薛 聰，范 穎，張文鑫，孟 斌，郭繁霞，孫培明*

（1.臨沂大學(xué)農(nóng)林科學(xué)學(xué)院，山東 臨沂 276000；2.臨沂科技職業(yè)學(xué)院，山東 臨沂）

為了鑒定門診遇到的一起以呼吸困難為主要臨診癥狀，以肺臟、氣囊、腹膜等組織器官灰白色粟粒狀結(jié)節(jié)為主要病變的賽鴿是否感染了霉菌，采集病死鴿組織樣本進(jìn)行霉菌的分離培養(yǎng)、菌落形態(tài)觀察和染色鏡檢試驗(yàn)，從賽鴿組織樣本中分離鑒定到一株煙曲霉菌。煙曲霉菌在高鹽察氏瓊脂培養(yǎng)基上呈現(xiàn)煙綠色絨毛狀、棉絮樣絲狀菌落。光鏡觀察可見(jiàn)散在分布的霉菌菌體，每個(gè)菌體由分生孢子梗、分生孢子頭組成；分生孢子梗光滑，呈微綠色；分生孢子頭又包含燒瓶狀頂囊、單層輻射狀小梗和綠色的球形分生孢子。

鴿曲霉菌病又稱鴿曲霉菌性肺炎，是一種真菌性傳染病。曲霉菌病主要是由煙曲霉菌和黃曲霉菌這兩種病原體引起[1]。鴿曲霉菌性肺炎主要侵犯鴿的呼吸器官導(dǎo)致呼吸障礙，偶爾也侵害眼、肝及腦等組織，典型病變?yōu)榉尾坑悬S白色或灰白色的霉菌結(jié)節(jié)。一般可通過(guò)肺部的典型剖檢變化對(duì)鴿曲霉菌病做初步診斷。但為了確診和明確具體病原仍需進(jìn)行曲霉菌的分離鑒定。

1 材料

1.1 樣本

山東省某賽鴿養(yǎng)殖場(chǎng)飼養(yǎng)賽鴿約3 000 羽，2020 年6 月鴿群陸續(xù)發(fā)病，主要以2 月齡的青年鴿為主，發(fā)病率約為5 %。病鴿初期表現(xiàn)為精神沉郁、食欲不振、反應(yīng)遲鈍、羽毛蓬亂。隨著病程發(fā)展，病鴿表現(xiàn)出呼吸困難、張口呼吸有“呼呼”的喘息聲。部分病鴿出現(xiàn)下痢，排黃白色或綠色稀便。少數(shù)賽鴿眼睛一側(cè)或兩側(cè)灰白色渾濁，流漿液性淚液，下眼瞼有干酪樣凝塊。有的病鴿出現(xiàn)頭頸扭曲、共濟(jì)失調(diào)等神經(jīng)癥狀。嚴(yán)重的病鴿迅速消瘦，繼而死亡。發(fā)病期間使用了恩諾沙星等抗菌藥物，但效果較差，發(fā)病數(shù)量呈上升趨勢(shì)。之后使用制霉菌素等抗霉菌藥物，配合使用抗菌藥物，病情逐步得到控制。

1.2 主要試劑 高鹽察氏瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)HB0234）、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)HB0109）、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（批號(hào)HB0108）均購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。苯酚、乳酸、甘油等化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.3 主要儀器 恒溫培養(yǎng)箱（型號(hào)為 DHP-9082B），購(gòu)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；超凈工作臺(tái)（型號(hào)為SW-CJ-2D），購(gòu)自江蘇蘇凈集團(tuán)有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋（型號(hào)為YXQ-LS-100A），購(gòu)自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；顯微鏡（型號(hào)為CX33），購(gòu)自?shī)W林巴斯有限公司；載玻片、蓋玻片均購(gòu)自江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材公司。

2 方法

2.1 病理檢查 剖檢病死賽鴿共10 羽，對(duì)各組織器官的病理變化進(jìn)行觀察、記錄并拍照。無(wú)菌采集肺臟、肝臟、霉菌結(jié)節(jié)用于后續(xù)分離培養(yǎng)。

2.2 霉菌的分離培養(yǎng) 按常規(guī)方法取組織樣本在制備好的高鹽察氏培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線分離培養(yǎng)。隨后將培養(yǎng)皿倒置在恒溫箱里培養(yǎng)，溫度設(shè)置為28 °C。觀察并記錄霉菌菌落形態(tài)、顏色、質(zhì)地等。挑取霉菌菌絲接種于新的高鹽察氏瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行純培養(yǎng)。

