蘭 瑩，薛 瑩，秦忠雪

（四川省疾病預(yù)防控制中心，四川 成都 610041）

杜仲平壓膠囊是杜仲葉經(jīng)提取、加工制成的膠囊劑，由收載于中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第11冊中的杜仲平壓片改變劑型而得，有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、降血壓功效[1-3]?，F(xiàn)代藥理研究表明杜仲葉的主要化學(xué)成分木脂素類（如桃葉珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇單葡萄糖苷）具有調(diào)節(jié)血壓血脂、抑制腫瘤細(xì)胞等作用；苯丙素類（如綠原酸）具有抗菌消炎、抗病毒、提高免疫力作用[4-6]。質(zhì)量控制是保證中藥臨床有效性及安全性的重要手段，目前，有關(guān)杜仲平壓膠囊的質(zhì)量控制研究主要為采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測定組方中一個(gè)或兩個(gè)有效成分[10-13]；在《中國藥典》2015年版一部中，僅以松脂醇二葡萄糖苷作為杜仲葉定量分析的指標(biāo)成分[14]。但中藥成分構(gòu)成是一個(gè)復(fù)雜體系，僅測定單一有效成分并不能全面反映中藥整體質(zhì)量。因此，為有效控制藥品質(zhì)量，本研究采用HPLC對杜仲平壓膠囊中桃葉珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇單葡萄糖苷4種成分含量同時(shí)進(jìn)行測定，以冀為杜仲平壓膠囊質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與儀器

1.1 儀器

美國Waters ACQUITY HPLCTM高效液相色譜儀（包括Empower 3.0色譜工作站，四元高壓泵系統(tǒng)，在線脫氣系統(tǒng)，自動進(jìn)樣器，柱溫箱和TUV檢測器，數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)）；XS215分析天平（美國Mettler Toledo公司）；XP6微量天平（美國Mettler Toledo公司）；KQ2576E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；KW8672J型離心機(jī)（北京京立離心機(jī)有限公司）。

1.2 材料

杜仲平壓膠囊（批號：20190908，20190913，20190918，濟(jì)寧明陽生物科技有限公司）；桃葉珊瑚苷對照品（批號：110712-201614），松脂醇二葡萄糖苷對照品（批號：AN965J01，純度99.6 %），松脂醇單葡萄糖苷對照品（批號：20181125，純度99.7 %，中國食品藥品檢定研究院）；綠原酸對照品（批號：G063981，純度98.8 %，成都曼斯特生物科技有限公司）；HPLC用甲醇（色譜純，德國Merck公司）；娃哈哈純凈水（批號：20181009，鄭州市哇哈哈純凈水公司）；甲醇（分析純，天津市康科德科技有限公司）；磷酸（分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC色譜條件

色譜柱：Diamonsil?Plus C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-0.05 %磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～8 min，7 %A～18 % A；8～16 min，18 %A～29 % A；16～26 min，29 %A～42 % A；26～38 min，42 %A～60 % A；38～42 min，60 %A～100 % A；42～46 min，100 %A～7 % A；46～55 min，7 % A）；檢測波長：330 nm；流速：1 ml/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μl。程序變化波長：10～15 min：210 nm（檢測桃葉珊瑚苷），16～20 min：320 nm（檢測綠原酸），30～35 min：230 nm（檢測松脂醇二葡萄糖苷），35～40 min：230 nm（檢測松脂醇單葡萄糖苷）。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取桃葉珊瑚苷、綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇單葡萄糖苷對照品各適量，分別置入10 ml量瓶，用70 %甲醇溶解并定容至刻度，分別得質(zhì)量濃度為1.2350，3.1250，0.6723，0.5231 mg/ml的對照品儲備液。精密移取綠原酸對照品儲備液l ml于10 ml量瓶，70 %甲醇定容至刻度，得0.3125 mg/ml綠原酸對照品溶液，之后精密移取其他各對照品儲備液1 ml及綠原酸對照品溶液1 ml于10 ml量瓶，70 %甲醇定容至刻度，搖勻，即得桃葉珊瑚苷、綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇單葡萄糖苷質(zhì)量濃度分別為0.1235，0.06723，0.05231，0.03125 mg/ml的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 取本品內(nèi)容物約0.2 g，精密稱定，置入10 ml量瓶，加70 %甲醇適量，密塞，稱量，超聲處理30 min（功率250W，頻率33 kHz），冷至室溫，再稱定重量，用70 %甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試樣品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液制備 取除去杜仲葉外的其他輔料，按2.2.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法制得陰性樣品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性考察 分別取對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行色譜分析，結(jié)果供試品溶液色譜圖中，與對照品對應(yīng)峰的保留時(shí)間處有吸收峰，而陰性樣品在對照品對應(yīng)峰的保留時(shí)間處未顯吸收峰，表明供試品中其他物質(zhì)對待

圖1 專屬性考察色譜圖

2.3.2 精密度考察 按2.2.2項(xiàng)下方法制備杜仲平壓膠囊（批號：20190913）供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測，連續(xù)進(jìn)樣6針，結(jié)果杜仲平壓膠囊中桃葉珊瑚苷、綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇單葡萄糖苷峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值分別為0.36 %，0.19 %，0.09 %，0.23 %，表明儀器精密度良好。

