劉文童，趙永鋒，郭晉杰，黃亞群，陳景堂，祝麗英

（1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院 / 國家玉米改良中心河北分中心 / 河北省作物種質(zhì)資源實驗室， 河北 保定 071001；2. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山東 青島 266109）

玉米是我國播種面積最大的作物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中有舉足輕重的地位。種子活力是衡量種子質(zhì)量的重要指標(biāo)，對田間發(fā)芽、幼苗建成和品種增產(chǎn)性能的發(fā)揮有重要的影響。高活力種子發(fā)芽早，出苗迅速且整齊一致，對環(huán)境的適應(yīng)性和抵抗力強，有明顯的生長優(yōu)勢［1-2］。選育和應(yīng)用高種子活力玉米品種，是我國玉米生產(chǎn)全程機械化發(fā)展的必然趨勢。開展種子活力的遺傳研究，對選育高種子活力玉米品種具有重要意義。

種子活力是一個抽象且復(fù)雜的綜合概念，1977年國際種子檢驗協(xié)會將種子活力定義為：決定種子或種子批在發(fā)芽和出苗期間的活性水平和行為的那些種子特性的綜合表現(xiàn)［3］。它與種子發(fā)芽、幼苗生長速度和均勻性、廣泛環(huán)境條件下種子出苗能力等多方面的表現(xiàn)有關(guān)，并非一個單一可測量的性狀，涉及形態(tài)學(xué)指標(biāo)、生理生化指標(biāo)、耐逆性指標(biāo)，這些相關(guān)性狀多為多基因調(diào)控的數(shù)量性狀，會受到環(huán)境和遺傳因素的影響［1-2］。隨著分子標(biāo)記、測序技術(shù)等相關(guān)研究理論和技術(shù)的發(fā)展，連鎖分 析［4］和全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS，Genome-wide association studies）［5］被廣泛應(yīng)用，極大地促進了植物領(lǐng)域性狀的遺傳解析研究。對種子活力相關(guān)性狀的遺傳解析，已經(jīng)在水稻［6］、小麥［7］、大 豆［8］、油菜［9］等多種作物中開展。Hu 等［10］檢測到15 個QTL 與玉米低溫發(fā)芽性狀有關(guān)，單個QTL貢獻(xiàn)率在3.39%～11.29%之間。Wang 等［11］對重組自交系（RIL，Recombinant inbred line）群體和永久F2群體種子進行不同天數(shù)老化處理，基于田間試驗對種子活力進行研究，共檢測到49 個QTL。Ku 等［12］使用2 組相關(guān)玉米RIL 群體和加速老化處理方法對種子相關(guān)性狀進行研究，連鎖分析共檢測到74 個QTL，Meta-QTL 分析將其整合至20 個MQTL 之中，其中存在32 個候選基因。Han 等［13］采用類似方法研究得到65 個種子活力相關(guān)QTL，Meta-QTL 分析將其中貢獻(xiàn)率大于10%的初始QTL整合進18 個MQTL 內(nèi)，得到23 個候選基因。Shi等［14］使用2 組相關(guān)玉米RIL 群體和低溫發(fā)芽試驗方法對種子活力開展研究，共檢測到26 個QTL，Meta-QTL 分析將其整合進5 個MQTL 內(nèi)。田潤苗等［15］對玉米種子萌發(fā)相關(guān)性狀進行全基因組關(guān)聯(lián)分析，共得到15 個顯著關(guān)聯(lián)的SNP，推測可能的候選基因GRMZM2G148411，該基因可能參與種子休眠和萌發(fā)的信號調(diào)控。Huang 等［16］對玉米發(fā)芽期和苗期耐冷性進行全基因組關(guān)聯(lián)分析，檢測到43 個顯著關(guān)聯(lián)位點，得到40 個候選基因，并未發(fā)現(xiàn)同時與發(fā)芽期和苗期耐冷性顯著關(guān)聯(lián)的位點。Hu 等［17］對玉米發(fā)芽期耐冷性進行全基因組關(guān)聯(lián)分析，得到17 個顯著關(guān)聯(lián)位點，檢索到18 個候選基因，其中10 個候選基因得到前人QTL 定位研究支持。目前，玉米種子活力的連鎖分析相對較多，全基因組關(guān)聯(lián)分析相對較少，并且各研究得到的QTL 或顯著關(guān)聯(lián)位點在數(shù)量、位置及效應(yīng)上存在差異，候選基因也不盡相同，因此需要更多的研究進一步解析玉米種子活力的遺傳基礎(chǔ)。

