唐 瀅,雷 平*,張翠央,畢世宇,郭照輝,2,劉清術(shù),2

(1.湖南省微生物研究院,中國(guó)湖南 長(zhǎng)沙 410009;2.湖南省農(nóng)用微生物應(yīng)用工程技術(shù)研究中心,中國(guó)湖南 長(zhǎng)沙 410009)

植物病原真菌引起的土傳病害嚴(yán)重影響農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量和數(shù)量,若防治不當(dāng)將造成重大經(jīng)濟(jì)損失[1]。目前,化學(xué)農(nóng)藥仍是作物病害管理的主力軍。然而,化學(xué)殺菌劑的長(zhǎng)期使用會(huì)污染環(huán)境,引起病原菌耐藥,甚至?xí)?dǎo)致作物根際有益菌群的丟失。而且,病原真菌能以孢子形式在土壤中長(zhǎng)期存在,一次噴灑難以徹底清除。生防菌劑能在土壤中長(zhǎng)期存活,可通過(guò)分泌抑菌物質(zhì)等機(jī)制抑制病原菌生長(zhǎng),提高作物抗病能力,是綠色、環(huán)保的病害防治方法,能促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展,改善農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量。

植物根際中存在著一類能夠促進(jìn)植物根系生長(zhǎng)和礦物質(zhì)吸收、增強(qiáng)植物抗病性的細(xì)菌,即植物促生根際菌(plant growth promoting rhizobacteria,PGPR)[2]。芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)的許多PGPR已經(jīng)被開發(fā)為商業(yè)生防菌劑,如枯草芽孢桿菌(B.subtilis QST 713,Serenade?MAX)、利迪鏈霉菌(S.lydicus WYEC 108,Actinovate?AG)等[3]。通常,健康作物的根際是分離PGPR的重要來(lái)源。近年來(lái)研究表明,作物經(jīng)人工馴化種植后會(huì)丟失共生有益菌群[4]。例如:野生西紅柿連續(xù)種植7年后,會(huì)丟失一部分共生菌且對(duì)鐮刀菌和鏈格孢菌的易感性增強(qiáng),而施用野生西紅柿根際土壤后,其抗病能力得到恢復(fù)[5]。棉花、玉米等其他作物中也存在類似現(xiàn)象[6～7]。因此,在沒(méi)有作物管理的自然環(huán)境中生長(zhǎng)的野生植物是分離新PGPR的重要來(lái)源,但目前較少被關(guān)注。

伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)隸屬于變形菌門、β-變形菌綱,具有豐富的代謝多樣性及較強(qiáng)的適應(yīng)能力,在環(huán)境中分布廣泛,于1992年從假單胞菌屬獨(dú)立出來(lái),成為新屬。該屬第一個(gè)成員為石竹伯克氏菌,于1942年從康乃馨中分離得到,原名石竹單胞菌,后改為石竹假單胞菌。伯克霍爾德氏菌屬中的許多菌株通常在基因水平上有差異而表型沒(méi)有差異,因此該屬的新種鑒定工作非常復(fù)雜,難度大。研究人員將這些在基因序列上有差異而表型相似的菌株稱為基因組變異型(genomovar)[8]。因此,伯克霍爾德氏菌屬是一個(gè)異質(zhì)性復(fù)系群,其中的許多菌株在分類學(xué)上頗具爭(zhēng)議。隨著序列分析技術(shù)的發(fā)展,研究人員對(duì)該屬的多個(gè)種進(jìn)行了重新分類。具有固氮、降解能力且營(yíng)自由生活的一部分菌株(如B.xenovorans LB400)在2014年被移至Paraburkholderia屬;生活在真菌體內(nèi)且基因組非常小的菌株(如B.rhizoxinica)于2018年被移至Mycetohabitans屬。截至2020年7月,該屬已報(bào)道的菌株有143株,其中32株為正式有效發(fā)表的模式菌株[9]。許多伯克霍爾德氏菌都具有抑制植物病原菌生長(zhǎng)、促進(jìn)植物生長(zhǎng)、修復(fù)土壤等功能,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境保護(hù)方面起著重要作用。