2.3 霉菌的染色鏡檢 待霉菌菌落的生長(zhǎng)形態(tài)穩(wěn)定時(shí)，用接種環(huán)無(wú)菌挑取菌落中心或邊緣部位少量菌絲，置于滴有乳酸苯酚溶液的載玻片上并混勻，加蓋玻片后在顯微鏡下觀察并記錄霉菌顯微觀察結(jié)果。

2.4 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 無(wú)菌采集病死鴿的肺臟、肝臟組織，常規(guī)方法劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基，置于37 ℃ 恒溫箱培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。

3 結(jié)果與分析

3.1 病理變化 對(duì)病死鴿進(jìn)行剖檢，主要病理變化為肺臟表面和內(nèi)部有灰白色、黃白色的霉菌結(jié)節(jié)，有的結(jié)節(jié)相互融合成大的團(tuán)塊。肺組織質(zhì)地較硬、彈性消失，切開(kāi)時(shí)內(nèi)容物呈現(xiàn)干酪樣、輪層狀結(jié)構(gòu)。另外在氣囊、腹膜、腸道漿膜等組織器官同樣可見(jiàn)針尖至米?；蚨沽４笮〉拿咕Y(jié)節(jié)。

3.2 霉菌的分離培養(yǎng) （1）高鹽察氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h，肉眼觀察可見(jiàn)針尖大小的白色絨毛樣菌落。培養(yǎng)72 h，菌落形態(tài)特征較為明顯，肉眼能明顯觀察到絨毛狀、棉絮樣絲狀菌落，表面呈煙綠色、粉末狀。培養(yǎng)96 h，觀察到菌落面積變大，邊緣均勻、平滑，質(zhì)地呈絲絨狀或發(fā)絮狀的暗綠色菌落，菌落反面呈黃綠色，初步判定為煙曲霉菌。（2）在潔凈載玻片上滴加一滴乳酸苯酚溶液，挑取少量菌絲并與之混勻，置100 倍光學(xué)顯微鏡下觀察可見(jiàn)散在分布的霉菌菌體，每個(gè)菌體由分生孢子梗和分生孢子頭組成。進(jìn)一步通過(guò)400 倍鏡檢觀察，分生孢子梗光滑，呈微綠色。在分生孢子梗莖的頂端具有膨大的分生孢子頭，分生孢子頭包含狀如燒瓶的綠色頂囊、單層輻射狀小梗和球形分生孢子，頂囊與分生孢梗莖存在一定角度。分生孢子同樣為綠色，呈圓形或卵圓形。

3.3 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 37 ℃ 恒溫箱培養(yǎng)24 h，肺臟、肝臟組織劃線接種的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基，均未觀察到細(xì)菌菌落生長(zhǎng)。

4 討論

4.1 鴿曲霉菌病的流行現(xiàn)狀 （1）禽曲霉菌病是雞、鴨、鵝、鴿子等的一種真菌性疾病，主要特征為霉菌性肺炎，往往呈急性群發(fā)性暴發(fā)，發(fā)病率、死亡率較高[2]。本病主要發(fā)生于幼禽，成年禽具有一定抵抗力，近年來(lái)中禽與成禽發(fā)病有增加的趨勢(shì)。2018 年6 月，新疆某雞場(chǎng)的30 日齡麻花雞發(fā)生霉菌性肺炎，病雞張口呼吸并有呼吸“哨音”，剖檢可見(jiàn)肺臟有灰白色粟粒狀結(jié)節(jié)病變，支氣管有黃白色干酪樣物質(zhì)堵塞[3]。2014 年3 月，山東省臨沂市某養(yǎng)殖場(chǎng)的15 日齡肉鴨發(fā)生以呼吸道癥狀為主要特征的煙曲霉菌病[4]，發(fā)病率超過(guò)50 %，死亡率約為15 %，剖檢可見(jiàn)肺臟和氣囊有黃白色或灰白色結(jié)節(jié)。2019 年6 月，河北省某賽鴿養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生曲霉菌病，以3 月齡的青年鴿為主，主要表現(xiàn)為氣喘等呼吸道癥狀，氣囊、肺臟可見(jiàn)霉菌結(jié)節(jié)[5]。本文報(bào)道的賽鴿病例都同樣主要表現(xiàn)為呼吸道癥狀，另外有少數(shù)病鴿出現(xiàn)頭頸扭曲、共濟(jì)失調(diào)等神經(jīng)癥狀。（2）霉菌感染不僅會(huì)在感染部位造成局部損傷，還會(huì)通過(guò)產(chǎn)生毒力較強(qiáng)的霉菌毒素繼而造成多組織器官損傷。煙曲霉是曲霉菌屬致病性最強(qiáng)的霉菌，除了直接損傷和毒素危害，還能導(dǎo)致感染禽免疫抑制、免疫器官萎縮、免疫機(jī)能下降，這不僅影響疫苗免疫效果，也容易繼發(fā)感染大腸桿菌等病原微生物[6]。尤其是賽鴿，一旦發(fā)生曲霉菌病，即使經(jīng)過(guò)治療恢復(fù)健康，也常常會(huì)因?yàn)楸荣惓煽?jī)不佳而被淘汰，從而造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

