盛琰翔，劉春菊，王清華，遲田英，馬洪超，王志亮，吳曉東，包靜月

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 動物科技學(xué)院，浙江 杭州 311300；2.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東 青島 266032）

小反芻獸疫(peste des petits ruminants，PPR)是由小反芻獸疫病毒(peste des petits ruminants virus，PPRV)引起的一種急性病毒性傳染病，主要感染山羊Caprahircus、綿羊Ovisaries以及其他野生小反芻獸，以發(fā)熱，眼、鼻分泌物增多，胃炎、腹瀉和肺炎為特征。該病主要流行于亞洲和非洲，2007年中國在西藏阿里地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)該病，2010年8月在阿里地區(qū)日土縣再次發(fā)生疫情[1?2]。2013年末，該病傳入中國新疆地區(qū)，并迅速傳播至22個省份，對中國養(yǎng)羊業(yè)造成嚴(yán)重危害[3?4]。PPRV屬于副黏病毒科Paramyxovirdae麻疹病毒屬Morbolivirus；基因組為單股負(fù)鏈RNA，長度為15 948 nt或者15 954 nt；基因組3′末端為前導(dǎo)序列(leader)，5′末端為尾隨序列(trailer)；6個基因排列順序為3′-N-P-M-F-H-L-5′，依次編碼6個結(jié)構(gòu)蛋白：核衣殼蛋白(N)、磷蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝蛋白(H)和大蛋白(L)；P基因還編碼2個非結(jié)構(gòu)蛋白C和V。根據(jù)F基因或N基因部分核苷酸序列差異可將PPRV毒株分為4個基因系[5?6]，亞洲國家流行的毒株屬于基因Ⅳ系[1]。小反芻獸疫病毒在流行過程中，基因組發(fā)生點突變，核苷酸變異速率大約為9×10?4位點·a?1[7?8]。對中國2013年11月至2014年6月間25個毒株的基因組序列的比對和分析發(fā)現(xiàn)：P基因變異最大，非同義突變率最高[8]。隨著全面免疫的實施，受免疫選擇壓的作用，病毒各基因尤其是P基因的變異率及非同義突變率發(fā)生變化，有必要進(jìn)一步研究。PPRVP基因核苷酸長度為1 530 nt，編碼509個氨基酸，編碼的P蛋白分子量約54.9 kD。P蛋白在病毒RNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程中發(fā)揮作用，也能單獨與N蛋白-RNA模板復(fù)合物結(jié)合激活轉(zhuǎn)錄，同時與L蛋白相結(jié)合形成依賴于RNA的RNA聚合酶，并與N蛋白-RNA模板結(jié)合形成核糖核蛋白復(fù)合體，進(jìn)行病毒RNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制[9]。本研究對2013年以來中國PPRV流行毒株P(guān)基因進(jìn)行序列測定和分析，探討病毒流行過程中P基因的序列變異情況。

1 材料與方法

1.1 病毒來源

2014?2017年，采集到9個省12個疫點的PPRV陽性組織樣品12份，由中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心保存并提供，具體樣品信息見表1。

表 1 2014?2017 年中國 12 株 PPRV 毒株信息Table 1 Details of the 12 PPRV strains collected in China during 2014?2017

1.2 病毒 RNA 提取

取腸系淋巴結(jié)組織100 mg，用組織勻漿儀勻漿后，根據(jù)High Pure Viral RNA Kit (Roche)的操作說明提取病毒RNA，?80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (RT-PCR)

采用Prime ScriptTMOne Step RT-PCR Kit (TaKaRa)擴(kuò)增PPRVP基因。反應(yīng)體系共50 μL，包括2× 1 Step Buffer 25 μL，Primerscript 1 step Enzyme Mix 2 μL，上、下游引物各 2 μL，病毒 RNA 5 μL。RT-PCR反應(yīng)條件為：50 ℃逆轉(zhuǎn)錄30 min，94 ℃ 2 min，進(jìn)行Taq酶激活；40個循環(huán)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)(94 ℃ 1 min，68 ℃ 1 min，72 ℃ 4 min)；72 ℃ 7 min再延伸。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收。

