江民川，趙 陽，馬芳芳，張 微，劉春葉

(西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安 710021)

尿酸(2,4,6-三羥基嘌呤,uric acid，簡稱UA)是人體內(nèi)嘌呤代謝的最終產(chǎn)物。健康成年人血清中正常尿酸的水平為0.15～0.4 mmol/L。人體內(nèi)的尿酸異?？梢苑从吵鲟堰蚀x相關(guān)疾病，是多種疾病可能的遞質(zhì)。據(jù)《2017年中國痛風(fēng)報告白皮書》統(tǒng)計，中國高尿酸血癥患者人數(shù)已達1.7億。其中痛風(fēng)患者超過8 000萬人，并以每年9.7% 的增長率持續(xù)快速增加。現(xiàn)代臨床研究表明，高尿酸血癥還與Lesch-Nyhan綜合癥、心腦血管疾病、內(nèi)分泌疾病、慢性腎臟、急性心肌梗死、腦梗死等疾病密切相關(guān)[1-3]，是這些疾病發(fā)生和發(fā)展的重要因素。因此有必要尋找一種快捷、方便、廉價、準(zhǔn)確的檢測方法對尿酸含量進行實時監(jiān)測。作者將對現(xiàn)有尿酸檢測方法進行綜述，為該方法的發(fā)展提供參考。

1 常見尿酸檢測方法

1.1 磷鎢酸還原法

磷鎢酸還原法自1984年發(fā)明以來，不斷被改進完善，現(xiàn)已成為比較成熟的尿酸含量檢測方法[4-6]。其檢測機理為在堿性條件下，磷鎢酸可將尿酸氧化成尿囊素和二氧化碳，同時自身被還原成鎢藍。經(jīng)過濾光板或紅色濾片濾除雜光,與同樣處理的尿酸標(biāo)準(zhǔn)液進行比色,根據(jù)顯現(xiàn)的顏色深淺程度不同，轉(zhuǎn)化成濃度曲線。該方法的不足是線性關(guān)系不強、尿酸和蛋白質(zhì)會產(chǎn)生沉淀、測試結(jié)果很容易受到其他還原物質(zhì)如維生素C的影響[5，7-8]。

1.2 高效液相色譜法

高效液相色譜(HPLC)是尿酸檢測的常見方法[9]，具有精密度高，分析速度快，樣品用量少等優(yōu)點[10]。其檢測尿酸原理為在高壓輸液系統(tǒng)作用下，選擇相同極性的單一溶劑、不同比例的混合溶劑以及緩沖溶液等作為流動相，樣品在色譜柱中分離得出色譜圖，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法與尿酸標(biāo)準(zhǔn)圖譜比較得出尿酸濃度。該方法缺點為樣品需進行前處理、尋找合適的色譜條件、依賴高精密的儀器等[10-11]，一定程度上限制了推廣和應(yīng)用。

1.3 分光光度法

分光光度法是基于尿酸在293 nm處有特定吸收峰或尿酸與某些試劑作用生成具有特定吸收峰的物質(zhì)，因此分光光度法可分為直接吸光度法和間接吸光度法。前者根據(jù)樣品的吸光度與標(biāo)準(zhǔn)尿酸溶液吸光度工作曲線作對比得出樣品尿酸濃度，例如用鐵氰化鉀紫外法檢測尿酸[12]；后者是根據(jù)尿酸轉(zhuǎn)化生成特定物質(zhì)的吸光度曲線，間接判定尿酸濃度，例如鐵-鄰二氮菲測量法[13]。分光光度法操作簡便、迅速，但靈敏度稍差，血漿等樣品中干擾物多且不易屏蔽，難以簡單地將血漿中的尿酸含量與吸光度測量值進行比對，校正因子難以統(tǒng)一，線性擬合關(guān)系不夠[14-15]。

