李 揚(yáng)，馬麗梅，陳 悅，翁慧婷，李志坤

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，河北 保定 071001）

陸地棉是世界上耕種面積最大的棉花栽培種，生產(chǎn)過(guò)程中常因黃萎病發(fā)生而導(dǎo)致產(chǎn)量降低和纖維品質(zhì)下降［1-2］。棉花黃萎病是由大麗輪枝菌侵染根部引起的一種土傳真菌性維管束病害，也被稱(chēng)為棉花的“癌癥”。目前，生產(chǎn)上還沒(méi)有有效的防治藥物和耕作方法可以防治黃萎?。?-5］。實(shí)踐表明，通過(guò)選育和種植棉花抗病品種可以有效防治黃萎?。?］?？寺↑S萎病抗性基因并解析其抗性機(jī)制是培育抗病品種的基礎(chǔ)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)1 個(gè)谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶基因簇在棉花黃萎病抗病反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用［7］。但該基因簇中單個(gè)基因的抗病功能和分子機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）是一組具有多種生理功能和各種生物體常見(jiàn)的胞質(zhì)二聚體蛋白分子。它促進(jìn)體內(nèi)某些異型物質(zhì)和內(nèi)源性有害物質(zhì)的親電子基團(tuán)與谷胱甘肽的巰基結(jié)合，后者可以分解或形成水溶性物質(zhì)并從體內(nèi)釋放出來(lái)，近而達(dá)到解毒細(xì)胞的目的［8-9］。在植物中最早研究發(fā)現(xiàn)玉米GSTs在解毒除草劑過(guò)程中發(fā)揮了重要作用［10-11］。

谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶編碼基因?qū)儆诙嗷蚣易澹涔δ芫哂卸鄻有?。GST 可以在各種生物或非生物脅迫下誘導(dǎo)表達(dá)，增強(qiáng)植物對(duì)逆境的抵抗力，并且是抗氧化防御系統(tǒng)中的重要酶系統(tǒng)［12］。研究表明玉米中的GST-B和GST-Y基因在干旱脅迫條件下，酶活性顯著增高，證明GST 在激活植物抗逆反應(yīng)中起重要作用［13］。玉米中GST 蛋白能夠催化谷胱甘肽與氯均三嗪阿特拉津結(jié)合，保護(hù)植物免受除草劑的傷害［11］。另有研究表明蘿卜中RsGST1-1基因可能通過(guò)參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑或與其他基因共同參與蘿卜對(duì)不利重金屬脅迫的防御，表明GST 在植物體中具有解毒作用［14］。而超表達(dá)擬南芥中的GST 基因能夠減弱逆境對(duì)植物體內(nèi)代謝活性的影響，使植物免受氧化損傷［15］。大豆根中發(fā)現(xiàn)，GSTs 能夠促進(jìn)大豆的生物固氮作用［16］。在水稻根中，2 個(gè)GST基因Osgstu3和Osgstu4受重金屬和低氧誘導(dǎo)，同時(shí)也可響應(yīng)鹽脅迫［17］。水稻Lambda 類(lèi)GST 家族成員在植物生長(zhǎng)和發(fā)育以及對(duì)抗不同的生物和非生物脅迫方面起著重要作用［18］。研究發(fā)現(xiàn)，亞洲綿中Phi 類(lèi)GST 基因GaGSTF9能夠增強(qiáng)亞洲棉對(duì)黃萎病的抗性［19］。

項(xiàng)目組前期研究表明，植物中GST 基因被劃分為9 類(lèi)，其中tau 類(lèi)GST 基因數(shù)目最多。并發(fā)現(xiàn)位于陸地棉A 亞組09 染色體上的一個(gè)tau 類(lèi)基因簇（Gh_A09G1508，Gh_A09G1509和Gh_A09G1510）在進(jìn)化過(guò)程中經(jīng)歷了正選擇效應(yīng)，并在棉花黃萎病抗性反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用［7，20］。但對(duì)該基因簇中單獨(dú)基因的黃萎病抗性功能及機(jī)制還需進(jìn)一步研究。本研究擬對(duì)抗病陸地棉品種ND601 中的Gh_A09G1510同源基因GhGST3（MK179292）進(jìn)行克隆、黃萎病抗性及分子機(jī)制研究。