1.4 序列測定和進(jìn)化樹繪制

純化后的PCR產(chǎn)物送青島華大公司測序，獲得12個毒株的P基因序列；從GenBank中下載2013?2014年中國25個PPRV流行毒株的基因組序列[8](表2)，截取P基因序列后進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列比對。從GenBank中下載中國及其他10個國家共15個PPRV代表毒株的基因組序列(表3)，繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。用MEGA 4.0 軟件進(jìn)行序列比對，用最大似然法構(gòu)建分子進(jìn)化樹，bootstrap測試1 000次重復(fù)。用Simplot軟件進(jìn)行序列同源性分析。

表 2 2013?2014 年中國 PPRV 流行毒株信息Table 2 Details of the PPRV strains collected in China during 2013?2014

表 3 PPRV 參考毒株信息Table 3 Details of the PPRV reference strains used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 P基因核苷酸序列比較

2013?2017年，來自中國21個省份37個疫點的37株P(guān)PRV毒株P(guān)基因核苷酸序列間遺傳距離為0～0.009 2。其中，2013年11月至2014年10月間的18個毒株P(guān)基因序列完全一致。這些毒株分別來自新 疆 (XJYL2013、XJ22013、XJ32013、XJ42013、XJ52013)、甘 肅 (GS2014)、遼 寧 (LN2014)、重 慶(CQ2014)、云南 (YN2014)、江蘇 (JS2014)、湖北 (HB2014)、河南 (HeN2014)、山西 (SX2014)、吉林(JL2014)、貴州 (GZ2014)、湖南 (HN2014)、四川 (SC2014)、浙江 (ZJ82014)等 14個省份。毒株XJ302017與GZ252017間的基因核苷酸序列差異最大，為0.009 2，共14個位點存在序列差異。

為考察毒株序列變異與流行時間的關(guān)系，選取最早采集的XJYL2013毒株作為參照，將其余36個毒株與其進(jìn)行P基因核苷酸序列比對。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：36個毒株分別在0～8個位點發(fā)生了突變。其中2013年11月至2014年10月間來自14省份的17個毒株與XJYL2013的P基因核苷酸序列完全一致。2014年3月至2015年3月黑龍江的HLJ2014、江西的JX2014、安徽的AH2014、廣西的GX2014和廣東的GD2014等5個毒株在不同位點發(fā)生了1個變異。2014年2月至2016年8月寧夏的NX2014、陜西的SX2014、吉林的JL2014、江西的JX2014和JX62014、浙江的ZJ2014、廣西的GX62016等7個毒株在2個位點發(fā)生了變異。2015年4月安徽的AH162015和2016年1月的江蘇JS142016等2個毒株在3個位點發(fā)生了變異。2015年9月貴州的GZ112015、2016年10月湖南的HN182016、2017年 3月湖南的 HN02017等3個毒株在4個位點發(fā)生了變異。2017年9月貴州的GZ252017、2017年2月新疆的XJ302017分別在6和8個位點發(fā)生了變異。37個毒株之間的核苷酸變異位點分布于P基因的47個位點，其中45個突變位點僅存在于1個毒株中，2個突變位點分別為3個毒株共有。上述結(jié)果表明P基因核苷酸序列突變位點數(shù)與毒株流行時間正相關(guān)，突變無地域相關(guān)性。利用Simplot軟件對核苷酸序列發(fā)生變異的19株P(guān)PRV毒株與XJYL2013進(jìn)行P基因核苷酸序列同源性比較分析(圖1)，結(jié)果顯示：P基因序列的850～1 250 nt間序列同源性較高，突變分布少，500～800 nt區(qū)域變異較大。

P基因的47個核苷酸變異位點中，有26個核苷酸變異導(dǎo)致了氨基酸序列的改變(表4)：17個變異發(fā)生于第1位密碼子，其中的16個位點導(dǎo)致氨基酸改變；9個變異位于第2位密碼子，全部導(dǎo)致氨基酸改變；21個變異位于第3位密碼子，1個位點導(dǎo)致氨基酸改變。

