竇艷麗，牛 沖，康亞琪，文松松，陳 真，李 琳，徐玉文*

（1. 山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院 仿制藥研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東省仿制藥一致性評(píng)價(jià)工程技術(shù)研究中心，山東 濟(jì)南 250101；2. 山東大學(xué)第二醫(yī)院藥品調(diào)劑科，山東 濟(jì)南 250033）

米力農(nóng)（milrinone）為氨力農(nóng)的同類藥物，作用機(jī)制與氨力農(nóng)相同，屬于新型正性肌力藥物，是治療心衰的有效藥物，主要能強(qiáng)化心肌收縮能力，增加心排量，減輕心臟負(fù)荷，降低肺血管阻力，降低肺動(dòng)脈壓，改善心臟功能。近年研究結(jié)果表明，米力農(nóng)對(duì)老年慢性心臟病伴心力衰竭、高血壓心臟病伴心力衰竭、充血性心力衰竭均有較好的療效[1-5]。

米力農(nóng)注射液是由米力農(nóng)加乳酸制成的滅菌水溶液。米力農(nóng)注射液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中國(guó)藥典》2015年版（ChP2015）二部與美國(guó)藥典42版（USP 42），歐洲藥典10.0版（EP10.0）未收載此品種。國(guó)內(nèi)上市的該注射液采用葡萄糖或氯化鈉作滲透壓調(diào)節(jié)，鑒于采用葡萄糖調(diào)節(jié)滲透壓的產(chǎn)品在執(zhí)行ChP2015二部標(biāo)準(zhǔn)時(shí)出現(xiàn)有關(guān)物質(zhì)檢查結(jié)果不合格的現(xiàn)象，本文在ChP2015二部米力農(nóng)注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上采用雙波長(zhǎng)高效液相色譜法（HPLC）檢查有關(guān)物質(zhì)[6-8]，方法靈敏度高、操作簡(jiǎn)便，適用于采用不同滲透壓調(diào)節(jié)劑的產(chǎn)品。

1 儀器、試藥及樣品

Waters 2695 2489高效液相色譜儀（紫外檢測(cè)器，四元泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，美國(guó)Waters公司）；CP225D型十萬分之一電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）公司]；Millipore超純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）。

米力農(nóng)對(duì)照品（批號(hào)：101065-201001），5-羥甲基糠醛對(duì)照品（批號(hào)：111626-201509），米力農(nóng)雜質(zhì)I對(duì)照品（批號(hào)：101066-201001），米力農(nóng)雜質(zhì)II對(duì)照品（批號(hào)：101358-201501）均購自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇（色譜純，天津科密歐）；其余試劑為分析純。

米力農(nóng)注射液（用葡萄糖調(diào)節(jié)滲透壓的批號(hào)為16051，16221，14001，15105，15106；用氯化鈉調(diào)節(jié)滲透壓的批號(hào)為171001，201201，16088，17605）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 系統(tǒng)適用性溶液 取米力農(nóng)、5-羥甲基糠醛、雜質(zhì)I與雜質(zhì)II對(duì)照品各適量，用流動(dòng)相制成每1 ml中約含10，20，100與100 μg混合溶液，即得。

2.1.2 對(duì)照品溶液 混合對(duì)照品儲(chǔ)備液：分別取5-羥甲基糠醛、米力農(nóng)雜質(zhì)I與雜質(zhì)II對(duì)照品各適量，用流動(dòng)相制成每1 ml分別含1，0.1，0.1 mg 混合溶液。

混合對(duì)照品溶液：取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用流動(dòng)相制成每1 ml中分別含5-羥甲基糠醛、米力農(nóng)雜質(zhì)I與雜質(zhì)II 10，1和1 μg混合溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液 取注射液，即得（濃度1 mg/ml）。