本研究使用201 份自交系組成的自然群體，通過標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗和加速老化試驗測定種子活力相關(guān)性狀，采用全基因組關(guān)聯(lián)分析檢測顯著關(guān)聯(lián)位點，并搜索相關(guān)候選基因，為解析玉米種子活力的遺傳基礎(chǔ)和玉米種子活力分子輔助育種提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

201 份玉米自交系組成的自然群體，其中包括我國玉米育種中的骨干自交系及其衍生系、部分國外玉米自交系和部分自選系。2018 年12 月在海南三亞種植自然群體，開花前套袋隔離，人工自交授粉。成熟后統(tǒng)一收獲晾曬，按系混合脫粒，挑選整齊一致的種子保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 發(fā)芽試驗方法

將玉米自交系種子放入托普LH-150 型種子老化箱中進行加速老化處理，設(shè)置溫度為45 ℃，相對濕度為90%，處理時間為72 h。

發(fā)芽試驗于人工氣候室中進行，采用完全隨機區(qū)組試驗設(shè)計，3 次重復(fù)。標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗（SGT，Standard germination test）用正常種子，加速老化試驗（AAT，Accelerated aging test）用加速老化處理的種子。使用種子發(fā)芽盒，BP 紙間置床方法進行發(fā)芽試驗，每個處理50 粒種子。人工氣候室溫度設(shè)置為26±1 ℃，相對濕度為65%±5%，光周期為 14/10 h（晝長/夜長），每天按時加水、通氣。

1.3 相關(guān)性狀的測定

參考張紅生和胡晉［1］的方法，發(fā)芽培養(yǎng)第4 天開始逐天記錄發(fā)芽數(shù)至第7 天。調(diào)查結(jié)束后，每系選5 株長勢均勻的幼苗，測量苗長和根長，稱量苗鮮重和根鮮重。然后放入烘箱中，65 ℃烘干48 h，稱量苗干重和根干重。以5 株幼苗的平均值作 為表型值。

根據(jù)以下公式計算發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)：

發(fā)芽勢 =（第4 天正常發(fā)芽數(shù)）/（供試種子總數(shù)）× 100%

發(fā)芽率 =（第7 天正常發(fā)芽數(shù)）/（供試種子總數(shù)）× 100%

發(fā)芽指數(shù) = ∑（Gt/Dt）

活力指數(shù) = ∑（Gt/Dt）×S

以上公式中，Dt為發(fā)芽天數(shù)，Gt代表對應(yīng)當(dāng)天Dt的正常發(fā)芽數(shù)，S為一定時期的生長量，本研究選用幼苗干重。

使用Microsoft Excel 2010 對數(shù)據(jù)進行整理，對發(fā)芽勢和發(fā)芽率進行反正弦轉(zhuǎn)換用于方差分析，使用IBM SPSS 23 進行描述統(tǒng)計、方差分析。

參考孔繁玲［18］的方法，利用方差分析結(jié)果計算廣義遺傳率，計算公式如下：

1.4 全基因組關(guān)聯(lián)分析

采用CTAB 法［19］提取自交系基因組DNA，GBS（Genotype by sequencing）分型法［20］構(gòu)建文庫，采用雙末端測序技術(shù)、使用第2 代測序儀進行基因測序。測序數(shù)據(jù)與B73 AGPv2 參考基因組比對，后續(xù)數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)控后，得到83 057 個標(biāo)記用于全基因組關(guān)聯(lián)分析。SNP 標(biāo)記按“染色體編號_位置”規(guī)則命名。

