siderophore，ferrioxamine B，in axenically grown cucumber[J]. Plant，Cell & Environment，1993，16（5）：579-585.

[2]Guerinot M L. Microbial iron transport[J]. Annual Review of Microbiology，1994，48（1）：743-772.

[3]Subashri R，Raman G，Sakthivel N.Biological control of pathogens and plant growth promotion potential of fluorescent pseudomonads[M]//Bacteria in agrobiology：disease management. Berlin，Heidelberg：Springer Berlin Heidelberg，2012：77-110.

[4]金 穎，胡洪波，張雪洪，等. 假單胞菌產(chǎn)生的抗生素研究[J]. 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2005，21（3）：106-109.

[5]趙 芳. 銅綠假單胞菌抗菌物質(zhì)的研究[D]. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012：10-19.

[6]Nagata T，Oobo T，Aozasa O.Efficacy of a bacterial siderophore，pyoverdine，to supply iron to Solanum lycopersicum plants[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering，2013，115（6）：686-690.

[7]Chen W J，Kuo T Y，Hsieh F C，et al. Involvement of type Ⅵ secretion system in secretion of irochelator pyoverdine in Pseudomonas taiwanensis[J]. Scientific Reports，2016，6：32950.

[8]Chlebek D，Pinski A，Z·ur J，et al. Genome mining and evaluation of the biocontrol potential of Pseudomonas fluorescens BRZ63，a new endophyte of oilseed rape （Brassica napus L.） against fungal pathogens[J]. International Journal of Molecular Sciences，2020，21（22）：8740.

[9]Ran L X，Xiang M L，Zhou B，et al. Siderophores are the main determinants of Fluorescent Pseudomonas strains in suppression of grey mould in Eucalyptus urophylla[J]. Phytopatology Research，2005，35（1）：6-12.

[10]Liu Y Z，Dai C，Zhou Y Q，et al. Pyoverdines are essential for the antibacterial activity of Pseudomonas chlororaphis YL-1 under low-iron conditions[J]. Applied and Environmental Microbiology，2021，87（7）：e02840-20.

[11]劉郵洲，Lu S E，Baird S M，等. 綠針假單胞菌YL-1抗細(xì)菌活性相關(guān)基因的克隆和分析[J]. 植物病理學(xué)報(bào)，2015，45（3）：307-316.

[12]Visaggio D，Pasqua M，Bonchi C，et al. Cell aggregation promotes pyoverdine-dependent iron uptake and virulence in Pseudomonas aeruginosa[J]. Frontiers in Microbiology，2015，6：902.

[13]武雯雯，薛林貴，張 璐，等. 一株產(chǎn)嗜鐵素耐鎘菌的分離及其對(duì)黑麥草種子萌發(fā)的作用[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，2021，48（6）：1895-1906.

[14]Trapet P，Avoscan L，Klinguer A，et al. The Pseudomonas fluorescens siderophore pyoverdine weakens Arabidopsis thaliana defense in favor of growth in iron-deficient conditions[J]. Plant Physiology，2016，171（1）：675-693.

[15]白國(guó)慧. 銅綠假單胞菌鐵載體pyoverdine在周質(zhì)空間合成途徑中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的研究[D]. 濟(jì)南：山東大學(xué)，2014：5-20.

[16]Wencewicz T A，Mllmann U，Long T E，et al. Is drug release necessary for antimicrobial activity of siderophore-drug conjugates？Syntheses and biological studies of the naturally occurring salmycin “Trojan Horse” antibiotics and synthetic desferridanoxamine-antibiotic conjugates[J]. BioMetals，2009，22（4）：633-648.

[17]Mislin G L A，Schalk I J.Siderophore-dependent iron uptake systems as gates for antibiotic Trojan horse strategies against Pseudomonas aeruginosa[J]. Metallomics，2014，6（3）：408-420.

[18]伊艷杰，周廣舟，時(shí) 玉，等. 熒光假單胞菌RB5產(chǎn)嗜鐵素的發(fā)酵條件[J]. 河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2011，32（6）：32-35，39.

[19]梁建根，施躍峰，竺利紅，等. 惡臭假單胞菌株HZ-2產(chǎn)嗜鐵素的發(fā)酵條件研究[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，20（4）：266-269.

[20]代志凱，張 翠，阮 征. 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和優(yōu)化及其在發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化中的應(yīng)用[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，2010，37（6）：894-903.

[21]許睿娉. 枯草芽孢桿菌HG-15菌體發(fā)酵全可溶培養(yǎng)基配方與條件優(yōu)化[D]. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2020：21-35.

[22]董 文，黃 朝，李艷鵬，等. 響應(yīng)曲面法優(yōu)化銅綠假單胞菌DN1的產(chǎn)鼠李糖脂條件[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2017，36（12）：5179-5186.

[23]Sen R，Swaminathan T. Response surface modeling and optimization to elucidate and analyze the effects of inoculum age and size on surfactin production[J]. Biochemical Engineering Journal，2004，21（2）：141-148.

[24]王 偉. 熒光嗜鐵素的發(fā)酵條件及其應(yīng)用初探[D]. 上海：上海師范大學(xué)，2006：51-55.

[25]夏清強(qiáng)，汪勁松，潘繼承. 產(chǎn)熒光嗜鐵素菌株P(guān)11的發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 化學(xué)與生物工程，2019，36（10）：47-50.