1.4 尿酸傳感器檢測法

尿酸傳感器主要分為電化學(xué)傳感器和生物傳感器。前者通過檢測尿酸在尿酸酶的作用下產(chǎn)生的電信號強度，從而得出尿酸濃度；后者主要通過生物活性物質(zhì)如酶，對尿酸的識別感應(yīng)進行檢測。電化學(xué)傳感器具有靈敏度高、選擇性好、實用性強等特點并逐漸成為尿酸檢測的熱門領(lǐng)域。電極材料不斷豐富以及電極材料修飾方式的多樣化[16-18]，為尿酸檢測提供了一種可行的方法。目前已經(jīng)有走出實驗室的產(chǎn)品如電化學(xué)尿酸儀，根據(jù)用戶反饋和專業(yè)機構(gòu)評估結(jié)果，尿酸儀測量結(jié)果有一定的價值，但重復(fù)性不好，單次測量易產(chǎn)生較大誤差[19-20]。

1.5 酶法

酶法是指在酶的參與下結(jié)合其他檢測手段共同完成對尿酸檢測的方法，如上述電化學(xué)傳感器中的一些方法也需借助酶的參與。酶法原理為測定酶促反應(yīng)后底物或者產(chǎn)物的濃度變化得出尿酸含量。根據(jù)直接定量的物質(zhì)，酶法可以分為間接尿酸酶法和直接尿酸酶法，當(dāng)考慮數(shù)據(jù)處理方法的不同，可分為平衡尿酸酶法和動力學(xué)尿酸酶法[21]。酶法的不足點在于測定尿酸時常伴有強競爭性酶抑制劑如黃嘌呤，酶的可獲得性低、成本較高[22]。另外各種酶法檢測需要特定條件，得出的結(jié)果不具有統(tǒng)一的評判標(biāo)準(zhǔn)，不具有可比性。

2 微流控紙芯片法

2.1 紙芯片法發(fā)展歷史

使用紙張作為檢測材料有著悠久的歷史。17世紀(jì)，英國化學(xué)家羅伯特·波義耳從一個意外的實驗發(fā)明了紫色石蕊試紙。近代以早孕試紙[23]為代表的免疫層析分析試紙[24]，即側(cè)向?qū)游鰴z測成為紙芯片檢測技術(shù)發(fā)展的一個轉(zhuǎn)折點。2007年，Whitesides研究組[25]提出在紙張表面加工出具有一定結(jié)構(gòu)的微流體通道，可用于葡萄糖等物質(zhì)的檢測，被認(rèn)為是現(xiàn)代微流控紙芯片研究的開端。Henry研究組[26]緊跟其后，提出將紙芯片與電化學(xué)檢測結(jié)合使用，彌補了傳統(tǒng)比色法靈敏度低的缺陷。

2.2 紙芯片加工技術(shù)的進展

隨著檢測物質(zhì)種類的增加和對檢測結(jié)果精確度要求的不斷提高，紙芯片加工技術(shù)也變得越來越多樣化。按照紙張?zhí)幚矸椒ǖ牟煌埿酒庸ぜ夹g(shù)可分為2種。物理修飾，即使用疏水試劑(如光膠、石蠟等)，對紙纖維的空隙進行填堵，從而形成疏水堤壩，如紫外光刻技術(shù)[25-32]、繪圖技術(shù)[33-36]、蠟印技術(shù)[37-40]、噴墨打印技術(shù)[41-44]等；化學(xué)改性，利用化學(xué)反應(yīng)將疏水試劑鍵合在紙張纖維表面，例如烷基烯酮二聚體(AKD)[45-46]、十八烷基三氯硅烷(OTS)[47]等。再通過紫外光刻處理技術(shù)，將其降解在紙纖維表面，從而形成親水通道網(wǎng)絡(luò)。此外，也可采用空氣隔離技術(shù)，即依照需要的通道圖案，直接對濾紙進行裁切或者雕刻，進而形成“空氣-濾紙”界面的隔離帶，將流體控制在“通道”之中。

