柴瑞凡，何玉潔

0 引言

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(Recurrent spontaneous abortion，RSA)是指同一對性伴侶連續(xù)發(fā)生3次或3次以上在妊娠28周之前的胎兒丟失，在有生育能力的夫婦中發(fā)病率高達1%～5%；RSA中有50%以上屬于不明原因的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(Unexplained recurrent spontaneous abortion，uRSA)[1]。在輔助生殖技術(shù)(Assisted reproductive technology，ART)中，約10%的不孕患者在體外受精(Invitrofertilization，IVF)后至少有2～3次種植失敗。反復(fù)種植失敗(Recurrent implantation failure，RIF)是指40歲以下的女性在至少3個新鮮或冷凍周期內(nèi)移植至少4個優(yōu)質(zhì)胚胎后未能實現(xiàn)臨床妊娠[2]。大量研究發(fā)現(xiàn)uRSA與RIF的發(fā)生與免疫相關(guān)，如某些抗體的異常升高、各種細胞因子異常表達以及細胞免疫異常等。這些免疫異常可能導(dǎo)致母-胎免疫耐受異常，進一步影響胚胎著床及發(fā)育，從而導(dǎo)致流產(chǎn)。臨床上對于uRSA及RIF的治療可選擇免疫治療，本文將從uRSA與RIF的免疫治療機制及臨床進展進行闡述。

1 糖皮質(zhì)激素

糖皮質(zhì)激素因其強大的抗炎和免疫抑制特性成為uRSA和RIF免疫治療的首選藥物，目前臨床上應(yīng)用較廣的主要是潑尼松，且較少單獨使用，臨床上多數(shù)研究為潑尼松與阿司匹林、肝素、孕酮、復(fù)合維生素等聯(lián)合使用，可改善妊娠結(jié)局[3-6]。潑尼松可誘導(dǎo)淋巴細胞向妊娠所需的Treg細胞分化，抑制其向?qū)θ焉镉泻Φ腡h17細胞分化，抑制IL-17 mRNA的表達和IL-17的分泌，促進Foxp3 mRNA表達、IL-10分泌[4]。在免疫過度激活的患者中，潑尼松可下調(diào)IL-18/腫瘤壞死因子樣弱凋亡的誘導(dǎo)物(Tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis，TWEAK)及IL-15/Fn-14(Fibroblast growth factor-inducible molecule，纖維細胞生長因子誘導(dǎo)分子)比率[5]，從而改善免疫過度激活狀態(tài)，阻止形成不利于著床的Th1主導(dǎo)的微環(huán)境、改變子宮自然殺傷細胞(Uterine natural killer cell，uNK cell)的局部細胞毒性，促進血管生成及免疫營養(yǎng)通路的構(gòu)建[5-6]，從而提高妊娠率。

2 宮腔內(nèi)注射自體外周血單個核細胞

外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMC)提取于自體外周血，主要由單核巨噬細胞(10%～30%)、淋巴細胞(70%～90%)、樹突狀細胞(1%～2%)和其他幾種類型細胞組成。此療法改善胚胎移植后妊娠結(jié)局的機制可能為：①PBMCs可增強滋養(yǎng)細胞的增殖活性，利于胚胎著床；②這些細胞分泌的細胞因子和生長因子，如白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor，LIF)、白細胞介素-1(IL-1)、白細胞介素-4(IL-4)、白細胞介素-8(IL-8)、血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)及各種蛋白酶等改善了宮腔內(nèi)的免疫環(huán)境；③人絨毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotropin，hCG)可增強PBMCs的作用[7-10]。在動物實驗中，宮腔內(nèi)注射PBMCs可改善小鼠、牛等的子宮內(nèi)膜容受性，從而提高胚胎移植后的妊娠率[7]。在IVF-ET失敗患者中，宮內(nèi)給予hCG激活的PBMC可提高著床率及妊娠率[8-10]，且強調(diào)在RIF患者(至少3次胚胎移植失敗的患者)中更顯著[9]。多數(shù)研究認(rèn)為，hCG體外孵育PBMC的最佳時間為24 h，因為此時細胞產(chǎn)生的各種細胞因子等含量最高；也有研究將孵育時間控制為48 h，或更方便新鮮PBMCs的移植[8-10]。最早進行hCG激活的PBMCs宮內(nèi)給藥的研究發(fā)表在2006年，為新鮮取卵周期進行，宮腔內(nèi)注射的細胞混懸液為取卵當(dāng)天從患者本人外周血提取、經(jīng)hCG孵育48 h后的PBMCs與取卵后2 d再次提取的新鮮PBMCs的混合物，給藥時間為取卵后第2天，囊胚移植時間為給藥后第3天[8]。自此，關(guān)于解凍周期中宮內(nèi)注射PBMCs的研究逐漸增加，在卵裂早期胚胎解凍周期中，宮腔內(nèi)注射PBMCs的時間一般為該周期第1天，在囊胚解凍周期中一般為該周期的第二天，而在囊胚解凍移植周期中給予宮腔內(nèi)注射hCG激活的PBMCs，可能因數(shù)據(jù)較少，著床率和妊娠率未見明顯改善[9]。