2.3.3 線性與范圍 精密稀釋2.2.1項(xiàng)下混合對照品儲備液，各成分濃度如下：桃葉珊瑚苷濃度分別為0.0123，0.0371，0.1235，0.2470，0.3705，1.2355 mg/ml；綠原酸濃度分別為0.0312，0.0625，0.3125，0.0625，0.9375，3.1250 mg/ml；松脂醇二葡萄糖苷濃度分別為0.0067，0.0134，0.0202，0.0672，0.1345，0.6723 mg/ml；松脂醇單葡萄糖苷濃度分別為0.0052，0.0105，0.0156，0.0523、0.1046，0.5231 mg/ml進(jìn)樣檢測，以各成分的濃度（x）對其峰面積（y）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，見表2。

2.3.4 穩(wěn)定性考察 按2.2.2項(xiàng)下方法制備本品（批號：20190913）供試品溶液，且分別于制備后0，1，2，4，8，12，24 h，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測，測定峰面積。結(jié)果杜仲平壓膠囊中桃葉珊瑚苷、綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇單葡萄糖苷峰面積的RSD值分別為1.31 %，0.36 %，1.65 %，2.02 %，1.08 %，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復(fù)性考察 取本品（批號：20190913）內(nèi)容物，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，進(jìn)樣檢測，以峰面積計(jì)算各成分含量。結(jié)果得6份供試品溶液中桃葉珊瑚苷、綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇單葡萄糖苷的平均含量分別為1.0601，5.7701，0.6853，0.3816 mg/g，RSD分別為0.87 %，1.06 %，1.35 %，2.28 %，說明重復(fù)性良好。

表2 線性關(guān)系

2.3.6 加樣回收率考察 取本品（批號：20190913）內(nèi)容物約0.1 g，精密稱定，共9份，分別置入10 ml量瓶，分為3組，以2.3.5項(xiàng)下所測桃葉珊瑚苷、綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇單葡萄糖苷平均含量作為加入對照品量的依據(jù)，分別加入約供試品中待測成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)80 %，100 %，120 %的對照品溶液各3份，其中加入桃葉珊瑚苷、綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇單葡萄糖苷對照品溶液濃度分別為0.1235，0.6250，0.1347，0.0523 mg/ml。按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，以峰面積計(jì)算4種待測成分的含量和加樣回收率，結(jié)果見表3～表6。

2.3.7 樣品測定 取3批本品內(nèi)容物，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按2.1項(xiàng)色譜條件測定供試品溶液中桃葉珊瑚苷、綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇單葡萄糖苷的含量。3批樣品（批號：20190908，20190913，20190918）的桃葉珊瑚苷、綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇單葡萄糖苷含量分別為1.0809，5.7982，0.6861，0.3821 mg/g；1.0794，5.7977，0.6848，0.38275 mg/g；1.0816，5.7989，0.6849，0.3835 mg/g。

3 討論

3.1 提取溶劑和方法考察

本實(shí)驗(yàn)對提取溶劑甲醇、50 %甲醇、70 %甲醇進(jìn)行考察，結(jié)果以70 %甲醇為提取溶劑樣品各待測成分含量較大，因此選擇70 %甲醇為提取溶劑。對超聲及回流提取方法進(jìn)行考察，結(jié)果2種方法提取率相差不大，但超聲操作較為簡便，因此選擇超聲提取方法。

3.2 超聲時(shí)間考察

對超聲提取10，15，20，30，40，60 min進(jìn)行考察，結(jié)果30 min后各待測成分含量趨于平穩(wěn)，因此選擇超聲時(shí)間為30 min。

3.3 流動相選擇

本研究分別對甲醇-水、0.1 %乙腈-水、甲醇-0.05 %磷酸水和乙腈-0.05 %磷酸水4個(gè)系統(tǒng)流動相進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用甲醇-0.05 %磷酸水作為流動相時(shí)，各峰的分離度較好，且基線平穩(wěn)，因此采用甲醇-0.05 %磷酸水系統(tǒng)作為流動相。

表3 桃葉珊瑚苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表4 綠原酸加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表5 松脂醇二葡萄糖苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表6 松脂醇單葡萄糖苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

3.4 檢測波長選擇

對4種成分標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別進(jìn)行UV全波長（190～400 nm）掃描，發(fā)現(xiàn)桃葉珊瑚苷在210 nm、綠原酸在320 nm、松脂醇二葡萄糖苷及松脂醇單葡萄糖苷在230 nm處均有最大吸收，基于杜仲平壓膠囊中各成分的最大吸收波長不同，為保證各成分在最大吸收波長處檢測，提高靈敏度，減少干擾，本實(shí)驗(yàn)采用了HPLC-DAD波長切換技術(shù)測定杜仲平壓膠囊中4種成分的含量。

綜上所述，本試驗(yàn)采用HPLC建立同時(shí)測定杜仲平壓膠囊中桃葉珊瑚苷、綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇單葡萄糖苷多組分含量的方法，所建立方法重復(fù)性好，可操作性強(qiáng)，且方法學(xué)考察結(jié)果顯示，專屬性、精密度、線性范圍、穩(wěn)定性、加樣回收率均符合要求，能準(zhǔn)確測定杜仲平壓膠囊中桃葉珊瑚苷、綠原酸、松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇單葡萄糖苷多組分含量，提高分析效率，為杜仲平壓膠囊質(zhì)量控制提供一定參考。