將各性狀3 次重復(fù)的平均值作為表型值用于全基因組關(guān)聯(lián)分析。全基因組關(guān)聯(lián)分析使用R 平臺GAPIT 軟件［21］，分析模型選擇SUPER［22］，參數(shù)設(shè)置為“CV=CV, sangwich.top=”MLM”, sangwich. bottom=”SUPER”, LD=0.1”，其中CV變量為PCA 矩陣，由TASSEL 軟件［23］計算得到。顯著關(guān)聯(lián)位點的閾值使用GEC 軟件［24］建議的P值“2.46E-5”，對應(yīng)LOD值為4.61。

1.5 候選基因搜索

用PLINK 軟件［25］計算基因組上200 kb 內(nèi)兩兩SNP 間的r2，參考Hill 和Weir 的方法［26］取r2等于 0.1 時的衰減距離120 kb 為該群體的LD 衰減距離。在B73 AGPv2 參考基因組上搜索顯著位點上下游 120 kb 范圍內(nèi)的基因，基因功能等信息參考UniProt等相關(guān)數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子活力相關(guān)性狀的描述統(tǒng)計分析

分別對自然群體在標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗和加速老化試驗得到的10 個種子活力相關(guān)性狀進行描述統(tǒng)計分析，結(jié)果見表1。發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、苗長、根長、苗鮮重、苗干重、活力指數(shù)的平均值在加速老化試驗條件下略低于標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗。標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗條件下，各性狀的變異系數(shù)范圍為11.20% ～35.01%；加速老化試驗條件下，變異系數(shù)為14.69% ～32.66%，表明不同自交系種子活力相關(guān)性狀存在較大差異，該群體的種子活力相關(guān)性狀有廣泛的遺傳變異，適合于全基因組關(guān)聯(lián)分析研究。苗長、根長、苗鮮重、苗干重、根干重、活力指數(shù)在兩種試驗條件下峰度和偏度的絕對值小于1，表明這些性狀數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，符合數(shù)量性狀的特征。

2.2 種子活力相關(guān)性狀的方差分析

分別對標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗和加速老化試驗測得的種子活力相關(guān)性狀進行方差分析，結(jié)果見表2。各性狀的區(qū)組和基因型效應(yīng)在2 種試驗條件下均達(dá)到極顯著水平，表明兩種試驗條件下各自交系種子活力相關(guān)性狀的表現(xiàn)均同時受到環(huán)境和基因型效應(yīng)的影響。各相關(guān)性狀的廣義遺傳率在2 種試驗條件下均較高，標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗下為83.33%～93.10%，加速老化試驗下為77.88%～91.67%，說明遺傳因素是影響種子活力相關(guān)性狀的主要因素。

表1 種子活力相關(guān)性狀的描述統(tǒng)計Table 1 Descriptive statistics of seed vigor related traits

表2 種子活力相關(guān)性狀的方差分析Table 2 Analysis of variance of seed vigor related traits

2.3 種子活力相關(guān)性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析

分別對自然群體在標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗和加速老化試驗條件下的種子活力相關(guān)性狀進行全基因組關(guān)聯(lián)分析，結(jié)合測序質(zhì)控后的83 057 個SNP 分子標(biāo)記，使用SUPER 模型結(jié)合PCA 矩陣方法，在LOD 值大于或等于4.61 判別條件下，10 個性狀共檢測到32個性狀SNP 關(guān)聯(lián)（見表3），其中標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗條件下16 個，加速老化試驗條件下16 個。這些性狀SNP 關(guān)聯(lián)涉及26 個位點，分布在第1、2、3、4、5、6、7、9 染色體的22 個Bin 區(qū)段上，對應(yīng)染色體的性狀SNP 關(guān)聯(lián)存在的個數(shù)分別為7、10、5、2、3、1、1、3；單個表型貢獻(xiàn)率在0.01%～12.64%之間。

