楊花梅 孫菲，2 馬燕琳，2，3，4，5 李崎，2，3，4，5

海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院1海南省人類生殖與遺傳重點實驗室，2生殖醫(yī)學科（?？?70100）；3海南省地方病（地中海貧血）臨床醫(yī)學研究中心（?？?70100）；4海南醫(yī)學院熱帶轉(zhuǎn)化醫(yī)學教育部重點實驗室（?？?70100）；5?？谑腥祟愡z傳資源保藏重點實驗室（?？?70100）

β-地中海貧血［1］（β-thalassemia，簡稱β-地貧）是由于β-珠蛋白基因異常所致的單基因遺傳病，呈世界性分布，而我國尤以華南、西南地區(qū)發(fā)病最高，其中廣東、廣西、海南以及云南是地中海貧血的高發(fā)省份［2］。β-地貧臨床癥狀輕重不一，可分為輕型、中間型及重型，其治療方法也有所不同。輸血和鐵螯合是目前治療地貧的常規(guī)方法，部分患者需終生依賴輸血及鐵螯合來維持生命。該方案雖改善了患者的生存質(zhì)量，但是長期的輸血和鐵螯合也帶來了與輸血相關(guān)的感染和器官損傷等風險，也無法解決該疾病固有的遺傳原因［3］。異體造血干細胞移植（hematopoietic stem cell transplantation，HSCT）是目前已經(jīng)證實的臨床治愈地貧的唯一方法，如果在輸血傳播感染和鐵超載等并發(fā)癥發(fā)生之前進行HSCT，能夠顯著提高患者的生存率至90%［4］。但只有一小部分患者有合適的捐贈者，且清髓性HSCT 的死亡率達5% ～10%，移植物抗宿主?。╣raft versus host disease，GVHD）、不良免疫反應和醫(yī)療費用高等原因?qū)е略撝委煼椒ǖ木窒扌?，無法廣泛應用［5］。

在過去的幾十年里，人們一直在研究基因治療方法治愈單基因血液遺傳病。β-地貧是點突變引起的單基因遺傳病，其利用自體造血干細胞進行基因治療成為近些年的研究熱點。異體HSCT僅限于有人白細胞抗原（human leukocyte antigens，HLA）同源供體的患者，而使用自體造血干細胞進行基因治療能夠為異體HSCT 提供一種替代的治療方法［5］，不僅避免了GVHD，而且治療所需的調(diào)節(jié)方案中不需要免疫抑制藥物，使異體HSCT 受限的患者也可以進行轉(zhuǎn)基因細胞的輸注，這明顯擴大了治療的適用范圍。

1 β-地貧的發(fā)病機制及臨床表現(xiàn)

β-地貧的發(fā)生是由于位于11 號染色體短臂第1 區(qū)第5 號帶第5 亞帶（11p15.5）的β-珠蛋白基因突變和∕或缺失，β-珠蛋白肽鏈的生物合成減少（β+-地貧）或完全被抑制（β0-地貧），使構(gòu)成血紅蛋白的α-珠蛋白肽鏈和β-珠蛋白肽鏈間的平衡被破壞，導致正常血紅蛋白合成減少或者無法合成，病情遷延導致慢性貧血。與此同時，α-珠蛋白肽鏈相對增多，未結(jié)合的α-珠蛋白肽鏈極難溶解，相互集聚形成不穩(wěn)定產(chǎn)物，該產(chǎn)物損害和破壞紅細胞前體導致無效紅細胞生成，在子代細胞中沉淀導致紅細胞溶血，最終患者在臨床上表現(xiàn)出不同程度的貧血。在造血組織中遲發(fā)和死亡的紅細胞前體的大量擴張會導致骨缺損、肝脾腫大和鐵超載。而慢性貧血會導致組織氧合不良和EPO 升高；無效紅細胞生成和慢性溶血又會使患者血液處于高凝狀態(tài)，增加血栓風險。無效紅細胞生成和慢性組織缺氧也會抑制鐵調(diào)素（鐵的負性調(diào)節(jié)激素，減少機體鐵的吸收）的合成和分泌，使循環(huán)中鐵調(diào)素降低，引起一系列反應導致全身鐵代謝異常。針對無效紅細胞生成及鐵失調(diào)，目前有多項研究獲得了積極性成果［5-6］。