1 材料與方法

1.1 植物材料的培養(yǎng)

擬南芥和煙草種植于人工氣候室（溫度20 ～ 22 ℃，濕度70%～80%，光照強(qiáng)度5 000 Lux，光周期為16 h 光/8 h 黑暗）進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2 序列分析

在CottonFGD（https://cottonfgd.org/）網(wǎng) 站 下載G. hirsutum中Gh_A09G1510基因序列，CDS 序列及蛋白序列。利用DNAMAN 在CD-Search（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi） 網(wǎng)站對(duì)Gh_A09G1510 蛋白序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)。在GSDS（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）網(wǎng)站進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析。利用Cotton FGD 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)酵母菌陽(yáng)性克隆片段進(jìn)行序列比對(duì)分析。

1.3 基因克隆與原核表達(dá)分析

基于Gh_A09G1510基因序列設(shè)計(jì)ORF 克隆引物，在抗病陸地棉品種‘農(nóng)大601’中克隆其同源基因GhGST3。將具有限制性位點(diǎn)的GhGST3基因片段連接至pEASY-T1 載體，并將測(cè)序的GhGST3與pET32a 載體定向連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10，進(jìn)行菌落PCR 和雙重酶切。確認(rèn)后，選擇陽(yáng)性克隆并提取質(zhì)粒以表達(dá)蛋白。轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）。

在10 mL LB 液體培養(yǎng)基（含100 mg L 卡那霉素）中培養(yǎng)，在28 ℃下孵育直至OD 值為0.6 ～0.8，并通過(guò)IPTG 階梯表達(dá)進(jìn)一步富集誘導(dǎo)1、2、3 和4 h 后，取1 mL 細(xì)菌溶液。以相同的方式，在28 ℃下誘導(dǎo)空質(zhì)粒pET32a 作為對(duì)照。離心1 mL 細(xì)菌溶液以收集細(xì)胞，棄去上清液，重懸細(xì)胞，離心上清液以進(jìn)行蛋白檢測(cè)，并繼續(xù)用包涵體裂解液懸浮沉淀。測(cè)試包涵體蛋白。將上清蛋白和包涵體蛋白在100 ℃的水浴中煮沸10 min，12%SDS-PAGE 凝膠電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，觀察結(jié)果。

1.4 超表達(dá)載體的構(gòu)建及純系篩選

將GhGST3ORF 連 接 至 pMD19-T 載 體， 將pMD19-T-GhGST3載體和35s:XX 載體分別進(jìn)行雙酶切后，進(jìn)行連接。將構(gòu)建好的質(zhì)粒35s:GhGST3轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101 中。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥。利用0.1%的Basta 進(jìn)行純系的篩選，利用載體特異性引物對(duì)T1代擬南芥進(jìn)行PCR 檢測(cè)，設(shè)計(jì)基因?qū)崟r(shí)定量引物對(duì)純系進(jìn)行表達(dá)量檢測(cè)。

1.5 大麗輪枝菌侵染與病指統(tǒng)計(jì)

大麗輪枝菌菌株臨西2-1 培養(yǎng)于PDA 瓊脂培養(yǎng)基（200 g/L 土豆，12.5 g/L 葡萄糖，15 g/L 瓊脂）。將菌塊接種于PDA 液體培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)10 d。紗布過(guò)濾后，將菌液稀釋至（0.94×107～1×107）［21］， 用于接種。轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥每棵植株接種10 mL 孢子懸浮液。接種等量的水作為對(duì)照。將21 d 苗齡的轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥分別接種黃萎病菌，接菌25 d 時(shí)，統(tǒng)計(jì)病級(jí)及病指。

