閆 研，謝耀軒，秦 斌，王鐵杰，殷 果

（深圳市藥品檢驗研究院 深圳藥品質(zhì)量標準研究重點實驗室，廣東 深圳 518057）

當歸養(yǎng)血丸由當歸、白芍和地黃等十味藥材組成，收載于《中國藥典》2015年版（一部），具有益氣養(yǎng)血調(diào)經(jīng)功效，在臨床上多用于治療月經(jīng)不調(diào)、氣血兩虛等疾病[1]。在質(zhì)量控制方面，《中國藥典》2015年版只規(guī)定了當歸、丹皮酚顯微鑒別項和薄層色譜（TLC）鑒別項，缺少含量測定項[1]；在含量測定方面，僅見相關(guān)文獻采用高效液相法分別測定阿魏酸、芍藥苷[2-7]。上述定性分析手段存在技術(shù)要求高、操作復雜、無法用于現(xiàn)場快速監(jiān)察等缺點。

近紅外光譜法（NIR），操作簡單，無需對樣品進行前處理，無需消耗其他材料或試劑，是一種綠色環(huán)保的快速分析方法。近紅外光譜法以其快速、無損、綠色環(huán)保的特點廣泛應用于藥品定性、定量分析中[8-9]，隨著技術(shù)發(fā)展成熟，逐漸應用于中藥材、飲片的快速檢測，對于有效控制中藥質(zhì)量有重要應用價值[10-16]。

本研究以2019年國家藥品評價性抽驗為契機，采用NIR建立當歸養(yǎng)血丸的一致性檢驗模型，及包含水分、芍藥苷、丹皮酚在內(nèi)的多指標成分的定量分析模型，用于當歸養(yǎng)血丸的快速定性鑒別和多成分定量分析與評價，以滿足當歸養(yǎng)血丸藥品質(zhì)量控制的需要。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

MATRIX-F型近紅外光譜儀，附有光纖探頭，InGaAs檢測器，OPUS5.0軟件。

1.2 試藥

本次國家評價性抽驗的樣品共涉及3個生產(chǎn)廠家的11批次當歸養(yǎng)血丸，經(jīng)深圳市藥品檢驗研究院中藥檢驗室符合性檢驗，合格率為100 %，另收集了與其功能和成分相近的藥品4批，樣品信息詳見表1。

表1 樣品信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定

按《中國藥典》2015年版通則0832水分測定法第四法操作[1]，測得當歸養(yǎng)血丸水分的含量范圍為4.9 %～9.0 %；參考文獻方法[2]測得芍藥苷的含量范圍為1.30～2.37 mg/g ；參考文獻方法[6]測得丹皮酚的含量范圍為0.50～1.25 mg/g，各指標成分測定值詳見表2。

2.2 光譜的采集

采用漫反射掃描法，通過光纖探頭采集樣品NIR圖譜。以儀器內(nèi)置背景為參比，波數(shù)范圍12 000～4000 cm-1，掃描累加次數(shù)32次，分辨率8 cm-1，每批次樣品重復測定6張光譜，作為原始光譜。1～15號樣品近紅外光譜疊加圖詳見圖1～2。

2.3 當歸養(yǎng)血丸（A公司）一致性檢驗模型

近紅外一致性檢驗模型是通過一致性指數(shù)（CI）值和CI限度比較法初篩樣品，方便快捷，準確率高[8]。當樣品量充足（≥3批次）時，可建立一致性檢驗模型對藥品的真?zhèn)芜M行鑒別，亦可針對品牌產(chǎn)品建立一致性檢驗模型，用于對市場上該品牌藥進行快速篩查。本研究對A公司和B公司兩家企業(yè)的當歸養(yǎng)血丸分別建立一致性檢驗模型，以區(qū)分不同廠家的當歸養(yǎng)血丸（品牌鑒別），或?qū)敋w養(yǎng)血丸和與其成分、功能相近的產(chǎn)品區(qū)分（真?zhèn)舞b別）。

表2 各指標成分含量測定結(jié)果

圖1 樣品近紅外原始光譜疊加圖

圖2 近紅外二階導數(shù)加矢量歸一化處理光譜圖

2.3.1 模型的建立 調(diào)取編號1～7樣品的42張原始光譜作為參考光譜，按照中國食品藥品檢定研究院發(fā)布的《近紅外光譜采集與建模技術(shù)規(guī)范》要求，采用二階導數(shù)+矢量歸一化法對原始光譜進行預處理，平滑點數(shù)為13，選擇特征譜段在9000～7500 cm-1、6900～5600 cm-1和5000～4250 cm-1，CI限度為5，建立當歸養(yǎng)血丸（A公司）一致性檢驗模型，詳見表3和圖3。

表3 一致性檢驗模型參數(shù)列表

2.3.2 模型的驗證 調(diào)取編號10～15樣品各一張圖譜，共6張光譜作為檢驗光譜，對當歸養(yǎng)血丸（A公司）一致性檢驗模型進行驗證。驗證結(jié)果見圖3，6批樣品的CI值均遠大于規(guī)定的CI限度5，驗證樣品與建模樣品差異顯著，說明該模型專屬性好，準確性高，能有效區(qū)分當歸養(yǎng)血丸（A公司）與不同生產(chǎn)廠家的同類產(chǎn)品及功能和成分相近的其他產(chǎn)品。