根據(jù)現(xiàn)有數(shù)據(jù)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了超過200 個導致β-地貧的基因突變［7］，不同的基因缺陷組成不同的表型，而擁有同樣表型的個體也會表現(xiàn)出不同的臨床癥狀，后者可能由于表觀遺傳因素影響所致。臨床上根據(jù)其嚴重程度不同將β-地貧分為輕型、中間型和重型［3］。如今，根據(jù)患者輸血需求，又分為輸血依賴性地貧（transfusion-dependent thalassemia，TDT）和非輸血依賴性地貧（non-transfusion-dependent thalassemia，NTDT）。TDT 與NTDT這種分類僅代表患者被當下診斷時的一個臨床水平，其可以根據(jù)患者是否積極治療的情況而發(fā)生臨床轉(zhuǎn)換，故同一患者的輸血要求應間隔的進行重新評估［5］。

后來發(fā)現(xiàn)，合并有α-地貧的β-地貧患者，由于緩和了α-珠蛋白肽鏈與β-珠蛋白肽鏈之間的不平衡狀態(tài)，臨床癥狀減輕［8］。更加值得注意的是，伴有遺傳性胎兒血紅蛋白持續(xù)狀態(tài)（hereditary persistence of fetal hemoglobin，HPFH）的β-地貧或鐮狀細胞?。╯ickle cell disease，SCD）突變的個體，由于胎兒血紅蛋白（HbF）彌補了成人血紅蛋白（HbA）的不足，在某些情況下患者完全無臨床表現(xiàn)［9］。這些臨床觀察表明，利用其作為一種治療疾病的手段，誘導重型β-地貧患者產(chǎn)生HbF、減少α-珠蛋白基因的產(chǎn)生均能起到治療作用。

2 治療進展

2.1 輸血、鐵螯合和脾切除重型β-地貧（屬于TDT）在出生后不久就會表現(xiàn)出嚴重的貧血癥狀，除自身無法合成血紅蛋白外，還會形成包涵體進一步產(chǎn)生其他并發(fā)癥，故這類患者需要終身規(guī)律輸血治療以維持患兒正常身體發(fā)育所需，以及控制潛在的病理生理機制。中間型β-地貧（屬于NTDT）主要表現(xiàn)為輕至中度的貧血，患者自身能夠合成部分血紅蛋白，故這類患者只需偶爾在特定時期內(nèi)（如手術(shù)、懷孕和感染）進行輸血，以提高血紅蛋白濃度。輕型β-地貧由于臨床癥狀不明顯或者幾乎無臨床癥狀而無需輸血治療［3］。

但由輸血導致的血源性感染、同種異體免疫反應，尤其是全身多個器官的鐵超載問題，會使患者又產(chǎn)生一系列與鐵代謝相關(guān)的并發(fā)癥，患者要進行鐵螯合至關(guān)重要。而β-地貧患者本身表現(xiàn)出的無效紅細胞生成以及由此導致的紅細胞運輸氧的能力下降而形成的組織缺氧，影響鐵調(diào)素的合成和分泌，使機體發(fā)生鐵過載，若不及時除鐵，會導致心肌病、肝纖維化或肝硬化、內(nèi)分泌疾病等并發(fā)癥［1，5］。根據(jù)國際地貧聯(lián)盟指南，對于TDT 患者，當血清鐵蛋白超過1 000 μg∕L 時，就要進行鐵螯合治療。而對于NTDT 患者，血清鐵蛋白超過800 μg∕L，就要進行鐵螯合治療。目前常用的鐵螯合藥物為去鐵胺、去鐵酮、地拉羅司［1］。