圖 1 2013?2017年中國PPRV毒株P(guān)基因核苷酸序列同源性Simplot分析Figure 1 P gene nucleotide sequence similarity of China 2013?2017 PPRV strains using Simplot analysis

表 4 2013?2017年中國 PPRV 毒株P(guān)基因核苷酸和氨基酸序列變異情況Table 4 Nucleotide and amino acid diversity of China 2013?2017 PPRV strains

2.2 P基因氨基酸序列比較

2013?2017年中國37個PPRV毒株P(guān)基因氨基酸序列之間的遺傳距離為0～0.007 9。P基因編碼的509個氨基酸位點中，25個發(fā)生了突變，其中氨基端(1～250位氨基酸)16個，羧基端(251～509位氨基酸) 9個(圖2)。第21、83、505位氨基酸位點分別有2個、3個和3個毒株發(fā)生了變異。在第21位氨基酸位點，XJ302017第1位密碼子發(fā)生突變，導(dǎo)致丙氨酸(A)突變?yōu)樘K氨酸(T)，HN182016第2位密碼子發(fā)生突變，導(dǎo)致丙氨酸(A)突變至纈氨酸(V)。第83位氨基酸位點，3個毒株在同一個核苷酸位點發(fā)生不同突變，JL2014和 JX2014導(dǎo)致苯丙氨酸(F)突變至亮氨酸(L)，SaX2014苯丙氨酸(F)突變?yōu)槔i氨酸(V)。第505位氨基酸位點，3個毒株在同一個核苷酸位點發(fā)生相同突變，JX62014、HN182016和GZ112015均發(fā)生了亮氨酸(L)至纈氨酸(V)的突變。

2.3 P基因序列差異分析

比較2013?2017年中國37株P(guān)PRV流行毒株與之前15株代表毒株的P基因核苷酸序列，發(fā)現(xiàn)遺傳距離為0.025 4～0.139 7，其中與2007?2008年中國西藏地區(qū)3個毒株P(guān)基因核苷酸序列遺傳距離為0.025 4～0.031 5，而西藏地區(qū)3個流行毒株之間的P基因核苷酸序列遺傳距離為0～0.001 3。與15株代表毒株的氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)：2013?2017年中國37株P(guān)PRV流行毒株P(guān)基因的10個位點發(fā)生了核苷酸序列突變，其中3個導(dǎo)致了氨基酸序列的改變(表4)；2個變異發(fā)生于第1位密碼子，其中1個導(dǎo)致氨基酸改變；2個變異位于第2位密碼子，全部導(dǎo)致氨基酸改變；6個變異位于第3位密碼子，未導(dǎo)致氨基酸改變。

圖 2 2013?2017年中國37個PPRV毒株P(guān)蛋白氨基酸序列比對Figure 2 P protein amino acid sequence alignment of China 2013?2017 PPRV strains

2013?2017年，中國37株P(guān)PRV流行毒株與15株代表毒株P(guān)基因氨基酸序列的3個變異位點均位于175～243 位氨基酸，全部處在P蛋白的氨基端，其中175和176等2個相鄰位點都為變異位點。

2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

基于P基因核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)2013?2017年中國37株P(guān)PRV流行毒株構(gòu)成基因Ⅳ系中1個獨立的進(jìn)化小分支，而中國西藏地區(qū)流行毒株與印度2014年毒株形成1個小分支(圖3)。

圖 3 52個PPRV毒株P(guān)基因分子進(jìn)化樹Figure 3 Phylogenetic relationships of 52 PPRV genome sequences

3 討論

本研究對 2013?2017年中國 21個省份37個疫點的PPRV流行毒株P(guān)基因進(jìn)行序列分析，探明了PPRV流行過程中P基因序列變異情況，為PPR控制和消滅策略的制定提供了數(shù)據(jù)支持。