黃萎病病級(jí)統(tǒng)計(jì)及分析：總共分成5 個(gè)等級(jí)，0級(jí)：植株無(wú)發(fā)病癥狀，生長(zhǎng)良好；1 級(jí)：25%的葉子發(fā)黃，呈現(xiàn)病態(tài)；2 級(jí)：25% ～50% 的葉片發(fā)黃，葉緣卷曲；3 級(jí)：超過(guò)75%的葉片枯萎發(fā)病，有少許葉片脫落；4 級(jí)：全株發(fā)病，葉片干枯脫落或整株死亡。病情指數(shù)的統(tǒng)計(jì)方法如下：病情指（Disease index）=［∑（發(fā)病級(jí)數(shù)×該級(jí)株數(shù)）］÷（調(diào)查總株數(shù)×4）×100

1.6 RNA 制備、cDNA 合成和實(shí)時(shí)定量PCR 分析

使用EASY Spin Plant（北京阿德萊德生物技術(shù)有限公司）的RNA 快速提取試劑盒進(jìn)行RNA 提取，并使用PrimeScript? 第一鏈cDNA 合成試劑盒［Baori Doctor Biotechnology（北京）有限公司］ 進(jìn)行cDNA 合成，利用7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI，美國(guó)），使用熒光定量試劑盒（US EVERBRIGHT INC 公司）進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測(cè)。AtTUB2為內(nèi)參。

1.7 亞細(xì)胞定位載體的構(gòu)建及觀察

以含有GhGST3基因的質(zhì)粒為模板，進(jìn)行GhGST3基因的擴(kuò)增，將PCR 產(chǎn)物和35s:XX-GFP載體分別進(jìn)行雙酶切后、進(jìn)行連接。將構(gòu)建好的質(zhì)粒35s:GhGST3-GFP 和空載體質(zhì)粒35s:XX-GFP 分別轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101 中。利用煙草進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)。具體步驟為：將農(nóng)桿菌進(jìn)行擴(kuò)繁，OD600達(dá)到0.8 左右。將菌液離心，5 000 r/min、10 min、 棄除上清，用蒸餾水重懸2 ～3 次。用緩沖液（10 mmoL/L MES、100 mmoL/L AS、10 mmoL/L MgCl2）重懸細(xì)胞沉淀（菌液∶緩沖液=1∶1），室溫靜置2 ～3 h 后，用1 mL 注射器，注射到煙草背面，并進(jìn)行標(biāo)記。遮光培養(yǎng)48 h 后，使用激光共聚焦顯微鏡FV10i（Olympus，Japan）觀察GFP 表達(dá)情況。

1.8 酵母雙雜交

PCR 擴(kuò)增GhGST3ORF，并將其克隆到pGBKT7 中，將得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌株Y2HGold。檢測(cè)其自激活活性和毒性。按照Matchmaker?Gold Yeast Two-Hybrid System 操 作 手 冊(cè) 將 含 有 重 組 質(zhì)粒的酵母菌株與本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的海島棉黃萎病菌誘導(dǎo)的cDNA 文庫(kù)進(jìn)行雜交。將雜交菌液依次涂布于DDO（SD / -Trp / -Leu）,TDO（SD / -Trp /-Leu/ -His），QDO/X/A（SD / -Trp /-Leu/ -His / -Ade/X-a-Gal/AbA ）進(jìn)行篩選。利用特異性引物對(duì)陽(yáng)性酵母菌進(jìn)行PCR 檢測(cè)。

1.9 KEGG 和GO 分析

對(duì)候選基因在http://kobas.cbi.pku.edu.cn/進(jìn)行KEGG 和GO 分析［22］。

2 結(jié)果與分析

2.1 GhGST3 基因的克隆與生物信息學(xué)分析

本研究從抗病陸地棉品種ND601 中獲得GhGST3ORF 全長(zhǎng)序列，NCBI 注冊(cè)號(hào)為MK179292。結(jié)果顯示GhGST3基因全長(zhǎng)651 bp，編碼216 個(gè)氨基酸?；蚪Y(jié)構(gòu)分析顯示GhGST3含有2 個(gè)外顯子和1 個(gè)內(nèi)含子（圖1a）。結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)顯示GhGST3 蛋白含有2 個(gè)保守結(jié)構(gòu)域GST_N_Tau 和GST_C_Tau （圖1b）。