大量無效紅細胞的生成會使得脾臟對其破壞增加，導致脾腫大、脾亢，故合并癥狀性脾腫大、脾亢者可進行脾切除。對于不能接受輸血和鐵螯合治療的患者，也可進行脾切除治療［1］。脾切除的主要目的是為了降低血液消耗、輸血需求，最終減少鐵負荷。由于目前輸血方案的日趨完善，對于TDT 患者來說，脾切除已經(jīng)過時。除此之外，脾臟本身對機體中的有毒鐵有一定的清除作用，并能清除異常的血小板和紅細胞。一旦切除，隨著時間推移會出現(xiàn)血栓形成、鐵超載及嚴重的術(shù)后感染（如腦膜炎和敗血癥）等并發(fā)癥。尤其是5 歲以下的兒童，脾切除年齡與術(shù)后感染的風險呈負相關(guān)［3，5］。

2.2 異體造血干細胞移植HSCT自80年代開創(chuàng)至今，已成為治愈重型地貧患者的一種重要手段［10］。歐洲血液和骨髓移植學會研究報道了2000 至2010年間進行HLA 匹配同胞供體移植的治療情況，移植年齡≤18 歲的患者總生存率達（91±1）%、無事件生存率達（83 ± 1）%；與終生輸血、鐵螯合和并發(fā)癥處理相比，HSCT 改善了重癥患兒的生活質(zhì)量［10］。盡管有數(shù)據(jù)支持HSCT 在HLA 匹配情況下更為理想，但是，找到組織相容性供體的可能性小于50%［11］。對于沒有HLA 匹配同胞或者不相關(guān)供體的患者，可以選擇HLA 不匹配的相關(guān)供體、HLA不匹配的不相關(guān)供體或者不相關(guān)臍帶血進行移植［11］。但是該報告沒有研究替代供體移植的結(jié)果。來自國際血液和骨髓移植研究中心的數(shù)據(jù)研究顯示，與HLA 匹配的相關(guān)或不相關(guān)供體相比，HLA 不匹配的相關(guān)供體的無事件存活率及總存活率較低，患者5年無事件存活率在年齡≤6 歲組為86%，7 ～15 歲組為80%，16 ～25 歲組為63%。因此在疾病早期就開始同時尋找與HLA 匹配的相關(guān)和不相關(guān)供體，如果沒有HLA 匹配同胞，則可以選擇HLA 匹配的不相關(guān)供體進行移植［12］。

在歷史上，骨髓是HSCT 的唯一來源。但在過去的20年里發(fā)生了轉(zhuǎn)變，外周血干細胞正在逐漸取代骨髓干細胞成為HSCT 的主要異體來源。研究發(fā)現(xiàn)與骨髓來源相比，使用外周血來源的干細胞在生存率及GVHD 方面沒有顯著差異，且后者移植速度更快，排斥反應率更低，這也得益于調(diào)節(jié)方案的支持［13］。還有研究利用外周血、骨髓或臍帶血無關(guān)供體移植，調(diào)節(jié)清髓方案以降低移植物的毒性作用，顯著增加總體生存率［14-15］。

2.3 抑制無效紅細胞生成紅細胞生成是受細胞外和細胞內(nèi)因子的復雜網(wǎng)絡管制的。EPO 具有促進各類紅系祖細胞和前體從早期的紅系祖細胞晚期向早幼紅階段的存活和增殖。JAK2 是一種胞質(zhì)酪氨酸激酶，可介導EPO 受體信號。EPO 與其受體的結(jié)合導致JAK2 的磷酸化，并激活對紅細胞生成至關(guān)重要的通路［16］。應用JAK2 抑制劑（Ruxolitinib）在定期輸血的地貧患者中進行其有效性和安全性的第2a 期實驗表明，其可防止地貧紅系細胞增殖和減少脾腫大，認為其在治療地貧癥狀方面是有益的［17］。