3 粒細胞集落刺激因子

粒細胞集落刺激因子(Granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)是由骨髓細胞、成纖維細胞、基質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞及免疫活性細胞如T細胞、單核巨噬細胞等產(chǎn)生的，影響造血祖細胞生存、生長和分化所必需的一類生長因子，可調(diào)節(jié)成熟免疫細胞的功能，促進血管生成[11-14]。隨機對照試驗結(jié)果顯示，G-CSF可提高RSA和RIF患者的臨床妊娠率和活產(chǎn)率，在改善薄型子宮內(nèi)膜厚度方面有一定作用，但對提高著床率、妊娠率及活產(chǎn)率無明顯作用或無作用，這可能與納入標(biāo)準(zhǔn)偏差和樣本量不足有關(guān)[11-13]。G-CSF對胚胎植入過程的調(diào)節(jié)及對妊娠結(jié)局改善的機制可能是通過對免疫細胞功能的調(diào)節(jié)產(chǎn)生的，如增加蛻膜組織中Treg細胞數(shù)量及利于胚胎著床的細胞因子如G-CSF和VEGF等的含量，也可能與促進子宮內(nèi)膜細胞再生、增加子宮內(nèi)膜厚度、改善子宮內(nèi)膜容受性有關(guān)[11]。G-CSF的給藥方式目前主要有口服給藥、宮腔內(nèi)注射及皮下注射，針對接受新鮮移植周期治療的RIF患者。目前關(guān)于促性腺激素釋放激素(Gonadotropin Releasing Hormone，GnRH)激動劑方案中宮腔內(nèi)注射G-CSF的研究較多，給藥時間多為扳機日注射hCG之前，劑量多為300 μg[12-13]。在冷凍胚胎移植(Frozen embryo transfer，F(xiàn)ET)周期中，給藥時間為FET周期的第14天，劑量為300 μg[14]。對于RSA患者則可采用口服給藥，有研究在排卵后第6天開始口服G-CSF[1 mg/(kg>·d)]，至月經(jīng)來潮或妊娠第9周末。

