白雨鑫，李晉齊，童榮生

0 引言

中藥指紋圖譜研究技術(shù)以復(fù)方制劑整體為研究對(duì)象，展示制劑品質(zhì)的真實(shí)性、一致性和穩(wěn)定性，全面評(píng)價(jià)制劑中復(fù)雜的化學(xué)成分和比例，已成為國(guó)際公認(rèn)的中藥材和各制劑質(zhì)量控制手段[1-2]?；⒄冉舛绢w粒(無(wú)糖型)是在保證原虎杖解毒顆粒處方、提取以及精制工藝不變的情況下，對(duì)成型工藝改制而得。為評(píng)價(jià)改制前后質(zhì)量的變化，本研究對(duì)這兩種制劑分別建立指紋圖譜，并比較其共有峰及共有圖譜模式的差異。

1 試驗(yàn)材料

1.1 藥物與試劑 虎杖解毒顆粒(無(wú)糖型)和虎杖解毒顆粒(四川省人民醫(yī)院藥學(xué)部制劑室，各10個(gè)不同批次)、大黃素(批號(hào)：110756-200110)、虎杖苷(批號(hào)：11575-200502)、射干苷(批號(hào)：111632-200501)，甲醇、乙腈為色譜純，磷酸為分析純，試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器 e2695型HPLC儀(包括Waters公司2998 PDA檢測(cè)器，Empower3色譜工作站)；BP211D型電子分析天平(十萬(wàn)分之一，德國(guó)Sartorius公司)；KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Phenomenex Gemini 110A C18(250 mm×4.6 mm，5μm)；檢測(cè)波長(zhǎng)300 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μl；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.05%磷酸溶液(B)，梯度洗脫(見(jiàn)表1)；色譜記錄時(shí)間為120 min[3-4]。

表1 流動(dòng)相梯度表

2.2 溶液制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 取虎杖苷、射干苷、大黃素對(duì)照品適量，各精密稱(chēng)定后置于50 ml容量瓶中，甲醇超聲溶解，放冷定容，搖勻得虎杖苷8.83 μg/ml、射干苷15.15 μg/ml、大黃素7.28 μg/ml的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取研細(xì)并過(guò)三號(hào)篩的虎杖解毒顆粒(無(wú)糖型)粉末近5 mg，精密稱(chēng)定，轉(zhuǎn)移至50 ml棕色容量瓶中，加入40 ml甲醇,超聲溶解60 min，放至室溫后定容搖勻，用0.45 μm有機(jī)系微孔濾膜濾過(guò)5 ml，取續(xù)濾液，即得。同法制備虎杖解毒顆粒供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 重復(fù)性試驗(yàn) 以編號(hào)S1的同一供試品為對(duì)象，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10 μl測(cè)定。以7號(hào)峰(虎杖苷)為參照，計(jì)算出各共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD范圍(0.28%～0.62%)和相對(duì)峰面積RSD范圍(0.59%～2.13%)，表明建立的方法重復(fù)性良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取制備的供試品(編號(hào)S1)溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、6、12、24 h進(jìn)樣10 μl，以7號(hào)峰(虎杖苷)為參照，計(jì)算出各共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD范圍(0.27%～0.79%)和相對(duì)峰面積RSD范圍(0.46%～2.07%)，表明該方法制得的溶液穩(wěn)定性良好。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取制備的供試品(編號(hào)S1)溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10 μl，分析圖譜。以7號(hào)峰(虎杖苷)為參照，計(jì)算出各共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD范圍(0.16%～0.57%)和相對(duì)峰面積RSD范圍(0.37%～1.83%)，表明儀器精密度良好。

2.4 指紋圖譜的建立與分析

2.4.1 指紋圖譜的重疊匹配 取10批虎杖解毒顆粒(無(wú)糖型)和虎杖解毒顆粒樣品，以“2.2.2”項(xiàng)下方法處理，“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)導(dǎo)入數(shù)據(jù)，分析得到兩種制劑樣品的指紋圖譜重疊匹配圖[5]，結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 虎杖解毒顆粒(無(wú)糖型)的指紋重疊色譜圖

圖2 虎杖解毒顆粒的指紋重疊色譜圖

2.4.2 共有峰的標(biāo)定和參照峰的確認(rèn) 利用多點(diǎn)校正進(jìn)行自動(dòng)匹配，中位數(shù)法生成對(duì)照?qǐng)D譜，共標(biāo)定了19個(gè)峰形較好、穩(wěn)定出現(xiàn)的共有峰。其中7號(hào)峰吸收強(qiáng)，峰面積大且保留時(shí)間穩(wěn)定，故將其作為參照峰。