Mini-hepcidin 和跨膜蛋白絲氨酸6（transmembrane protein serine 6，TMPRSS6）抑制劑，其Minihepcidin 能夠模擬內(nèi)源性鐵調(diào)素的功能，TMPRSS6可減少鐵調(diào)素的表達，故減少TMPRSS6 的表達即可促進內(nèi)源性鐵調(diào)素的產(chǎn)生。在小鼠模型中，服用Mini-hepcidin 或者抑制TMPRSS6 可顯著改善無效紅細胞生成、貧血和鐵超載［18-19］。針對TMPRSS6 的反義寡核苷酸或小干擾RNA 的使用已被證明可以改善小鼠貧血、鐵超載及其他β-地貧的臨床前模型［20］。

生長分化因子11（growth differentiation factor 11，GDF11）通過轉(zhuǎn)化生長因子β-受體負調(diào)節(jié)紅細胞生成，并被活化素受體-II 配體陷阱（包括Sotatercept 和Luspatercept）阻斷。有臨床實驗利用Sotatercept 和修飾后的Luspatercept 來阻斷GDF11的活性刺激晚期紅細胞的產(chǎn)生。關(guān)于Sotatercept第2a 階段的用于確定其安全性和耐受性的劑量研究，有16 例TDT 和30 例NTDT 患者登記進行實驗測試［21］。以及Luspatercept 第2 階段的臨床實驗正在進行中，此次有64 名志愿者（31 例TDT 和33 例NTDT），其目的是確定其是否可以改善β-地貧患者的貧血和并發(fā)癥，目前結(jié)果令人鼓舞［22］?，F(xiàn)Luspatercept 在19 個國家進行第3 階段的研究，該實驗利用Luspatercept 與安慰劑對照，在都加上最佳支持治療同時研究其在成人患者中的安全性和有效性，發(fā)現(xiàn)使用Luspatercept 的效果明顯高于安慰劑組，患者表現(xiàn)為輸血負擔減輕，整個實驗過程幾乎無不良事件［23］。

2.4 基因治療

2.4.1 慢病毒載體慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒的一個屬，具有逆轉(zhuǎn)錄和整合功能?，F(xiàn)實驗室和臨床研究的慢病毒載體（lentiviral vector，LV）以HIV-1來源為主。LV 能夠更有效的轉(zhuǎn)導非增殖或者緩慢增殖的細胞，縮短培養(yǎng)時間而保證轉(zhuǎn)導過程中造血干細胞的活力，而反轉(zhuǎn)錄病毒載體不能感染非增殖的細胞；且第三代自滅活LV 增加了整合的安全性，成為了現(xiàn)在最有效的載體工具［24］。

首個利用LV 治療地貧的實驗是由MAY 等［25］完成的，其將人β-珠蛋白基因準確、有效地整合到宿主DNA 中高效表達，并合成正常的血紅蛋白。正是基于HIV-1 衍生的LV 的開發(fā)，LCR HS 促進β-樣珠蛋白表達的發(fā)現(xiàn)。后來的多個實驗室證明，在β-珠蛋白啟動子和LCR 元件的控制下，攜帶人β-或γ-珠蛋白基因的LV 能夠挽救小鼠和人β-地貧及SCD 表型，使利用LV 挽救β-血紅蛋白病成為一種現(xiàn)實［26］。