圖1 GhGST3 基因序列分析Fig. 1 GhGST3 gene sequence analysis

2.2 超表達(dá)GhGST3 擬南芥黃萎病菌抗性鑒定

本研究獲得了轉(zhuǎn)GhGST3基因的擬南芥陽(yáng)性植株（圖2a），對(duì)T1代陽(yáng)性植株進(jìn)行PCR 檢測(cè)，結(jié)果顯示GhGST3基因成功轉(zhuǎn)化到擬南芥基因組中（圖2b）。繼續(xù)篩選至T3代純系后，對(duì)其進(jìn)行GhGST3基因?qū)崟r(shí)定量檢測(cè)，野生型擬南芥中無(wú)表達(dá)，超表達(dá)擬南芥中GhGST3基因相對(duì)表達(dá)量達(dá)1.37（圖2c），表明該基因在擬南芥中穩(wěn)定表達(dá)。黃萎病抗性分析顯示轉(zhuǎn)基因植株較野生型植株黃萎病抗性明顯（圖2d）。病指統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植株病指是32.8，野生型植株病指是82.8（圖2e）。綜合結(jié)果表明：超表達(dá)GhGST3基因后，可以增強(qiáng)植株的黃萎病抗性。

圖2 超表達(dá)GhGST3 增強(qiáng)擬南芥對(duì)黃萎病的抗性Fig. 2 Enhanced Verticillium wilt resistance in Arabidopsis by Over-expression of GhGST3

2.3 GhGST3 基因的原核表達(dá)

為了進(jìn)一步明確GhGST3基因的表達(dá)特性，GhGST3 原核表達(dá)分析顯示獲得了一條97.3 kD 的片段，預(yù)測(cè)顯示GhGST3 蛋白大小為24.6 kD，pET32a 載體為（包括6 個(gè)組氨酸，硫氧還蛋白，以 及Trx.Tag、His.Tag、S.Tag、trx-tag 和2 個(gè)his 標(biāo)簽）72.7 kD。結(jié)果顯示GhGST3 能被誘導(dǎo)表達(dá)（圖3）。

圖3 GhGST3 原核表達(dá)電泳圖Fig. 3 The electrophoresis of the GhGST3 prokaryotic expression

2.4 GhGST3 的亞細(xì)胞定位

煙草中亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，當(dāng)GFP 表達(dá)時(shí)，熒光信號(hào)存在于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中。對(duì)于表達(dá)GhGST3 和GFP 融合的細(xì)胞，熒光信號(hào)存在于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中（圖4）。表明GhGST3分布于植物細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中。

圖4 GhGST3 在煙草上皮細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位Fig. 4 Subcellular localization of GhGST3 in tobacco epidermal cells

2.5 酵母雙雜交篩選與GhGST3 互作的靶標(biāo)蛋白

為了進(jìn)一步明確GhGST3 的黃萎病抗性機(jī)制，對(duì)pGBKT7-GhGST3重組質(zhì)粒進(jìn)行自激活檢測(cè)和毒性檢測(cè)，含有誘餌載體的酵母菌在SD/-Trp 和SD/-Trp/X-a-Gal 固體培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)、不變藍(lán)。在 SD/-Trp/X-a-Gal/AbA 固體培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)（圖5a）， 證明重組質(zhì)粒不存在自激活活性。將含有pGBKT7空載體的酵母菌和含有誘餌載體的酵母菌稀釋1/10和1/100 后，分別吸取100 μL 均勻的涂布于SD/-Trp 固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。結(jié)果顯示單克隆數(shù)量和大小趨于一致（圖5b），證明重組質(zhì)粒不存在毒性。

將攜帶誘餌載體的酵母菌與本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建好的黃萎病菌誘導(dǎo)的海島棉cDNA 文庫(kù)進(jìn)行雜交。雜交24 h 后，在顯微鏡下可以觀察到結(jié)合子呈現(xiàn)三葉形狀（圖5c），將雜交后的菌液依次涂布于DDO、TDO 和QDO/X/A 培養(yǎng)基進(jìn)行陽(yáng)性克隆的篩選。將篩選到的陽(yáng)性克隆利用特異性引物進(jìn)行PCR檢測(cè)（圖5d），對(duì)單一條帶的電泳產(chǎn)物進(jìn)行回收、測(cè)序，利用Cotton-FGD 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列的比對(duì)，最終篩選得到11 個(gè)基因（表1）。其中4 個(gè)為轉(zhuǎn)錄因子編碼基因，分別編碼CIPK3、ABCI19、GATA9和MYB330。