4 免疫球蛋白

免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)提取自大量健康獻血者的混合血漿，含有可廣泛針對外來抗原的抗體和自體抗原[15-18]。已有研究證明,靜脈注射用人免疫球蛋白(Intravenous immunoglobulin，IVIg)可以改善RSA患者的妊娠結(jié)局，相較于異體白細胞療法可避免感染及HLA免疫的傳播風(fēng)險，且效果相近，推測其機制為IVIg含有可保護胎兒免受免疫排斥反應(yīng)的特異性抗體。關(guān)于IVIg治療uRSA和RIF機制的討論尚未達成一致。有研究證明，hCG聯(lián)合IVIg治療可降低Th17及其細胞因子IL-17、IL-6水平，而提高Treg細胞水平及相關(guān)細胞因子IL-10和TGF-β水平，即改善Th17/Treg比值，利于維持妊娠[15]。也有研究顯示，IVIg治療可降低CD4+T細胞比例，恢復(fù)Th1/Th2細胞因子平衡，維持Th2型細胞因子占主導(dǎo)的利于妊娠的環(huán)境。對于卵泡早期外周血CD56+、CD16+及NK細胞百分率低的RIF患者，IVIg治療可顯著提高胚胎種植率和妊娠率[16]。此外，IVIg聯(lián)合潑尼松治療應(yīng)用于uRSA和RIF較IVIg單藥治療可能活產(chǎn)率更高[18]。多數(shù)研究建議，IVIg僅適用于有異常細胞免疫患者，而異常細胞免疫的標(biāo)準(zhǔn)因檢測方法等的差異未形成共識[15-18]。關(guān)于IVIg的使用劑量和頻率，各研究尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。對于RSA患者，目前的治療方案多為妊娠4～7周期間給藥(20 g，iv，5 d)。對于RIF患者，不同研究的給藥方案不同，有針對長效GnRH激動劑方案控制性超促排卵的研究，于FSH刺激周期第8天開始第1次給藥(24 g，iv)，經(jīng)血hCG檢測及超聲確定宮內(nèi)妊娠后，于妊娠第4周、第6周及第10周分別再次給藥(24 g，iv)；也有研究采用移植前5 d到移植后1 d給藥(25 g，iv，7 d)，檢測血hCG陽性后立即再次給藥(25 g，iv)，待B超確定宮內(nèi)妊娠后于孕5～9周每周1次給藥(25 g，iv)，孕10～14周每2周1次給藥(25 g，iv)[15-18]。

5 環(huán)孢素A

環(huán)孢素A (Cyclosporin A，CsA)是一種廣泛應(yīng)用于器官移植和自身免疫性疾病的強效免疫抑制劑，可以防止宿主對同種異體移植物的排斥反應(yīng)，屬于鈣調(diào)磷酸酶抑制劑。動物實驗及體外研究結(jié)果表明，低劑量CsA能以濃度和時間依賴性的方式促進妊娠早期滋養(yǎng)細胞的增殖，并促進妊娠早期滋養(yǎng)細胞的遷移與侵襲能力。此外，其在誘導(dǎo)母-胎界面免疫耐受、調(diào)節(jié)免疫細胞功能方面有重要作用，從而導(dǎo)致妊娠結(jié)局的改善[19]。同時有臨床試驗結(jié)果支持適當(dāng)劑量的CsA治療RSA及RIF療效好，可獲得良好的妊娠結(jié)局[20]。關(guān)于CsA改善妊娠結(jié)局的作用機制，目前有研究支持其可調(diào)節(jié)Th1/Th2型細胞因子比例平衡，促進形成Th2型細胞因子占主導(dǎo)的利于妊娠的母胎免疫界面。也有研究表明，CsA可促使外周血CD4+CD25+FOXP3+T細胞增殖并分泌相關(guān)細胞因子、調(diào)節(jié)外周血NK細胞的數(shù)量及功能，增強滋養(yǎng)細胞侵襲能力，促進胚胎植入。亦有研究發(fā)現(xiàn)，CsA改善RSA及RIF患者妊娠結(jié)局可能與巨噬細胞、樹突狀細胞等的抗原提呈功能的改善有關(guān)[20-21]。動物實驗發(fā)現(xiàn)，CsA的血藥濃度維持在0.1～1.0 μmol/L時效果最好，而在臨床上，給藥方法為孕前30～60 d口服CsA 50 mg(bid或tid，根據(jù)體重選擇)，使血藥濃度維持在80～150 ng/ml，用藥時間為4周[20]。關(guān)于CsA的不良反應(yīng)，有動物實驗發(fā)現(xiàn)，CsA對大鼠及家兔有生殖毒性，可能會增加早產(chǎn)風(fēng)險，但大多臨床試驗研究尚未發(fā)現(xiàn)明顯毒副作用，這可能與樣本數(shù)量少有關(guān)[19-21]。