本研究從野生植株根際土壤取樣,采用針對(duì)伯克霍爾德氏菌屬的選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行分離[10],經(jīng)多次純化后,獲得伯克霍爾德氏菌Z1,隨后探究了它對(duì)多種植物病原真菌的抑菌活性,初步分析了其分類地位及生理生化特征,并對(duì)其產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)進(jìn)行了深入探討。這些工作為靶向性篩選新PGPR開辟了新道路,而且所得菌株Z1具有的良好抑真菌活性也為將來(lái)開發(fā)新的生防菌劑奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

于2019年自湖南省長(zhǎng)沙縣青山鋪鎮(zhèn)山丘采集野生竹子根際土樣。供試植物病原菌包括:水稻紋枯病菌立枯絲核菌(Rhizoctonia solani Kuhn)、香梨腐爛病原菌迂回殼囊孢菌(Cytospora ambiens)、西瓜枯萎病原菌腐皮鐮刀菌(Fusariums solani)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichum capsici)和油菜核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum),其中,立枯絲核菌為湖南省植物保護(hù)研究所惠贈(zèng),其余均為本實(shí)驗(yàn)室保藏。菌株Z1已送至廣東省微生物菌種保藏中心保藏,編號(hào)為GDMCC 61058。

菌株分離純化所用培養(yǎng)基為針對(duì)伯克霍爾德氏菌屬的選擇性培養(yǎng)基,其配方由Haeckl等[10]在對(duì)多株伯克氏菌基因組序列進(jìn)行分析后設(shè)計(jì)而成。病原真菌的培養(yǎng)采用PDA(potato dextrose agar)培養(yǎng)基;液體發(fā)酵培養(yǎng)采用NBY(nutrient broth yeast extract)培養(yǎng)基[11];平板培養(yǎng)采用CYMG(casitone yeast extract magnesium chloride glycerol)培養(yǎng)基,其配方如下:酪蛋白胨8 g,酵母提取物4 g,二水氯化鎂4.06 g,50%甘油10 mL,瓊脂15 g,去離子水1 L。血平板及革蘭氏染色所用試劑盒均購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 根際細(xì)菌的分離純化

將5 g含有根系的根際土壤放入裝有45 mL無(wú)菌Ringer洗液(7.5 g/L NaCl,0.35 g/L KCl,0.21 g/L CaCl2)的搖瓶中[12],于30℃、180 r/min振蕩30 min。靜置后,上清用Ringer洗液依次稀釋至10-3、10-4、10-5,取200 μL涂布平板,每個(gè)梯度3個(gè)重復(fù)[13]。待出現(xiàn)菌落后,用接種針挑取邊緣光滑的單菌落進(jìn)行平板劃線分離。

1.3 菌株Z1抑制植物病原真菌活性的測(cè)定

采用對(duì)峙培養(yǎng)法[14]檢測(cè)篩選出來(lái)的細(xì)菌Z1的抑真菌活性。將在PDA平板上培養(yǎng)2～3 d的病原真菌用打孔器在菌絲生長(zhǎng)外緣打若干孔,用接種針將菌絲塊取出,放置在一個(gè)新的PDA平板中央,在距離中央3 cm處用接種環(huán)點(diǎn)接篩選出來(lái)的細(xì)菌,28℃共培養(yǎng)3～5 d,觀察并測(cè)量抑菌圈大小。

1.4 菌株Z1的形態(tài)特征觀察、全基因組測(cè)序及序列分析

將菌株分別接種于CYMG及血平板上,培養(yǎng)2～4 d后,肉眼觀察菌落形態(tài)及周圍是否出現(xiàn)溶血圈。取新鮮稀釋菌液制備臨時(shí)裝片,借助蔡司相差顯微鏡(Zeiss,德國(guó))觀察菌株細(xì)胞形態(tài)。細(xì)菌染色采用革蘭氏染色法。