在基因治療發(fā)展的這幾十年中，慢病毒系統(tǒng)結(jié)構(gòu)在不斷的優(yōu)化。在第一階段1∕2 臨床實驗中（LG001 于2006年在法國啟動），MARINA 等［26］測試了HPV569 LV，該載體攜帶一個最小的β-珠蛋白啟動子以及來自LCR 的HS2、HS3 和HS4 元素。將雞β-珠蛋白HS4（cHS4）核染色質(zhì)絕緣體的兩個拷貝插入病毒LTR 中，但最終結(jié)果為載體滴度低、轉(zhuǎn)導效率低、載體重排列且絕緣子元件丟失。基于這些原因，后來又經(jīng)過基因整合設(shè)計了一個新載體（BB305），BB305 與HPV569 完全相同，只是缺少了cHS4 絕緣體。載體并進一步優(yōu)化，包括用CMV 啟動子替換50 個LTR 啟動子，以驅(qū)動病毒RNA 生產(chǎn)，來提高載體效價，提高轉(zhuǎn)導效率。2018年，THOMPSON 等［7］利用編碼HbAT87Q 的BB305載體治療（HGB-204 和HGB-205）22 例TDT 患者，其輸血量明顯降低，有3 例患者完全擺脫輸血，均未發(fā)生藥品相關(guān)的嚴重不良事件。第三階段實驗（HGB-207）評估LentiGlobin BB305 在輸血依賴性地貧受試者中的有效性和安全性，目前正在進行中（https：∕∕www.clinicaltrials.gov∕ct2∕show∕record∕NCT 02906202）。

2.4.2 CRISPR/Cas9 技術(shù)成簇規(guī)律間隔短回文重復序列及CRISPR 相關(guān)蛋白（CRISPR∕Cas）［27］是該領(lǐng)域的最新參與者，因其簡單、高效和多功能性而被認為是靶向和修飾基因組DNA 最有效和最先進的工具。

CRISPR∕Cas 系統(tǒng)［27］有三種類型，其中Ⅰ型和Ⅲ型系統(tǒng)由專門的核酸內(nèi)切酶加工CRISPR-RNA（crRNA）前體（pre-crRNA）并使之成熟，每一個成熟的crRNA 會組裝成一個大型的多Cas 蛋白復合物，能夠識別和切割與crRNA 互補的核酸。而在Ⅱ型CRISPR∕Cas9 系統(tǒng)中，當外源的DNA 進入細胞時，就會引起細菌的RNaseⅢ即催化pre-crRNA的成熟，成熟的crRNA 只有與tracrRNA 配對后形成雙鏈RNA，才能指導Cas9 在crRNA 引導序列靶標的特定位點剪切雙鏈DNA。Cas9 是一種通用的核酸內(nèi)切酶，含有HNH 和RuvC 兩個核酸酶結(jié)構(gòu)域，前者剪切互補鏈，后者剪切非互補鏈。要實現(xiàn)Cas9 對目標序列的切割，其不僅要完成crRNA 與tracrRNA 堿基配對，還依賴于原型間隔區(qū)相鄰基序（protospacer adjacent motif，PAM）的存在。只要根據(jù)目標DNA 特異性重新設(shè)計sgRNA 序列，就可以將該技術(shù)應用于多種細胞類型的DNA 位點，最終改變基因的表達，從而CRISPR∕Cas9 技術(shù)是迄今為止最強大的基因編輯工具［28］。

有研究者利用CRISPR∕Cas9 技術(shù)直接修復突變的β-珠蛋白基因，恢復正常β-珠蛋白基因的表達［29-30］。研究發(fā)現(xiàn)，臨床上僅患HPFH 的患者沒有貧血癥狀，表明高水平的HbF 沒有不良后果，故利用CRISPR∕Cas9 技術(shù)模擬自然發(fā)生的HPFH 相關(guān)突變作為一種治療疾病的手段，如γ-珠蛋白啟動子區(qū)-198T＞C HPFH 突變可與紅系轉(zhuǎn)錄因子KLF1結(jié)合［31］、-113A＞G 為類紅細胞調(diào)節(jié)劑GATA1 創(chuàng)建了從頭結(jié)合位點［32］、-115 和-200 bp 處突變分別破壞γ-珠蛋白阻遏蛋白BCL11A 和ZBTB7A 的結(jié)合、刪除β-珠蛋白基因中的13kb，模仿西西里人的HPFH 基因型［33］、刪除包含δ-和β-珠蛋白基因以及BCL11A 結(jié)合位點在內(nèi)的13.6kb 基因組區(qū)，均能誘導重型β-地貧患者表達更多γ-珠蛋白，甚至由成人期的≤1%達到5%～20%的HbF 水平［31］。

