李 娜 周紅麗 張 兵 周 濤 任劍豪 宗 平 吳衛(wèi)國(guó)

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院1，長(zhǎng)沙 410128)(中南糧油食品科學(xué)研究院有限公司2，長(zhǎng)沙 410008)

稻谷是我國(guó)主要的糧食作物之一，全國(guó)各地都有稻谷的種植產(chǎn)區(qū)，年總產(chǎn)量逾2億t[1]。稻谷的儲(chǔ)藏期一般為3年。儲(chǔ)藏過(guò)程中，微生物在適宜的環(huán)境條件下滋生，容易引起儲(chǔ)藏稻谷發(fā)霉、腐爛和變色，直接或間接地影響儲(chǔ)藏稻谷的質(zhì)量[2]。尤其是在高水分稻谷中，霉菌生長(zhǎng)快速，導(dǎo)致稻谷迅速劣變[3]，一些不明顯的霉菌毒素危害甚至可影響動(dòng)物生殖系統(tǒng)[4-6]。

稻谷在儲(chǔ)藏過(guò)程中，其品質(zhì)主要受到溫度和水分的影響，儲(chǔ)糧溫度越高、水分含量越高，稻谷霉菌量越大，而水分含量又是真菌生長(zhǎng)的決定性因素，當(dāng)水分含量在霉菌生長(zhǎng)臨界水分以下，即使溫度適宜，霉菌也不會(huì)生長(zhǎng)[7]。何榮等[8]研究發(fā)現(xiàn)，黑曲霉(Aspergillusniger)、黃曲霉(Aspergillusflavus)以及產(chǎn)黃青霉(Penicilliumchrysogenum)最易導(dǎo)致稻谷結(jié)塊，此外結(jié)塊稻谷的出糙率、整精米粒率較低，并且不完善粒率明顯增加。儲(chǔ)藏期間，儲(chǔ)糧上帶有的霉菌種類較多，主要是曲霉屬和青霉屬[9]，有研究發(fā)現(xiàn)稻谷中主要優(yōu)勢(shì)霉菌為黃曲霉、灰綠曲霉、白曲霉和黑曲霉，其中黃曲霉、黑曲霉大多分布于糧倉(cāng)上層，白曲霉在下層分布較多，灰綠曲霉則普遍分布于糧倉(cāng)各層各方位[7]。現(xiàn)階段仍舊主要依據(jù)霉菌的菌落情況和顯微結(jié)構(gòu)特征[10,11]，參考菌落、菌絲和孢子的形態(tài)觀察對(duì)霉菌進(jìn)行鑒定[12]。在此研究背景下，通過(guò)對(duì)主要霉菌純化培養(yǎng)，利用分子生物學(xué)方法對(duì)優(yōu)勢(shì)菌種進(jìn)行鑒定，并研究了霉菌對(duì)稻谷品質(zhì)的影響，為稻谷安全儲(chǔ)藏與防控提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

早秈稻：湖南省常德市金牛糧倉(cāng)7P5倉(cāng)，入庫(kù)年份為2018年。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)、無(wú)水乙醇(分析純)、氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液(0.500 0 mol/L)、酚酞指示劑、氯化鈉(分析純)、美蘭染色液、TSINGKE DNA凝膠回收試劑盒(Code No.GE0101)、rTaq酶(Taq DNA聚合酶)、PCR Mix、測(cè)序試劑ABI-bigdye。

1.2 主要儀器設(shè)備

SW-CJ-1D超凈工作臺(tái)，MJ-150-11霉菌培養(yǎng)箱，LDZX-50KBS立式高壓蒸汽滅菌器，JLGJ45檢測(cè)礱谷機(jī)，JFSD-100-Ⅱ電動(dòng)粉碎機(jī)，202電熱恒溫干燥箱，HY-4調(diào)速多用振蕩器，3730XL測(cè)序儀(ABI,Foster,CA,USA)，SMA4000微量分光光度計(jì)，DYY-6C電泳儀，PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀，F(xiàn)R980凝膠成像分析系統(tǒng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 稻谷樣品采集