圖5 酵母雙雜交篩選GhGST3 的互作蛋白Fig. 5 The interacting proteins screening of GhGST3 using yeast two-hybrid method

表1 陸地棉中11 個(gè)與GhGST3 互作的蛋白Table1 Eleven candidate proteins interacting with GhGST3 in G. hirsutum

2.6 互作蛋白的KEGG 和GO 分析

利用擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行11 個(gè)互作蛋白的KEGG和GO 分析，結(jié)果顯示GhGST3 可能通過(guò)植物的檸檬酸鹽代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝、核糖體代謝、碳代謝以及氧化磷酸化等代謝路徑參與棉花抗黃萎病反應(yīng)（表2）。

表2 GhGST3 互作蛋白KEGG 分析Table 2 The KEGG analysis of GhGST3 interaction proteins

GO 結(jié)果表明互作蛋白在植物體內(nèi)大多參與代謝過(guò)程，其中參與羧酸代謝、草酸代謝的蛋白最多（表3）。

表3 GhGST3 互作蛋白GO 分析Table3 The GO analysis of GhGST3 interaction proteins

續(xù)表:

3 討論

在植物中，谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶主要通過(guò)同源二聚體或異源二聚體或單體發(fā)揮功能［23］。在結(jié)構(gòu)上，GST 亞基包括N 端硫氧還蛋白折疊結(jié)構(gòu)域和C 端α螺旋結(jié)構(gòu)域，并且在這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間有1 個(gè)活性位點(diǎn)。N 端結(jié)構(gòu)域與谷胱甘肽結(jié)合，C 端結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞質(zhì)疏水性物質(zhì)、親電試劑、有毒烷基化劑和某些內(nèi)源性物質(zhì)等結(jié)合，進(jìn)而將結(jié)合的產(chǎn)物從體內(nèi)排出，達(dá)到解毒細(xì)胞的目的［24-27］。GST 根據(jù)基因結(jié)構(gòu)、氨基酸序列、免疫交叉反應(yīng)性和底物的專(zhuān)一性等進(jìn)行分類(lèi)［28］。在棉花中，GST 分為9 類(lèi)，包括Tau，DHAR，Ef1bγ，Lambda，MAPEG，Phi， TCHQD，Theta 和Zeta。 其 中Tau 和Phi 是 植 物特有的種類(lèi)［29-30］。本研究從抗病陸地棉品種‘農(nóng)大601’中克隆得到位于A 亞組09 染色體上tau cluster 中GhGST3基因。該基因全長(zhǎng)651 bp，編碼216 個(gè)氨基酸，分子量為24.6 kD。含有2 個(gè)外顯子和1 個(gè)內(nèi)含子。有兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域GST_N_Tau 和GST_C_Tau。

已有功能研究發(fā)現(xiàn)沉默Phi 類(lèi)GST 基因，沉默植株莖段中分離出較多的黃萎病菌，維管束細(xì)胞更長(zhǎng)、更大，使大麗輪枝菌的菌絲更容易滲透浸入，臺(tái)盼藍(lán)染色后發(fā)現(xiàn)沉默植株葉片中染色面積更大、顏色更深，降低棉花植株對(duì)黃萎病的抗性［31］。尖孢鐮刀菌（Vasinfectum）感染棉根和下胚軸，并誘導(dǎo)同源GST 基因的表達(dá)［32］。推測(cè)棉花中GST 基因存在廣譜抗性。但這些研究對(duì)GST 基因可能參與的黃萎病抗性分子機(jī)制并未報(bào)道。此外，項(xiàng)目組前期研究發(fā)現(xiàn)陸地棉A 亞組09 號(hào)染色體上的一個(gè)tau 類(lèi)cluster（Gh_A09G1508，Gh_A09G1509和Gh_A09G1510）在黃萎病抗性反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用［7,20］。但其中單基因在黃萎病抗性反應(yīng)中的功能及抗病分子機(jī)制需要進(jìn)一步研究。因此本研究在陸地棉抗病品種‘農(nóng)大601’中克隆了Gh_A09G1510的同源基因GhGST3，構(gòu)建了超表達(dá)35s:GhGST3載體，并對(duì)轉(zhuǎn)GhGST3基因擬南芥純系進(jìn)行黃萎病抗性鑒定，結(jié)果顯示相比較野生型擬南芥，超表達(dá)株系顯著提高了黃萎病抗性，表明該基因在黃萎病抗性反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。