2 個位點與發(fā)芽勢關(guān)聯(lián)，僅在標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗中檢測到，分布在第2、4 染色體上，可分別解釋4.80%和1.66%的表型變異。5 個位點與發(fā)芽率關(guān)聯(lián)，分布在第1、2、3、9 染色體上，可解釋0.11%～8.08%的表型變異。7 個位點與發(fā)芽指數(shù)關(guān)聯(lián)，分布在第1、2、6、9 染色體上，可解釋0.14%～7.89%的表型變異。2 個位點與苗長關(guān)聯(lián)，僅在標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗中檢測到，分布在第3、4 染色體上，可分別解釋4.34%和12.64%的表型變異。5 個位點與根長關(guān)聯(lián)，分布在第1、3、5、7 染色體上，可解釋0.30%～3.59%的表型變異。3 個位點與苗鮮重關(guān)聯(lián)，分布在第1、2 染色體上，可解釋1.09%～8.39%的表型變異，其中位點2_180176428 在2 種試驗條件中同時檢測到。僅1 個位點與根鮮重關(guān)聯(lián)，在加速老化試驗中檢測到，位于第3 染色體上，可解釋0.35%的表型變異。5 個位點與苗干重關(guān)聯(lián)，僅在加速老化試驗中檢測到，分布于第1、2、5、9 染色體上，可解釋0.01%～10.85%的表型變異。僅1 個位點與活力指數(shù)關(guān)聯(lián)，在標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗中檢測到，位于第5 染色體上，可解釋0.75%的表型變異。

有5 個位點在不同性狀中同時檢測到，其中位點1_127505950、1_288806019、2_3108015、 和9_97280218 同時與發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)顯著關(guān)聯(lián)；位點2_180176428 同時與苗鮮重和苗干重顯著關(guān)聯(lián)，可能存在一因多效的現(xiàn)象。

表3 種子活力相關(guān)性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果Table 3 Results of seed vigor related traits in genome-wide association studies

續(xù)表：

2.4 種子活力相關(guān)性狀的候選基因

基 于B73 AGPv2 參 考 基 因 組， 在 顯 著 關(guān) 聯(lián)SNP 位點上下游120 kb 的范圍內(nèi)搜索候選基 因，綜合文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫信息推測可能的候選基因（見表4），種子特異蛋白GRMZM2G163912、組蛋白GRMZM2G164020、WRKY轉(zhuǎn)錄因子GRMZM2G164082、 果糖呋喃糖苷酶GRMZM2G018716、MYB 基因家族GRMZM2G035370、Ⅱ型內(nèi)含子成熟酶家族蛋白GRMZM2G375999 與發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)有關(guān)，酸性內(nèi)切幾丁質(zhì)酶GRMZM2G023650、LG2 轉(zhuǎn)錄因子GRMZM2G060216、蔗糖合酶GRMZM2G045171與苗長有關(guān)，胞質(zhì)醛脫氫酶GRMZM2G071021、醛 脫 氫 酶GRMZM2G097706 與 根 長 有 關(guān)，TIFY 蛋 白GRMZM2G064775、ABA 誘 導(dǎo) 的 蛋 白GRMZM2G063693 與苗干重有關(guān)。

表4 種子活力相關(guān)性狀可能的候選基因Table 4 Possible candidate genes of seed vigor related traits