4.2 鴿曲霉菌病的診斷與治療 （1）在生產(chǎn)實(shí)踐中，通常根據(jù)肺臟、氣囊等臟器的剖檢變化即可診斷為禽曲霉菌病。但由于禽曲霉菌病實(shí)質(zhì)上是一類病，其病原又分為多種曲霉菌，為了確診和分析病因仍需進(jìn)行曲霉菌的分離培養(yǎng)與鑒定。臨床上引起禽霉菌病的主要病原體為煙曲霉菌，黃曲霉菌較少見(jiàn)，偶爾也可從病料中分離出青霉菌、土霉菌、木霉菌、毛霉菌、米根霉菌等[7]。蘇戰(zhàn)強(qiáng)等人于2018 年從新疆雞場(chǎng)的霉菌性肺炎樣本內(nèi)分離到煙曲霉、黃曲霉、米根霉，并且煙曲霉的菌落數(shù)量明顯多于黃曲霉和米根霉[3]。而在本研究中，從賽鴿中同樣分離、鑒定到煙曲霉菌，通過(guò)菌落形態(tài)、鏡檢觀察，結(jié)合臨床癥狀和病理變化，最終確診為賽鴿煙曲霉菌病。（2）煙曲霉菌廣泛分布于自然界，產(chǎn)生孢子的能力強(qiáng)，常存在于霉變飼料、禽舍地面、用具和環(huán)境中。Sehar 等研究表明：鴿子密集區(qū)的土壤和空氣中含有煙曲霉等真菌的孢子[8]。Julman 等對(duì)鴿子飼養(yǎng)場(chǎng)中的土壤進(jìn)行真菌篩查，結(jié)果從含有大量鴿子排泄物的土壤中分離得到了多種致病真菌，其中煙曲霉菌所占比例最高，占比為31.1 %[9]。防控本病首先應(yīng)禁止飼喂發(fā)霉變質(zhì)的飼料，杜絕病從口入。其次，搞好環(huán)境衛(wèi)生和消毒工作。徹底清理鴿舍，用火堿、過(guò)氧乙酸等消毒劑對(duì)地面和墻面進(jìn)行消毒，并保持飼養(yǎng)場(chǎng)、飼料倉(cāng)庫(kù)的干燥衛(wèi)生。另外，注意合理的鴿群飼養(yǎng)密度，避免應(yīng)激。在免疫接種、驅(qū)蟲(chóng)、訓(xùn)飛以及比賽時(shí)，在飼料中適當(dāng)增加維生素、微量元素以提高賽鴿自身的抵抗力。（3）病死鴿及時(shí)進(jìn)行淘汰和無(wú)害化處理，癥狀較輕者應(yīng)盡快使用制霉菌素、碘化鉀、硫酸銅等抗霉菌藥物。配合使用抗生素防止繼發(fā)感染，同時(shí)在飲水中添加葡萄糖、電解多維等營(yíng)養(yǎng)藥增強(qiáng)抵抗力，一般會(huì)取得較好的效果。另外，值得注意的是煙曲霉也可以感染哺乳動(dòng)物和人。2019 年，于寧等報(bào)道了一例飼?shū)澱咔忠u性肺曲霉菌感染的病例[10]。2020 年陳肖等報(bào)道了一例流感病毒性肺炎合并煙曲霉感染病例[11]，提示飼?shū)澱吲c煙曲霉菌感染的關(guān)聯(lián)性，以及煙曲霉對(duì)人的危害，應(yīng)該引起足夠重視。