2.4.3 特征成分的指認(rèn) 精密吸取虎杖解毒顆粒(無(wú)糖型)、虎杖解毒顆粒和混合對(duì)照品溶液，以“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，色譜圖匹配后見(jiàn)圖3。通過(guò)與對(duì)照品圖譜比對(duì)，指認(rèn)兩種供試品溶液的特征共有峰，分別為虎杖苷、射干苷和大黃素，7號(hào)參照峰為虎杖苷。

圖3 虎杖解毒顆粒、虎杖解毒顆粒(無(wú)糖型)和混合對(duì)照品匹配色譜

2.4.4 虎杖解毒顆粒(無(wú)糖型)和虎杖解毒顆粒的共有模式比較 利用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)，得到兩種供試品制劑的指紋圖譜共有模式，如圖4所示。

圖4 虎杖解毒顆粒和虎杖解毒顆粒(無(wú)糖型)共有模式注：7.虎杖苷；9.射干苷；17.大黃素

2.5 指紋圖譜的相似度分析

2.5.1 指紋圖譜中共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積 以參照峰(峰7)的保留時(shí)間和色譜峰面積為1.000 0，分別計(jì)算虎杖解毒顆粒(無(wú)糖型)和虎杖解毒顆粒中共有峰(1～19號(hào)峰)的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果見(jiàn)表2～表5。

表2 虎杖解毒顆粒(無(wú)糖型)共有峰的相對(duì)峰面積

表3 虎杖解毒顆粒(無(wú)糖型)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間

表4 虎杖解毒顆粒共有峰的相對(duì)峰面積

表5 虎杖解毒顆粒共有峰的相對(duì)保留時(shí)間

由表2～表5可知，在10個(gè)不同批次的虎杖解毒顆粒(無(wú)糖型)和虎杖解毒顆粒的指紋圖譜中，共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于1%，相對(duì)峰面積RSD均小于5%，表明2種制劑的工藝均穩(wěn)定可行，指紋圖譜適應(yīng)性良好。

2.5.2 指紋圖譜的相似度計(jì)算 將各10批供試品的色譜圖數(shù)據(jù)以AIA.格式導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)，進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)[6]。結(jié)果10批虎杖解毒顆粒(無(wú)糖型)和虎杖解毒顆粒指紋圖譜的相似度平均值分別為 0.998和0.997，RSD值分別為0.32%和0.46%，符合指紋圖譜測(cè)定要求，表明2種供試品制劑的各批次間差異較小，質(zhì)量穩(wěn)定性較好。

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化 由于復(fù)方中藥制劑成分復(fù)雜，在一個(gè)波長(zhǎng)下難以體現(xiàn)所有成分的特征，本研究在供試品溶液全波長(zhǎng)掃描基礎(chǔ)上，重點(diǎn)考察250、300、360 nm波長(zhǎng)切換掃描，結(jié)果顯示，在300 nm條件下，檢測(cè)到的色譜峰信息更全面，基線(xiàn)更平穩(wěn)，故作為檢測(cè)波長(zhǎng)[7-9]。

參考相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)虎杖等藥材中相關(guān)成分的色譜條件研究[10-11]，考察了不同提取溶劑(乙醇、水、甲醇)、不同柱溫(30、35、40 ℃)、不同超聲時(shí)間(30、60、90 min)、不同流動(dòng)相體系(乙腈-水、乙腈-0.2%磷酸溶液、乙腈-0.05%磷酸溶液)對(duì)色譜結(jié)果的影響。結(jié)果表明，用甲醇超聲處理60 min，柱溫30 ℃，流動(dòng)相乙腈-0.05%磷酸溶液，各色譜峰分離情況及峰形較好。由于供試液成分在圖譜前段重疊多、分離情況差，故對(duì)流動(dòng)相前20 min降速，之后保持1 ml/min梯度洗脫。供試液中成分均在120 min前出峰，之后沒(méi)有相關(guān)色譜峰出現(xiàn)，故進(jìn)樣時(shí)間定120 min。

3.2 虎杖解毒顆粒(無(wú)糖型)和虎杖解毒顆粒的圖譜分析和對(duì)照 虎杖解毒顆粒(無(wú)糖型)和虎杖解毒顆粒各批次的指紋圖譜相似度均大于0.98，說(shuō)明創(chuàng)建的指紋圖譜的技術(shù)指標(biāo)穩(wěn)定可靠、重復(fù)性較好，能夠較好地全面反映制劑中化學(xué)成分的特征，并監(jiān)控其成分及含量的變化。

對(duì)虎杖解毒顆粒(無(wú)糖型)和虎杖解毒顆粒指紋圖譜共有模式進(jìn)行對(duì)照，其19個(gè)共有色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間基本一致。結(jié)果表明，兩制劑的主要成分基本無(wú)變化，本研究為虎杖解毒顆粒(無(wú)糖型)研發(fā)的科學(xué)性、合理性提供了依據(jù)。