3 討論

3.1 種子活力相關(guān)性狀的定位結(jié)果比較

前人對于種子活力相關(guān)性狀基因定位的研究多基于雙親群體進行QTL 定位，劉海英［27］在第1、2、3、4、5、8、9、10 染色體和韓贊平［2］在10 條染色體上均檢測到玉米種子活力相關(guān)性狀的QTL，本研究使用自然群體201 份自交系材料對玉米種子活力相關(guān)性狀進行全基因組關(guān)聯(lián)分析，共獲得26 個顯著關(guān)聯(lián)位點，分布在8 條染色體上22 個Bin 區(qū)段中，并未在第8 和10 染色體上檢測到顯著關(guān)聯(lián)位點。

由于玉米種子活力相關(guān)性狀定位研究較少以及標(biāo)記類型和參考基因組間存在差異，本研究定位結(jié)果位點與其他相關(guān)研究定位結(jié)果很難進行清晰比較。本研究僅發(fā)現(xiàn)檢測到的部分關(guān)聯(lián)位點與前人研究位于同一Bin 區(qū)段，如劉海英［27］研究中Bin1.02（qGEF1，umc1568-bnlg1007），Bin1.05（qNGE1，umc1323），Bin1.08（qNGI1，phi039-umc2029），Bin3.05（qSDW3，bnlg1957），Bin9.03（qLGE9，umc1691）；Wang 等［11］研究中Bin1.03（umc1044- phi339017），Bin1.08（phi038-dupssr12），Bin6.04（umc2006-umc1979）。另外，本研究還有部分顯著位點位于相關(guān)研究中MQTL 區(qū)域內(nèi)。如與Ku 等［12］研究相比較，位點2_109576143 位于MQTL2-1（Chr2:33590242-144073650） 內(nèi)， 位點3_176783445 位 于MQTL3-3（Chr3:175554472-184720933） 內(nèi)， 位 點5_36667115 和5_44370621位 于MQTL5-1（Chr5:17380699-59293558） 內(nèi)；與Han 等［13］研究相比較，位點3_176783445 位于MQTL3-4（Chr3:175554472-184720933）內(nèi)，位點6_106468212 位 于MQTL6-1（Chr6:86257528-123864232）內(nèi)。目前，限于玉米種子活力相關(guān)性狀基因定位研究數(shù)量較少，暫未發(fā)現(xiàn)玉米種子活力相關(guān)性狀定位的熱點染色體區(qū)域。

3.2 種子活力相關(guān)性狀的候選基因分析

本試驗搜索到的GRMZM2G163912、GRMZM2G164020、GRMZM2G164082、GRMZM2G018716、GRMZM2G035370、GRMZM2G375999與發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)有關(guān)。GRMZM2G163912編碼種子特異蛋白，Lopez-Malvar 等［28］研究認(rèn)為該基因模型是對香豆酸的候選基因，對香豆酸與細(xì)胞壁加強和強化有關(guān)、與植物防御害蟲和病原體有關(guān)；?ukalovi? 等［29］認(rèn)為在植物細(xì)胞發(fā)育過程中對香豆酸多轉(zhuǎn)化為木質(zhì)素，可能參與防御機制，對香豆酸和阿魏酸產(chǎn)生化感作用對種子萌發(fā)產(chǎn)生影響。GRMZM2G164020編碼組蛋白，Teoh 等［30］發(fā)現(xiàn)其與DNA 合成有關(guān)并在胚成熟期間特異大量表達(dá)。GRMZM2G164082屬于WRKY 基因家族，WRKY 轉(zhuǎn)錄因子作用于植物生長發(fā)育，并對生物和非生物脅迫做出反應(yīng)，WRKY 蛋白被認(rèn)為與發(fā)育進程調(diào)控有關(guān)，參與種子發(fā)育、胚胎發(fā)生、葉片衰老、休眠、植物生長和代謝途徑等發(fā)育過程［31］。GRMZM2G018716編碼果糖呋喃糖苷酶，Zhou 等［32］認(rèn)為其與棉子糖代謝有關(guān)，而植物細(xì)胞棉子糖的積累與冷、熱、旱等環(huán)境脅迫因素響應(yīng)有關(guān)。GRMZM2G035370屬于MYB 基因家族，MYB基因家族參與次生代謝調(diào)控、細(xì)胞形態(tài)發(fā)生調(diào)控、分生組織形成調(diào)控、花器官和種子發(fā)育調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控等多種生理生化過程，有些還參與各種防御和應(yīng)激反應(yīng)以及光和激素信號通路［33］。GRMZM2G375999與Ⅱ型內(nèi)含子成熟酶家族蛋白有關(guān)，可能參與種子萌發(fā)等相關(guān)生理過程。