2019年9月6日進(jìn)行第一次取樣，此后每?jī)蓚€(gè)月取樣一次，共取樣3次。采用五點(diǎn)三層取樣，分別以距糧堆表面2.4、3.6、4.8 m為上層、中層、下層。以距糧倉(cāng)東南角、東北角、西南角、西北角1.5 m處及糧倉(cāng)中央點(diǎn)作為取樣點(diǎn)，每一個(gè)點(diǎn)位取上、中、下三層的稻谷，共取15份樣品，每份樣品取1 kg，用無(wú)菌取樣袋密封取回，于實(shí)驗(yàn)室中低溫避光保存。對(duì)每一層的取樣點(diǎn)、及整個(gè)糧倉(cāng)的取樣點(diǎn)所取樣品，各稱取100 g于無(wú)菌均質(zhì)袋中，分別用于每一層的混樣和糧倉(cāng)總混樣的檢測(cè)[13]，取樣點(diǎn)位如圖1所示。

圖1 稻谷取樣點(diǎn)位圖

1.3.2 霉菌菌種鑒定

1.3.2.1 霉菌菌種初步鑒定

將霉菌接種在PDA培養(yǎng)基中，放置在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，并用劃線法對(duì)霉菌進(jìn)行分離純化，得到的霉菌，根據(jù)菌落的培養(yǎng)特性和顯微特征對(duì)菌種進(jìn)行初步鑒定；霉菌培養(yǎng)特性的觀察：根據(jù)霉菌的生長(zhǎng)速度、培養(yǎng)時(shí)間，以及其菌落顏色、氣味、形態(tài)等，對(duì)其進(jìn)行初步判斷。

霉菌顯微特征鑒定：挑取菌落邊緣的氣生菌絲，制片。將其置入顯微鏡下，觀察其是有性或是無(wú)性繁殖、營(yíng)養(yǎng)菌絲的情況以及形態(tài)和大小，著重觀察其菌絲形態(tài)及其分生孢子頭的形態(tài)，根據(jù)霉菌的顯微特征對(duì)其進(jìn)行初步鑒定[10]。

1.3.2.2 霉菌菌種鑒定

模板處理：挑取菌體變性處理后，離心取上清為模板，選擇相應(yīng)引物擴(kuò)增測(cè)序驗(yàn)證。

PCR擴(kuò)增回收：利用引物ITS1/ITS4進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，引物序列：

ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3' ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' 擴(kuò)增體系與程序見(jiàn)表1和表2。

表1 PCR反應(yīng)體系

表2 PCR反應(yīng)程序

使用TSINGKE DNA凝膠回收試劑盒(Code No.GE0101)切膠回收目的片段以相應(yīng)引物測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，從中選取同源性高的菌株，再使用MEGA7.0軟件，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.3.3 稻谷品質(zhì)檢測(cè)指標(biāo)及其測(cè)定方法

霉菌量測(cè)定參照GB 4789.15—2016[14]；稻谷出糙率的測(cè)定參照GB/T 5495—2008《糧油檢驗(yàn) 稻谷出糙率檢驗(yàn)》[15]；脂肪酸值的測(cè)定參照GB/T 20569—2006《稻谷儲(chǔ)存品質(zhì)判定規(guī)則》[16]；整精米率檢驗(yàn)參照GB/T 21719—2008《稻谷整精米率檢驗(yàn)法》[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 稻谷中霉菌的鑒定

2.1.1 霉菌的篩選

對(duì)湖南常德儲(chǔ)糧糧倉(cāng)中的稻谷進(jìn)行定點(diǎn)定時(shí)取樣，經(jīng)過(guò)三次取樣對(duì)比，選取了菌落狀態(tài)、顏色等不同的13種霉菌，暫標(biāo)記為A、B、C、D、F、I、J、K、L、M、O、P、Q，通過(guò)菌株分離及5次純化得到13種霉菌的純培養(yǎng)物，并于4 ℃環(huán)境保存。

2.1.2 霉菌的形態(tài)特征分析及菌種鑒定

經(jīng)過(guò)霉菌形態(tài)學(xué)對(duì)比和測(cè)序見(jiàn)表3、表4，可知A、B、C、D、F、I、J、K、L、M、O、P、Q菌株所對(duì)應(yīng)的霉菌分別為：RhizopodiformisisolateHX-1、AspergillusoryzaeisolateNL5、LichtheimiaramosastrainAUMC7961、AspergillusnigerisolateSZ8M-14、AspergillusfumigatusstrainJXL-108Y-1、AspergillusflavusisolateL-4932013、RhizomucorpusillusstrainCNM-CM5124、AspergilluscandidusstrainHDN15-152、PenicilliumcitrinumstrainNSF4、Aspergilluscristatus、PenicilliumislandicumculturecollectionMUCL14074、Aspergilluscristatusstrain33YH-WZ-18、RhizomucorpusillusstrainAUMC7966。