靶向γ-β珠蛋白基因轉(zhuǎn)換的調(diào)節(jié)因子也可誘導HbF 的產(chǎn)生。實驗發(fā)現(xiàn)BCL11A 通過其C 端ZnF簇在體內(nèi)和體外以序列特異性方式結(jié)合γ-珠蛋白啟動子中的DNA 基序（TGACCA），利用CRISPR∕Cas9 技術(shù)在體外編輯TGACCA 可防止BCL11A 結(jié)合并重新激活γ-珠蛋白表達。刪除BCL11A 增強子內(nèi)小基因組（200 bp）可以激活成人向胎兒血紅蛋白的反向轉(zhuǎn)換和HbF 的合成［34］?！昂诵摹盌RED復合物（由TR2、TR4、DNMT1 和LSD1 組成）其特異性結(jié)合人胚胎ε-珠蛋白和胎兒γ-珠蛋白DR1 啟動子元件上，抑制γ-珠蛋白轉(zhuǎn)錄為成人紅細胞，實驗發(fā)現(xiàn)核受體輔阻遏物-1（NCoR1）和BRCA1相關(guān)蛋白1（BAP1）也是DRED 的重要組成部分，減少BAP1 表達明顯誘導γ-珠蛋白轉(zhuǎn)錄。目前用CRISPR∕Cas9 修飾BCL11A 基因紅系特異性增強子（CTX001）的早期臨床實驗正在進行安全性和有效性評估，及對受試者進行長期隨訪，其是首例重型β-地貧患者接受CTX001 實現(xiàn)治療目的，減少輸血 量 的 研究（https：∕∕www.clinicaltrials.gov∕ct2∕show∕NCT03655678；https：∕∕www.clinicaltrials.gov∕ct2∕show∕NCT04208529）。

在α-地貧患者中，單個α-珠蛋白基因缺失和2個α-珠蛋白基因缺失分別對應于mRNA水平和蛋白水平上α-珠蛋白輸出減少25%和50%，這些水平可以被認為是β-地貧合理的治療目標。但是其面臨2 個挑戰(zhàn)：第一，α-珠蛋白的損失不應該是完全的，任何超過75%的下降都將產(chǎn)生相反的效果，因失去大量α-珠蛋白鏈來產(chǎn)生血紅蛋白而導致貧血惡化。第二，β-珠蛋白的產(chǎn)生不應受到影響。利用CRISPR∕Cas9 基因組編輯在人類造血干∕祖細胞（CD34+）上模擬自然突變，刪除α-珠蛋白增強子MCS-R2 并造成α-地貧發(fā)現(xiàn)，患者α-珠蛋白減少且修正了珠蛋白的失衡，其實驗并不影響CD34+的分化。

3 總結(jié)

β-地貧是一個涉及全球的遺傳性疾病，盡管目前對地貧的宣傳普及和管理得到了很大的改善，但是仍然有很多患者是未被發(fā)現(xiàn)的，以及針對已經(jīng)診斷的患者的治療也是并未完全受益到每一位患者。為此，全球也在不斷探索研究更多新的方法能夠普及每一位患者，改善其生活質(zhì)量。目前在治療上面，輸血和鐵螯合治療對重型地貧患者來說仍是不可或缺的，而異體造血干細胞移植是根治地貧患者的唯一方法，利用自體造血干細胞進行基因治療后再重新輸回患者體內(nèi)發(fā)揮治療性作用，目前取得的鼓舞性成果為患者帶來了更多希望。