亞細(xì)胞定位研究對(duì)于解析植物體內(nèi)抗病基因產(chǎn)物發(fā)揮作用的位置、功能和機(jī)制研究有重要意義，研究表明牧豆樹(shù)（Prosopis juliflora）PjGSTU1 定位在葉綠體［33］。擬南芥中GST 定位結(jié)果顯示：所有GSTFs 和GST-U2，U7，U9，U11，U19 和U28的GFP-GST 融合蛋白都定位在細(xì)胞質(zhì)中。GFPGSTT3L，GFP-GSTU12 完全定位于細(xì)胞核。GFPTCHQD 定 位 于 質(zhì) 膜。GFP-GSTT1，GFP-GSTT2和GFP-GSTT3 定位于過(guò)氧化物酶體。這些蛋白質(zhì)可以在不同的細(xì)胞器發(fā)揮功能［34］。本研究通過(guò)亞細(xì)胞定位證實(shí)GhGST3 在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中均有分布。

為了進(jìn)一步明確GhGST3可能的抗病分子機(jī)制，本研究通過(guò)酵母雙雜交篩選到11 個(gè)與GhGST3 互作的靶蛋白，包括4 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，分別是CIPK3、ABCI19、GATA9 和MYB330。其中鈣調(diào)節(jié)神經(jīng)磷酸酶B 樣蛋白（CBLs）代表植物鈣結(jié)合蛋白家族，通過(guò)與CBL 互作蛋白激酶（CIPKs）互作，在植物鈣信號(hào)傳導(dǎo)中起重要作用［35］。CBL 蛋白能夠通過(guò)調(diào)控植物的ABA 通路來(lái)提高植物抗病性，同時(shí)有證據(jù)表明CBL3 能夠調(diào)控?cái)M南芥的應(yīng)激反應(yīng)［36］。在抗逆過(guò)程中，植物還通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)某些功能基因的表達(dá)，這是植物應(yīng)對(duì)逆境的主要機(jī)制之一。作為植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，MYB 轉(zhuǎn)錄因子在植物抗逆性過(guò)程中起著重要作用［37］。在擬南芥中，當(dāng)擬南芥感染病原體時(shí)，AtMyb30 是HR 反應(yīng)的正向調(diào)節(jié)劑，對(duì)細(xì)菌病原體感染引起的過(guò)敏性死亡的反應(yīng)取決于SA 的積累，但不取決于NPR1。并且如果改變擬南芥AtMYB30的表達(dá)（過(guò)表達(dá)，T-DNA插入突變），SA 的水平和SA 相關(guān)基因的表達(dá)也會(huì)改變。這表明擬南芥AtMYB30參與了SA 合成的調(diào)節(jié)并調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡［38］。此外，煙草的Myb1基因編碼水楊酸的下游信號(hào)復(fù)合物，并與病原相關(guān)蛋白（PR）基因的啟動(dòng)子序列結(jié)合，參與PR 基因的激活和植物防御反應(yīng)［39］。因此，GhGST3可能通過(guò)ABA 路徑和/或SA 路徑等參與棉花黃萎病抗性反應(yīng)。

4 結(jié)論

棉花谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶家族GhGST3 蛋白在植物細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中表達(dá)。在擬南芥中超表達(dá)GhGST3基因，使其對(duì)黃萎病的抗性增強(qiáng)。酵母雙雜交得到11 個(gè)可能與GhGST3 互作的蛋白，其中有4 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白。證明GhGST3參與抗黃萎病反應(yīng)，是潛在重要的抗病基因。