取單菌落接種于NBY培養(yǎng)基中,培養(yǎng)2 d后收集菌體,無(wú)菌蒸餾水洗滌1次后再次懸浮,取1 μL作為16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增模板。PCR擴(kuò)增體系(30 μL):PrimeSTAR?Max(TaKaRa公司,日本)15 μL、引物 27F/1492R(10 μmol/L)各 1 μL、模板 1 μL、ddH2O 12 μL。擴(kuò)增條件:98 ℃ 5 min;94℃15 s,55℃15 s,72℃35 s,35個(gè)循環(huán);72℃10 min。采用DNA膠回收試劑盒(上海捷瑞生物工程有限公司)回收目標(biāo)PCR產(chǎn)物,并將其送至湖南擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。從Z1的全基因組序列中調(diào)取recA基因序列。將所得recA及16S rRNA基因序列分別與EzBioCloud、NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中相應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì)[15],經(jīng)Clustal Omega多序列比對(duì)分析[16]后,利用軟件Mega 7.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[17]。Z1的16S rRNA基因及recA基因的序列均已提交至GenBank,其序列登錄號(hào)分別為MT804577和 MT798856。

用NBY培養(yǎng)基培養(yǎng)Z1,離心收集菌體,用TEN緩沖液(0.01 mol/L Tris-Cl,pH 8.0;0.001 mol/L EDTA,pH 8.0;0.1 mol/L NaCl)洗滌一遍后,離心并棄去上清,將菌體寄至武漢貝納科技服務(wù)有限公司,采用Nanopore PromethION及Illumina Nova-Seq 6000進(jìn)行全基因組測(cè)序。從JGI(Joint Genome Institute,https://img.jgi.doe.gov/)和NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載同源菌株的全基因組序列,用在線工具Genome-to-Genome Distance Calculator(http://ggdc.dsmz.de/ggdc.php)計(jì)算Z1與近緣菌株的DNA-DNA雜交值(digital DNA-DNA hybridization,dDDH)[18]。采用在線平均核苷酸一致性(Average Nucleotide Identity,ANI)計(jì)算工具(https://www.ezbiocloud.net/tools/ani)算得 ANI 值[19]。采用GCK 3.0(Gene Construction Kit 3.0)進(jìn)行在線限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)分析。采用antiSMASH bacterial version(https://antismash.secondarymetabolites.org)預(yù)測(cè)Z1基因組中的次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因簇[20]。Z1的基因組序列及相關(guān)信息已提交至NCBI,其BioProject、BioSample及基因組序列登錄號(hào)分別為 PRJNA649092、SAMN15658474及 JACFYL-000000000。

1.5 菌株Z1的生理生化特征分析

用法國(guó)梅里埃公司(bioMérieux)的試紙條API 20NE、API ID 32GN、API 50CH 及 API ZYM 檢測(cè)Z1的生理生化特征。其中,API 20NE用于檢測(cè)硝酸鹽還原、七葉苷檸檬酸鐵與凝膠水解及菌株對(duì)部分碳源的利用情況;API ZYM試紙條用于酶活測(cè)定;API 50CH試紙條用來(lái)檢測(cè)菌株的發(fā)酵產(chǎn)酸情況;API ID 32GN用來(lái)檢測(cè)菌株對(duì)32種碳水化合物的利用情況。各項(xiàng)操作均按照試紙條說(shuō)明書進(jìn)行。

1.6 代謝產(chǎn)物的提取及高分辨質(zhì)譜分析

采用NBY培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵,接種量為5%[11]。30℃培養(yǎng)72 h后,添加大孔樹脂XAD-16(Amberlite?,美國(guó)),繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,離心收集菌體及XAD-16,棄上清,加入等體積甲醇浸提30 min,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后溶于1 mL甲醇中。