表3 霉菌的形態(tài)特征分析

表4 霉菌菌種鑒定

霉菌DNA提取及擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 瓊脂糖凝膠電泳

采用真菌通用引物分別對(duì)13種霉菌菌株高度保守序列區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，由圖2可看出，DNA條帶清晰、單一，說(shuō)明分離純化得到的是純培養(yǎng)物，不存在同源區(qū)結(jié)合位點(diǎn)，提取的DNA純度較高，最終DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后純度很高。在NCBI上對(duì)比后選擇同源性較高的菌株并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[28]。

2.2 霉菌對(duì)稻谷品質(zhì)的影響

2.2.1 不同層位稻谷霉菌及其品質(zhì)的變化

由圖3～圖7可知，同一糧倉(cāng)不同取樣糧層間稻谷的水分含量、霉菌量、出糙率、整精米率、及脂肪酸值均存在顯著性差異(P<0.05)。含水量、霉菌量、脂肪酸值隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，逐漸上升，均呈上層>中層>下層的趨勢(shì)，出糙率及整精米率則為下層>中層>上層，隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，逐漸下降。對(duì)比各糧層霉菌的變化量，可推測(cè)稻谷含水量增加，有利于稻谷霉菌的生長(zhǎng)。

注：不同字母表示同一糧倉(cāng)稻谷不同層位間差異顯著(P<0.05)。余同。

圖4 稻谷不同層位霉菌量變化規(guī)律

圖5 稻谷不同層位出糙率變化規(guī)律

圖6 稻谷不同層位整精米率變化規(guī)律

圖7 稻谷不同層位脂肪酸值變化規(guī)律

2.2.2 不同點(diǎn)位稻谷霉菌及其品質(zhì)的變化

由圖8～圖12可知，同一糧倉(cāng)不同取樣點(diǎn)位間稻谷的含水量、霉菌量、出糙率、整精米率、及脂肪酸值均存在顯著性差異(P<0.05)。由圖8可知，糧倉(cāng)4號(hào)和5號(hào)點(diǎn)位稻谷水分含量較高，且由圖9可知，稻谷的霉菌量隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)是不斷上升的，其中4號(hào)和5號(hào)點(diǎn)位稻谷霉菌量最多，也說(shuō)明了稻谷水分含量對(duì)稻谷霉菌量的積極影響。另每個(gè)點(diǎn)位數(shù)據(jù)均為將該點(diǎn)位三層稻谷的混合樣檢測(cè)所得。稻谷品質(zhì)的指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果如圖10～圖12所示，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，糧倉(cāng)5個(gè)點(diǎn)位的出糙率和整精米率均存在下降的趨勢(shì)，與霉菌量的變化趨勢(shì)相反，該結(jié)果表明稻谷在儲(chǔ)藏過(guò)程中品質(zhì)發(fā)生了一定的劣變，而霉菌的增長(zhǎng)則可能是導(dǎo)致稻谷品質(zhì)下降的主要因素；糧倉(cāng)5個(gè)取樣點(diǎn)位稻谷的脂肪酸值出現(xiàn)了逐漸上升的趨勢(shì)，變化趨勢(shì)與霉菌量的變化相同，其中4號(hào)、5號(hào)點(diǎn)位稻谷脂肪酸值上升幅度較大，對(duì)比其霉菌變化量，可推測(cè)，霉菌量的變化對(duì)脂肪酸值的影響較大，且脂肪酸值越高，稻谷品質(zhì)則越低[8]。

圖8 稻谷不同點(diǎn)位含水量變化規(guī)律

圖9 稻谷不同點(diǎn)位霉菌量變化規(guī)律

圖10 稻谷不同點(diǎn)位出糙率變化規(guī)律

圖11 稻谷不同點(diǎn)位整精米率變化規(guī)律

注：不同字母表示同一糧倉(cāng)稻谷不同點(diǎn)位間差異顯著(P<0.05)。

2.2.3 稻谷含水量、霉菌量、出糙率、整精米率、脂肪酸值的相關(guān)性分析

采用相關(guān)性分析法對(duì)稻谷含水量、霉菌量、出糙率、整精米率及脂肪酸值進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 稻谷含水量、霉菌量、出糙率、整精米率、脂肪酸值的相關(guān)性