6 羥氯喹

羥氯喹(Hydroxychloroquine，HCQ)最早作為一種合成抗瘧藥物于20世紀(jì)40年代問世，20世紀(jì)50年代被應(yīng)用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡，70年代被廣泛用于骨科術(shù)后預(yù)防血栓治療，目前作為治療風(fēng)濕免疫性疾病的基礎(chǔ)藥物被廣泛用于臨床。此外，其在治療皮膚病、感染性疾病(抗瘧原蟲、細菌、病毒等)、內(nèi)分泌疾病、心血管疾病及腫瘤等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，HCQ應(yīng)用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者及抗磷脂抗體陽性患者可改善其妊娠結(jié)局，并發(fā)現(xiàn)HCQ可劑量依賴性地降低血栓形成風(fēng)險、血管內(nèi)皮功能障礙等[22-25]。此外，HCQ在抗炎及免疫調(diào)節(jié)方面也有潛在的影響，關(guān)于免疫調(diào)節(jié)機制，目前有研究認(rèn)為，其可通過抑制某些Toll樣受體的激活對免疫產(chǎn)生影響。也有研究發(fā)現(xiàn)，HCQ可通過減少循環(huán)中IL-1、IL-2、IL-6、TNF-α、INF-γ等Th1型細胞因子的含量，促進Th1/Th2型細胞因子比例平衡[23-25]，但關(guān)于HCQ對于RSA和RIF患者免疫調(diào)節(jié)機制的研究較少，尚無法討論。目前臨床上認(rèn)為HCQ對改善RSA和RIF患者妊娠結(jié)局有潛在意義，相關(guān)臨床研究正在進行或?qū)⑦M行。HCQ的不良反應(yīng)與每日的最大劑量相關(guān)，安全劑量為低于6.5 mg/(kg>·d)，在上述試驗中于孕前給藥，每日劑量為400 mg/d，至妊娠10周或未妊娠者1年停藥[24-25]。

7 大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑

本文主要介紹他克莫司(FK506)和西羅莫司(又稱雷帕霉素)，兩者結(jié)構(gòu)相似，均具有抗菌、免疫抑制和抗腫瘤的作用，但用于臨床時間尚短。他克莫司的免疫抑制作用機制主要是通過抑制鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白磷酸酶的活性，從而抑制核調(diào)蛋白、T細胞活化因子(如IL-2)的分泌及細胞因子相應(yīng)受體的表達，體外試驗中能有效抑制混合淋巴細胞反應(yīng)，目前多作為器官移植后的免疫抑制劑，且有研究認(rèn)為其免疫抑制作用強于環(huán)孢素而不良反應(yīng)小于環(huán)孢素[26]。西羅莫司通過抑制雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamacin，mTOR)的活性發(fā)揮作用，可阻斷T細胞及B細胞的鈣依賴和非鈣依賴的信號傳導(dǎo)通路，通過作用于不同細胞因子受體阻斷信號傳導(dǎo)，減少INF-γ、TNF-α、IL-6等細胞因子的分泌，同時促進IL-10等的分泌，目前常用作器官移植后的免疫抑制劑，其抗排斥療效好、低毒、無腎毒性，也作為抗癌藥物和治療阿爾茨海默癥的新型藥物[27]。鑒于兩種新型免疫抑制劑的作用機制與RSA及RIF可能原因的重合，推測其對RSA及RIF患者是否有益。動物實驗證明，西羅莫司可改善低Treg細胞的小鼠的胚胎種植率，提示西羅莫司可能對改善Treg細胞異常的RSA及RIF患者的胚胎種植率及妊娠結(jié)局有益，但仍缺乏相關(guān)研究證實。關(guān)于其對母胎的安全性，有動物實驗發(fā)現(xiàn)其對實驗動物有生殖毒性。也有研究發(fā)現(xiàn)，肝移植后使用他克莫司的患者發(fā)生妊娠不良事件如子癇前期、早產(chǎn)等的風(fēng)險可能增加，但因樣本數(shù)量較少，尚不能定論[28-29]，而關(guān)于西羅莫司的動物實驗未發(fā)現(xiàn)明顯母胎不良反應(yīng)，但仍需更多數(shù)據(jù)說明。