發(fā)酵液提取物經(jīng)最高轉(zhuǎn)速離心10 min后過(guò)濾,寄送至山東大學(xué)微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行高分辨質(zhì)譜(high resolution mass spectrum,HRMS)分析。所用儀器為Bruker Impact HD microTOF QⅢ質(zhì)譜儀(Bruker Daltonics,德國(guó)),采用標(biāo)準(zhǔn)的電噴霧離子源。色譜柱為Thermo Scientific Acclaim C18 column(2.1 mm × 100 mm,2.2 μm)。流動(dòng)相為含有0.1%甲酸的水及乙腈。

2 結(jié)果與分析

2.1 伯克氏菌Z1的分離及其抑真菌活性

從野生禾本科植物根際中分離到一株對(duì)多種植物病原菌均有較強(qiáng)抑制效果的細(xì)菌,命名為Z1。其對(duì)香梨腐爛病原菌迂回殼囊孢菌(C.ambiens)、西瓜枯萎病原菌腐皮鐮刀菌(F.solani)、辣椒炭疽病菌(C.capsici)、油菜核盤菌(S.sclerotiorum)及水稻紋枯病菌立枯絲核菌(R.solani Kuhn)的抑菌圈直徑分別 14 mm、4 mm、12 mm、12 mm 和 10 mm,顯示出較廣的抑菌譜(圖1)。

2.2 菌株Z1的形態(tài)特征

菌株Z1在CYMG平板上可形成直徑1～2 mm的菌落,圓形,黃白色,表面光滑,邊緣整齊,不透明,不產(chǎn)生熒光,中間凸起不明顯,培養(yǎng)48 h后可產(chǎn)生紅色色素(圖2A),但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)該色素又會(huì)自行消失。這一現(xiàn)象在伯克霍爾德氏菌中很常見(jiàn),具體機(jī)制至今不明。相差顯微鏡下菌體為桿狀(圖2B),革蘭氏染色呈陰性。在血平板上培養(yǎng)48 h后,菌株Z1能產(chǎn)生明顯的溶血圈(圖2C),且培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng),溶血圈越大。

圖1 菌株Z1對(duì)5種植物病原真菌的抑菌活性(A)香梨腐爛病原菌迂回殼囊孢菌;(B)西瓜枯萎病原菌腐皮鐮刀菌;(C)辣椒炭疽病菌;(D)油菜核盤菌;(E)水稻紋枯病菌立枯絲核菌。Fig.1 The inhibitory activity of strain Z1 against five phytopathogenic fungi(A)C.ambiens,the causative agent of fragrant pear canker;(B)F.solani,the causative agent of cucurbits fusarium wilt;(C)C.capsici;(D)S.sclerotiorum;(E)R.solani Kuhn,the causative agent of rice sheath blight.

圖2 菌株Z1的菌落、菌體形態(tài)及溶血圈(A)CYMG平板上的菌落形態(tài);(B)相差顯微鏡下的菌體特征(2 000×);(C)菌株培養(yǎng)48 h后,在血平板上出現(xiàn)明顯的溶血圈。Fig.2 The colony,cell morphology and the hemolytic zone of Z1(A)Colony of Z1 on CYMG plate;(B)Z1 under phase contrast microscope(2 000×);(C)The hemolytic zone produced by Z1 on sheep blood agar after 48 h incubation.

2.3 菌株Z1的基因型特征

16S rDNA序列同源性是進(jìn)行菌種分類的重要指標(biāo)。大多數(shù)情況下,98.7%的16S rDNA序列同源性為判定新種的分界點(diǎn)[21]。但亦有超過(guò)該值的細(xì)菌被鑒定為新種,如2013年在International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology上發(fā)表的微桿菌屬新種Microbacterium saccharophilum,其與同屬菌株的最高同源性達(dá)99.87%[22]。以菌株Z1的菌液為模板,用引物27F/1492R成功擴(kuò)增到了1.5 kb左右的條帶(圖3),測(cè)序后其大小為1 355 bp。在EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)該序列,得知其與Burkholderia contaminans LMG23-361的親緣關(guān)系最近,同源性達(dá)99.56%。選取鄰近17個(gè)菌株的同源序列構(gòu)建進(jìn)化樹(圖4),從圖中可知,Z1與B.contaminans LMG23361的進(jìn)化距離很近。