由表5可知，第一次取樣稻谷，含水量與霉菌量、脂肪酸值，出糙率與整精米率均呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。水分含量、霉菌量與整精米率均呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。霉菌量與脂肪酸值呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；第二次取樣稻谷，含水量與霉菌量，出糙率與整精米率均呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。含水量、霉菌量與整精米率均呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。霉菌量與出糙率呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)；第三次取樣稻谷，含水量與霉菌量、脂肪酸值均呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。霉菌量與整精米率呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，與脂肪酸值呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。

結(jié)果表明稻谷出糙率、整精米率、脂肪酸值均受霉菌量與水分含量的影響，而稻谷水分含量對(duì)霉菌量也有一定的影響。稻谷整精米率及出出糙率高，表明其品質(zhì)相對(duì)較好,原因在于出糙率表示的是稻谷中可食用部分占稻谷籽?？傎|(zhì)量的比例，整精米率表示稻谷能夠加工出整粒大米產(chǎn)品占稻谷籽?？傎|(zhì)量的比例,我國(guó)現(xiàn)行GB 1350—2009《稻谷》和GB/T 17891—1999《優(yōu)質(zhì)稻谷》中，出糙率、整精米率均是品質(zhì)指標(biāo)[29]。而脂肪酸值則相反，稻谷的脂肪酸值表示其所含游離脂肪酸的多少，隨著稻谷儲(chǔ)存年限增長(zhǎng)，脂肪酸值呈上升趨勢(shì)，而稻谷新鮮程度與其游離脂肪酸的含量存在一定的關(guān)系[30]。稻谷脂肪酸值會(huì)隨著稻谷中霉菌量的增加而增加，稻谷出糙率與整精米率則會(huì)隨霉菌量的增加而降低，說(shuō)明稻谷霉菌對(duì)其品質(zhì)的劣變具有積極作用。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)分離純化得到的13種霉菌的形態(tài)特征分析及分子生物學(xué)鑒定，初步判定13種不同霉菌分別為：A:RhizopodiformisisolateHX-1、B:AspergillusoryzaeisolateNL5、C:LichtheimiaramosastrainAUMC7961、D:AspergillusnigerisolateSZ8M-14、F:AspergillusfumigatusstrainJXL-108Y-1、I:AspergillusflavusisolateL-4932013、J:RhizomucorpusillusstrainCNM-CM5124、K:AspergilluscandidusstrainHDN15-152、L:PenicilliumcitrinumstrainNSF4、M:Aspergilluscristatus、O:PenicilliumislandicumculturecollectionMUCL14074、P:Aspergilluscristatusstrain33YH-WZ-18、Q:RhizomucorpusillusstrainAUMC7966。其中B:AspergillusoryzaeisolateNL5與I:AspergillusflavusisolateL-4932013的菌落顏色、形態(tài)較為相似，肉眼觀察時(shí)，可根據(jù)菌落背面顏色區(qū)分，B:AspergillusoryzaeisolateNL5的菌落背面顏色為深黃色，I:Aspergillus flavus isolate L-4932013則為白色或米黃色。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著稻谷霉菌的增長(zhǎng)，稻谷的出糙率和整精米率均下降，與第一次取樣相比，最后一次取樣的5個(gè)點(diǎn)位稻谷出糙率分別下降了0.71%、1.69%、2.51%、2.94%、1.80%，整精米率分別下降了0.49%、6.13%、8.72%、7.56%、8.68%，脂肪酸值分別增加了7.44%、14.10%、0.13%、25.31%、22.19%；采用相關(guān)性分析法對(duì)不同糧倉(cāng)稻谷的水分含量、霉菌量、出糙率、整精米率及脂肪酸值進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)稻谷含水量、霉菌量與整精米率、出糙率均呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與脂肪酸值呈極顯著(P<0.01)和顯著正相關(guān)(P<0.05)，進(jìn)一步說(shuō)明稻谷水分含量和霉菌量對(duì)稻谷品質(zhì)的劣變具有一定的積極作用。