2.1.4 自身對(duì)照溶液 精密量取供試品溶液適量，用流動(dòng)相制成每1 ml中含米力農(nóng)2 μg溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱Shiseido C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：水-甲醇-硼酸鈉緩沖液（取硼酸31 g，加水800 ml，緩緩加20 %氫氧化鈉溶液適量，充分振搖使硼酸完全溶解，用20 %氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 7.0，加水稀釋至1000 ml，搖勻，即得。臨用新制）（725:250:25）；5-羥甲基糠醛的檢測(cè)波長(zhǎng)為284 nm，米力農(nóng)雜質(zhì)I、雜質(zhì)II、其他雜質(zhì)的檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；柱溫30 ℃；流速1.0 ml/min；進(jìn)樣量20 μl。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取系統(tǒng)適用性溶液、混合對(duì)照品溶液及供試品溶液，分別按2.2項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果表明，在系統(tǒng)適用性溶液、混合對(duì)照品溶液及供試品溶液的284 nm的色譜圖中，5-羥甲基糠醛峰與其相鄰雜質(zhì)峰的分離度符合要求；在254 nm的色譜圖中，雜質(zhì)I峰與米力農(nóng)峰的分離度大于4.0，見圖1～2。

2.4 專屬性試驗(yàn)

精密稱取5份樣品[每份含米力農(nóng)對(duì)照品25 mg，無水葡萄糖1.18 g（按處方比例）]，置入25 ml量瓶，分別加入1 mol/L氫氧化鈉溶液5 ml，振搖使溶解，室溫放置8 h，中和；加入1 mol/L鹽酸溶液5 ml，振搖使溶解，室溫放置8 h，中和；加入30 %過氧化氫溶液5 ml，振搖使溶解，室溫放置0.5 h；加水5 ml，振搖使溶解，置水浴中破壞5 h，取出放冷；加水5 ml，振搖使溶解，4500 lx光照條件下照射72 h，再加入0.236 mg（按5-羥甲基糠醛的限度值計(jì)算的加入量）5-羥甲基糠醛，用流動(dòng)相定容至刻度，搖勻。取上述各溶液作為破壞性供試溶液，按2.2項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，本品在酸、堿、氧化、高溫及光照條件下均有不同程度的破壞，在284 nm色譜圖中各降解產(chǎn)物峰均能與5-羥甲基糠醛峰達(dá)到完全分離，在254 nm色譜圖中各降解產(chǎn)物均能與主峰達(dá)到完全分離。色譜圖見圖3。

圖1 254 nm波長(zhǎng)下的系統(tǒng)適用性色譜圖

圖2 284 nm波長(zhǎng)下的系統(tǒng)適用性色譜圖

圖3 米力農(nóng)專屬性色譜圖

2.5 檢測(cè)限和定量限

取對(duì)照品溶液及對(duì)照溶液，逐級(jí)稀釋，當(dāng)S/N為10時(shí)，5-羥甲基糠醛、米力農(nóng)雜質(zhì)I、雜質(zhì)II、米力農(nóng)的定量限分別為5 ng/ml，0.025 μg/ml，0.05 μg/ml，1 ng/ml；當(dāng)S/N為3時(shí)，5-羥甲基糠醛、米力農(nóng)雜質(zhì)I、雜質(zhì)II、米力農(nóng)的檢測(cè)限分別為2.5 ng/ml，0.01 μg/ml，0.025 μg/ml，0.3 ng/ml。

2.6 精密度試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各色譜峰峰面積。分別計(jì)算5-羥甲基糠醛、米力農(nóng)雜質(zhì)I、雜質(zhì)II峰面積的RSD分別為0.11 %，0.64 %，0.16 %，精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件分別于0，2，4，6，8，10，12 h測(cè)定，記錄各色譜峰峰面積。5-羥甲基糠醛、米力農(nóng)雜質(zhì)I、雜質(zhì)II、其他單個(gè)最大雜質(zhì)峰面積的RSD分別為0.10 %，1.1 %，1.1 %，1.2 %，供試品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品（批號(hào)16051）按2.1.3項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)行測(cè)定，5-羥甲基糠醛、米力農(nóng)雜質(zhì)I、雜質(zhì)II的平均含量分別為0.0010 %，0.013 %和0.063 %，RSD分別為0.07 %，1.07 %和0.94 %。