圖3 當歸養(yǎng)血丸（A公司）一致性檢驗模型驗證結(jié)果

2.4 當歸養(yǎng)血丸（B公司）一致性檢驗模型

2.4.1 模型的建立 調(diào)取編號8～10樣品的原始光譜作為參考光譜，采用二階導數(shù)+矢量歸一化法對原始光譜進行預處理方法，平滑點數(shù)為13，選擇特征譜段在9000～7500 cm-1，6900～5600 cm-1和5000～4250 cm-1，CI限度為7，建立一致性檢驗模型，詳見表4和圖4。

表4 一致性檢驗模型參數(shù)列表

2.4.2 模型的驗證 調(diào)取編號7，11～15樣品各一張圖譜，共6張光譜作為檢驗光譜，對當歸養(yǎng)血丸（B公司）一致性檢驗模型進行驗證。驗證結(jié)果見圖4，6批樣品的CI值均遠大于規(guī)定的CI限度7，驗證樣品與建模樣品差異顯著，說明該模型專屬性好，準確性高，能有效區(qū)當歸養(yǎng)血丸（B公司）與不同生產(chǎn)廠家的同類產(chǎn)品、以及功能和成分相近的其他產(chǎn)品。

2.5 多指標成分定量模型

采用偏最小二乘法（PLS）對當歸養(yǎng)血丸中水分、芍藥苷、丹皮酚這3個關(guān)鍵指標成分建立定量分析模型，用以預測未知樣品中各指標成分的含量。

圖4 當歸養(yǎng)血丸（B公司）一致性檢驗模型驗證結(jié)果

2.5.1 模型的建立及優(yōu)化 運用OPUS分析軟件，分別采用一階導數(shù)+多元散射校正（First Derivative+MSC）、一階導數(shù)+矢量歸一化（First Derivative+Vector Normalization）、一階導數(shù)+直線差值（First Derivative+Straight Line Subtraction）等 11種光譜預處理方法在12 000～4000 cm-1范圍內(nèi)對光譜預處理方法和光譜范圍做系統(tǒng)的優(yōu)化，通過內(nèi)部交叉驗證篩選較為優(yōu)化的模型參數(shù)，詳見表5。

表5 不同建模參數(shù)對各指標定量模型的影響

以相關(guān)系數(shù)（R2）和交叉驗證均方差（RMSECV）作為衡量指標，R2越接近1，RMSECV值越小，模型的精確度越高，最終確定各指標定量模型的建模參數(shù)，詳見表6。

2.5.2 模型的驗證 運用已建立的各指標定量模型對各指標含量進行預測，并與實測值比較，結(jié)果見表7。預測值與實測值相關(guān)性見圖5，預測誤差分布見圖6。各指標定量分析模型內(nèi)部交叉驗證相關(guān)系數(shù)（R2）分別為0.9492，0.9166，0.9260，交叉驗證均方根偏差（RMSECV）分別為0.290 %，0.0833 mg/g，0.0726 mg/g，模型的預測能力良好。

3 討論

本研究因樣品數(shù)量有限，采用內(nèi)部交叉驗證的方法建模和驗證，以保證模型的準確性。交叉驗證方法是：首選取出一個樣本，將剩余的樣本建立一個臨時模型，使用該模型來預測取出的這個樣本，如此重復、循環(huán)直至每個樣本均被檢驗分析，特點是每個樣品均被用于建模和驗證，適用于樣品數(shù)量有限（小于50個樣本）的系統(tǒng)建模，但運算量較大。因此，在后續(xù)研究中應收集更多、更具代表性的當歸養(yǎng)血丸樣品，不斷擴充到模型中，使模型更為穩(wěn)健、適用性更廣。

表6 各指標定量模型的建模參數(shù)

表7 各指標定量模型預測值與實測值比較

圖5 各指標定量模型預測值與實測值相關(guān)圖

圖6 各指標定量模型預測誤差分布圖

4 結(jié)論

本研究利用NIR分析技術(shù)，針對不同廠家的建立的一致性檢驗模型可以快速鑒別當歸養(yǎng)血丸，所建模型專屬性好，準確性高，可快速準確鑒別出不同廠家的當歸養(yǎng)血丸，可快速準確地區(qū)分當歸養(yǎng)血丸和與其功能、成分相近的同類產(chǎn)品。針對水分、芍藥苷和丹皮酚3個關(guān)鍵指標成分建立的當歸養(yǎng)血丸定量分析模型準確性高，預測偏差在合理范圍內(nèi)，可用于未知樣品多指標成分的含量預測。本研究建立的NIR快速分析方法操作簡單易掌握，樣品無需處理，為當歸養(yǎng)血丸多指標成分快速、無損檢測和質(zhì)量控制提供了技術(shù)支持，具有廣闊的應用前景。