2013?2017年中國 37個 PPRV流行毒株的P基因變異較大。PPRV在中國流行的4 a間，P基因47個核苷酸位點發(fā)生了突變，其中26個導(dǎo)致了氨基酸序列的改變，非同義突變率為55.3%。研究[8]發(fā)現(xiàn)：2013年11月至2014年6月，25個毒株P(guān)基因在12個位點發(fā)生突變，其中10個導(dǎo)致了氨基酸序列的改變，非同義突變率為83.3%，高于F、H、L、N和M基因。已有研究[10]表明：2013?2017年中國37個PPRV流行毒株H基因的非同義突變率為58.5%，高于本研究中的P基因。這一結(jié)果提示：實施全面免疫后，PPRV在中國的流行受到了免疫選擇壓的作用，P基因的非同義突變率降低。

2013?2017年中國流行的PPRV毒株P(guān)蛋白氨基酸序列在10個位點發(fā)生了特征性的核苷酸突變，其中第21、83和505位3個導(dǎo)致了氨基酸序列改變。已有研究[9]表明：P蛋白對病毒RNA合成至關(guān)重要，可以分別與N蛋白、L蛋白及核衣殼結(jié)合形成不同的復(fù)合體發(fā)揮作用。P蛋白與L蛋白結(jié)合形成依賴于RNA的RNA聚合酶進(jìn)行病毒基因組RNA的轉(zhuǎn)錄，L蛋白發(fā)揮RNA聚合酶(RdRp)的作用，而P蛋白的作用是引導(dǎo)P-L復(fù)合體與核衣殼結(jié)合。一旦獲得足夠多的病毒蛋白，N蛋白就與病毒RNA結(jié)合，在這個過程中，P蛋白發(fā)揮蛋白伴侶的作用，引導(dǎo)N蛋白以游離形式與RNA結(jié)合。通常認(rèn)為[9]：N-P復(fù)合體調(diào)節(jié)從轉(zhuǎn)錄到復(fù)制的轉(zhuǎn)變。P-L復(fù)合體負(fù)責(zé)病毒基因組的復(fù)制，也就是說，先合成全長正鏈反向基因組RNA，然后以其為模板合成負(fù)鏈基因組RNA，用以組裝病毒粒子[11]。P蛋白通過與游離的N蛋白結(jié)合，從而阻止N蛋白發(fā)生非特異性的自我組裝，形成的N0-P復(fù)合物在復(fù)制過程中對新合成的RNA進(jìn)行加帽化。副粘病毒 P蛋白C末端的X-domain是主要的 N蛋白結(jié)合位點[9]。PPRV第429～509位氨基酸區(qū)域高度保守，推測可能為N蛋白結(jié)合位點[12]。P蛋白與其他蛋白相互作用的功能域主要分布于羧基端，因此，在病毒演化過程中，P蛋白的羧基端較為保守。本研究發(fā)現(xiàn)：2013?2017年中國流行的PPRV毒株P(guān)蛋白氨基酸序列在505位發(fā)生了高頻突變。該突變對其結(jié)構(gòu)及功能的影響還需要進(jìn)一步的研究。

在中國流行過程中，PPRV毒株P(guān)基因突變位點的數(shù)量與毒株流行時間呈正相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)：相對于最早分離的XJYL2013，2013?2014年流行的毒株P(guān)基因突變位點為0～2個，而2017年流行毒株P(guān)基因突變位點為4～8個，隨著毒株流行時間增長，P基因突變位點增多。已有研究[8]表明：PPRV毒株基因組在流行過程中的核苷酸突變進(jìn)化速率為9.54×10?4位點·a?1。在流行過程中PPRV毒株P(guān)基因持續(xù)發(fā)生突變，但不同毒株突變位點不同，表現(xiàn)為相對隨機(jī)的突變。隨著流行時間的增長，在穩(wěn)定免疫選擇壓的作用下，是否會出現(xiàn)變異位點的穩(wěn)定和定植，還有待進(jìn)一步的研究。持續(xù)實時監(jiān)測PPRV各基因分子變異，對于該病的防控具有重要意義。