2.9 線性關(guān)系考察

取混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液和供試品溶液適量，加流動(dòng)相制成每1 ml中分別含米力農(nóng)為0.2，0.5，1，2，3，5 μg，5-羥甲基糠醛1，2，5，10，20，50，100 μg，米力農(nóng)雜質(zhì)I及雜質(zhì)II各為0.1，0.2，0.5，1，2，5，10 μg線性試驗(yàn)溶液。照2.2項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄各色譜峰的峰面積。以濃度和相應(yīng)峰面積進(jìn)行線性回歸，所得結(jié)果見表1。

表1 4種成分的線性關(guān)系

2.10 回收率試驗(yàn)

取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，分別用已知各雜質(zhì)含量的供試品溶液制成相當(dāng)于雜質(zhì)對(duì)照濃度的80 %，100 %，120 %溶液各3份，按2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄各成分色譜峰面積。分別計(jì)算各成分不同濃度的加樣回收率及RSD，結(jié)果見表2～4。

2.11 耐用性試驗(yàn)

采用Waters 2695 2487高效液相色譜儀（紫外檢測(cè)器，四元泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，美國(guó)Waters公司）、色譜柱Venusil MPC18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），按2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行系統(tǒng)適用性試驗(yàn)。結(jié)果表明，在254 nm波長(zhǎng)的色譜圖中，雜質(zhì)I峰與米力農(nóng)峰的分離度大于4.0，在284 nm波長(zhǎng)的色譜圖中5-羥甲基糠醛與其相鄰雜質(zhì)峰的分離度符合要求。色譜圖見圖4～5。

表2 5-羥甲基糠醛試驗(yàn)結(jié)果

表3 米力農(nóng)雜質(zhì)I試驗(yàn)結(jié)果

表4 米力農(nóng)雜質(zhì)II試驗(yàn)結(jié)果

2.12 樣品測(cè)定

按2.1項(xiàng)下方法制備混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和自身對(duì)照溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的3倍。在284 nm色譜圖中5-羥甲基糠醛按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，在254 nm色譜圖中米力農(nóng)雜質(zhì)I和雜質(zhì)II按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，其他雜質(zhì)均以自身對(duì)照法計(jì)算。樣品測(cè)定結(jié)果見表5。

圖4 254 nm系統(tǒng)適用性色譜圖

圖5 284 nm系統(tǒng)適用性色譜圖

表5 樣品測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

參考ChP2015二部收載的含葡萄糖注射液的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[9]，其5-羥甲基糠醛在HPLC檢測(cè)中檢測(cè)波長(zhǎng)均為284 nm，通過紫外光譜掃描，5-羥甲基糠醛在284 nm波長(zhǎng)處有最大吸收。最終確定5-羥甲基糠醛的檢測(cè)波長(zhǎng)為284 nm。米力農(nóng)、米力農(nóng)雜質(zhì)I、雜質(zhì)II及其他雜質(zhì)的檢測(cè)波長(zhǎng)仍選擇254 nm。

3.2 5-羥甲基糠醛限度的確定

參考ChP2015二部收載的含葡萄糖注射液檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)[9]中的5-羥甲基糠醛限度、國(guó)內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)的處方及按新建立的方法測(cè)定的結(jié)果，最終將5-羥甲基糠醛的限度訂為“不得過葡萄糖標(biāo)示量的0.02 %”。

4 結(jié)論

本文所建立的HPLC法專屬性良好，可有效排除用葡萄糖調(diào)節(jié)滲透壓產(chǎn)品中5-羥甲基糠醛對(duì)有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果的影響，同時(shí)又不影響用氯化鈉調(diào)節(jié)滲透壓產(chǎn)品的測(cè)定結(jié)果，為嚴(yán)格控制不同生產(chǎn)廠家生產(chǎn)的米力農(nóng)注射液產(chǎn)品質(zhì)量的控制提供依據(jù)。