GRMZM2G023650、GRMZM2G060216、GRMZM2G045171與苗長有關(guān)。GRMZM2G023650編碼酸性內(nèi)切幾丁質(zhì)酶，Hawkins 等［34］認(rèn)為該基因模型屬于糖苷水解酶家族，其他相關(guān)研究結(jié)果表明植物誘導(dǎo)表達(dá)的植物幾丁質(zhì)酶蛋白的主要功能是單獨或結(jié)合β-1,3-葡聚糖酶聯(lián)合作用防御真菌病原體，組成型表達(dá)的幾丁質(zhì)酶在胚胎發(fā)生、成花、衰老、種子萌發(fā)等一系列生理和形態(tài)學(xué)過程中發(fā)揮作用。GRMZM2G060216與LG2 轉(zhuǎn)錄因子有關(guān)，可能參與葉片發(fā)育正調(diào)控，Zhang 等［35］認(rèn)為其可能為bZIP轉(zhuǎn)錄因子，bZIP 轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控種子成熟和發(fā)芽方面發(fā)揮重要的作用。GRMZM2G045171編碼蔗糖合酶，Schlüter 等［36］認(rèn)為其與纖維素合成轉(zhuǎn)錄因子存在相關(guān)性，可能參與細(xì)胞壁代謝；Trucillo Silva 等［37］認(rèn)為其與氮代謝有關(guān)，參與蔗糖和二磷酸尿苷葡糖UDPG 間的可逆反應(yīng)，動員蔗糖參與如細(xì)胞壁建成、淀粉形成等多種利用活性糖的途徑。

GRMZM2G071021、GRMZM2G097706與根 長有關(guān)。GRMZM2G071021編碼胞質(zhì)醛脫氫酶，GRMZM2G097706編碼醛脫氫酶，可以代謝各種內(nèi)源性和外源性醛［38］。

GRMZM2G064775、GRMZM2G063693與 苗 干重有關(guān)。GRMZM2G064775編碼TIFY 蛋白，Zhou等［39］認(rèn)為其是耐旱性和生長調(diào)控的重要基因，在JA、ABA 和GA 信號途徑處于交叉樞紐位置。GRMZM2G063693編碼ABA 誘導(dǎo)的蛋白，Hu 等［40］認(rèn)為其可能屬于油體蛋白基因，可能與一系列包括應(yīng)激反應(yīng)、植物氧脂生物合成、細(xì)胞質(zhì)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、脂質(zhì)運輸、膜擴張和油體生物發(fā)生等細(xì)胞和生理過程有關(guān)，并發(fā)現(xiàn)該基因在種子和雄蕊中特異表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)的多數(shù)候選基因與抗逆性研究有關(guān)，這些候選基因?qū)τ衩追N子活力相關(guān)性狀研究提供了參考，對種子活力的遺傳基礎(chǔ)解析仍需大量相關(guān)后續(xù)研究來驗證。

4 結(jié)論

種子活力相關(guān)性狀的表現(xiàn)受到環(huán)境和基因型效應(yīng)的共同影響，但基因型效應(yīng)的影響較大。標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗和加速老化試驗條件下，全基因組關(guān)聯(lián)分析共檢測到32 個性狀SNP 關(guān)聯(lián)，涉及26 個SNP 位點，推測可能的候選基因13 個，研究結(jié)果可為解析玉米種子活力遺傳基礎(chǔ)和分子輔助選擇育種提供參考。