8 丹酚酸B

丹酚酸B(Salvianolic acid B，Sal B)是提取于丹參的一種水溶性成分，已有大量研究證明其具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)功能，在心臟保護、腦血管保護、抗肝纖維化及抗腫瘤等方面有著廣泛作用[30-32]。有研究發(fā)現(xiàn)，Sal B可增加VEGF的表達，促進血管新生。也有動物實驗發(fā)現(xiàn)，其可改善自然流產(chǎn)模型小鼠的妊娠結(jié)局，減少外周血CD8+T細胞及NK細胞的數(shù)量，降低胎盤促炎因子如TNF-α、INF-γ、IL-6的分泌及Toll樣受體的表達，從而調(diào)節(jié)母胎界面免疫平衡，改善妊娠結(jié)局[33]。

9 免疫治療的安全性

關(guān)于免疫治療的安全性，我們主要從妊娠期母體的耐受能力、藥物對母體的毒性及其致畸、流產(chǎn)、對胎盤功能的影響和遠期對胎兒的不良影響等方面進行評價。根據(jù)糖皮質(zhì)激素的藥理作用，推測其可能導(dǎo)致或加重患者水鈉潴留、骨質(zhì)疏松、妊娠期糖尿病等。有動物實驗證明，糖皮質(zhì)激素可增加胚胎腭裂、胎盤功能不全、胚胎發(fā)育遲緩的發(fā)生。也有研究發(fā)現(xiàn)，在大劑量糖皮質(zhì)激素或沖擊療法治療妊娠合并風(fēng)濕免疫系統(tǒng)疾病時，可能增加妊娠期高血壓疾病、妊娠期糖尿病、感染及胎膜早破的發(fā)生率。因潑尼松通過胎盤可失活、對胚胎影響較小，常作為RSA及RIF患者首選的糖皮質(zhì)激素治療藥物，有臨床資料顯示，小劑量(≤10 mg/d)潑尼松應(yīng)用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡等風(fēng)濕免疫系統(tǒng)疾病或腎移植的妊娠患者未發(fā)現(xiàn)致畸作用。臨床上RSA及RIF患者多于備孕期及妊娠早期短期使用潑尼松，因此，其對嬰幼兒的生長發(fā)育未見不良影響[4-7]。G-CSF對母體潛在的不良反應(yīng)有骨痛癥、發(fā)熱、過敏反應(yīng)及Sweet綜合征(一種炎性疾病，以發(fā)熱、中性粒細胞增高伴皮膚多發(fā)性、痛性紅斑樣結(jié)節(jié)及皮內(nèi)大量中性粒細胞浸潤為特點)，但其發(fā)生率低。大量研究顯示，其應(yīng)用于RSA及RIF患者未發(fā)生明顯不良反應(yīng)，而其對胎盤及胎兒的影響尚缺乏研究資料[12-15]。IVIg的不良反應(yīng)多與輸注速度及使用劑量相關(guān)，一般低劑量很少發(fā)生，關(guān)于其不良反應(yīng)發(fā)生率的報道差異很大，常見癥狀有背痛、頭痛、胸痛、畏寒、發(fā)熱、心悸、惡心、嘔吐、腹瀉等，此外還有腎臟毒性、血栓形成、過敏反應(yīng)、無菌性腦膜炎、中性粒細胞減少癥、溶血、輸血相關(guān)急性肺損傷及病毒傳播性疾病等。關(guān)于RSA及RIF患者的IVIg治療的研究多使用小劑量、慢速輸注，可能因此尚無嚴(yán)重不良反應(yīng)的報道[16-19]。對于環(huán)孢素A、羥氯喹及大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑，均有動物實驗證明其有生殖毒性，且有潛在致畸風(fēng)險[20,22,28]，但作為治療風(fēng)濕免疫系統(tǒng)疾病的常用藥物，較多研究支持合理劑量對胎兒沒有嚴(yán)重危害，未發(fā)現(xiàn)致畸作用，該結(jié)論可能與缺乏可靠的人群資料有關(guān)。

10 結(jié)語

綜上所述，目前關(guān)于改善RSA及RIF患者妊娠結(jié)局的免疫治療的研究較多，且證實有效、臨床已采用的方法已為這些患者帶來福音，更有新型免疫抑制劑可能有更好的效果及更小的傷害，但仍需更多的研究來進一步證實，并探究更有效更安全的用法、劑量。這提示我們關(guān)于RSA及RIF的免疫機制的研究、免疫抑制劑應(yīng)用于RSA及RIF患者的研究有著無限的未知空間。