2.3 微流控紙芯片法檢測尿酸

利用微流控紙芯片對尿酸進行檢測已有文獻報道。王方方等[48]通過光刻法，組裝出了一種三維紙芯片用于尿酸檢測，其檢測機理為將尿酸氧化酶和辣根過氧化酶固定在紙芯片上，尿酸被尿酸氧化酶催化生成H2O2，H2O2在辣根過氧化酶的催化作用下，發(fā)生魯米諾反應(yīng)而生成化學(xué)發(fā)光信號?；瘜W(xué)發(fā)光信號的強度與被分析物的濃度呈線性關(guān)系，通過對化學(xué)發(fā)光信號強度的檢測，可以完成尿酸的測量。該方法與電化學(xué)檢測方法相比較，檢測限降低了一個數(shù)量級，探索了紙芯片多元檢測的可能性。趙甜甜等[49]在筆中注入親脂性溶液，在濾紙上繪制圓形疏水圖案，將紙芯片作為實驗平臺，利用納米金團聚顯色的特性，完成了血清中尿酸含量的快速檢測。Huang等[50]基于葡萄糖和尿酸產(chǎn)生H2O2介導(dǎo)的催化氧化顯色反應(yīng)，利用雙酶-無機雜化納米氧化物作為納米生物催化劑，建立了多重紙基納米生物催化體系，可以同時檢測葡萄糖和尿酸，檢測限分別為60和25 μmol/L，已成功地用于檢測人類全血樣本中的葡萄糖和尿酸水平。Wang等[51]以智能手機作為信號讀出器，研制出一種具有良好色度均勻性和強度的多層改性紙基比色傳感平臺，用于尿酸和葡萄糖的靈敏和選擇性測定，該方法在0.01～1.0 mmol/L對尿酸具有良好的線性響應(yīng)，在0.02～4.0 mmol/L對葡萄糖具有良好的線性響應(yīng)，檢出限分別為0.003和0.014 mmol/L，遠低于之前的文獻報道。

微流控紙芯片檢測有著便捷、快速、綠色、廉價等特點，同時，微流控紙芯片生物檢測系統(tǒng)和電化學(xué)檢測系統(tǒng)分別在尿酸濃度與紙基顏色強度、電信號強度間建立了較強的線性關(guān)系，為其測量結(jié)果的準(zhǔn)確性提供了保障。

3 結(jié)束語

除上述常見尿酸檢測方法外，還有一些權(quán)威檢測方法，如德國臨床化學(xué)會(DGKL)、美國國家標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)研究院(NIST)、根特(Ghent)大學(xué)建立了血清尿酸檢測的參考方法——同位素稀釋-氣相色譜質(zhì)譜(ID-GC/MS)法[52-53]，中國國家計量院和衛(wèi)生部臨床檢驗中心建立UA同位素稀釋液相色譜質(zhì)譜 (ID-LC/MS) 法和同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜 (ID-LC/MS/MS)法[54]。對比以上檢測方法，微流控紙芯片法具有諸多優(yōu)勢，也存在一些不足之處尚待解決。例如，要準(zhǔn)確測量全血中尿酸含量，需去除或降低干擾。尿酸檢測中存在的干擾包括物理干擾和化學(xué)干擾，例如采用比色法進行全血測定時紅細胞自身顏色的干擾，氧化還原法測尿酸時共存還原性物質(zhì)如抗壞血酸、多巴胺的干擾。面對這些問題，可通過對樣品進行簡單預(yù)處理，如添加某種試劑對干擾物質(zhì)進行屏蔽、在紙張表面附加固定相來完成對干擾物質(zhì)的分離等方法進行解決。同時采用固定容積的采血針將血稀釋成一定的倍數(shù)也可能使尿酸檢測簡化。目前微流控紙芯片技術(shù)還需不斷發(fā)展完善，紙上實驗室的構(gòu)建還存在較大發(fā)展空間。相信隨著紙芯片技術(shù)的發(fā)展，尿酸的檢測將會變得更加簡單，有望實現(xiàn)對全血中尿酸的實時檢測。