當(dāng)16S rDNA序列同源性高于97%時(shí),需要測(cè)定同源菌株間的dDDH值,該值大于70%為同種,低于70%為不同種[21]。由表1可知,Z1與其近緣菌株B.contaminans LMG23361、B.contaminans MS14、B.pyrrocinia Lyc2、B.pyrrocinia DSM10685及B.cepacia ATCC25416的dDDH值在44.50%～52.70%,低于閾值70%,說(shuō)明菌株Z1與這5株近緣菌株的差異達(dá)到種間水平,可作為判定新種的依據(jù)。

圖3 菌株Z1的16S rDNA擴(kuò)增電泳檢測(cè)圖M:分子量標(biāo)準(zhǔn)DL5000;Z1:菌株Z1的16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物。Fig.3 Electrophoresis analysis of PCR products of the gene encoding 16S rRNA of strain Z1M:DL5 000 marker;Z1:The 16S rDNA PCR products of Z1.

圖4 菌株Z1的16S rDNA系統(tǒng)進(jìn)化樹(鄰接法)圖中顯示了菌株Z1及17個(gè)來(lái)自EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(kù)的同源菌株的分類地位。替換模型為Kimura 2-parameter;分支處的數(shù)值為大于50%的步長(zhǎng)值(重復(fù)1 000次)。黑點(diǎn)代表該分支與用最大可能性法構(gòu)建時(shí)結(jié)果一致。菌種拉丁名后依次為菌株編號(hào)、序列登錄號(hào)及與Z1的同源性。Fig.4 Neighbor-joining phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence of strain Z1The relationships between strain Z1 and members of the genus Burkholderia are shown.Substitution model is Kimura 2-parameter.Bootstrap values(expressed as percentages of 1 000 replications)above 50%are shown at the branch points.Black dots denote branches recovered using maximum likelihood method.The strain number,sequence accession number and similarity are presented in order after the strain name.

ANI值指兩個(gè)微生物基因組同源片段之間的平均堿基相似度,在近緣物種之間有較高的區(qū)分度。一項(xiàng)基于9萬(wàn)個(gè)基因組的分析表明,不同物種間的基因組ANI小于95%,同一物種的基因組ANI大于95%[23],因此可以95%的ANI為物種劃分與物種聚類的標(biāo)準(zhǔn)。由表1可知,Z1與上述5個(gè)近緣物種的ANI值在91.54%～93.52%,均低于95%,雖達(dá)到判定新種的標(biāo)準(zhǔn),但數(shù)值非常接近95%,故仍需更多數(shù)據(jù)才能確定其是否為新種。

由于伯克霍爾德氏菌的16S rDNA序列過(guò)于保守,為獲得更準(zhǔn)確的分類信息,我們對(duì)Z1與其同源菌株的recA基因序列同源性進(jìn)行了分析?；騬ecA的序列已被證實(shí)能在伯克霍爾德氏菌屬內(nèi)區(qū)分70多個(gè)種,具有很好的鑒別功能[24]。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中,與Z1的recA基因同源性最高的菌株為 B.pyrrocinia DSM10685,同源性 97.75%(表1)。從基于recA基因序列構(gòu)建的進(jìn)化樹上亦可看出,Z1與B.pyrrocinia DSM10685的親緣關(guān)系較近,但是二者位于不同分支,分支處的步長(zhǎng)值(bootstrap value)為 82,可信度高(圖 5)。

洋蔥伯克氏菌群(Burkholderia cepacia complex,Bcc)包含多個(gè)表型相似、基因型不同的菌株,目前已鑒定出9個(gè)基因組變異型(genomovarⅠ～Ⅸ),每個(gè)基因組變異型又包含多個(gè)表型相似、基因型不同的菌株。其中,基因組變異型Ⅲ(B.cenocepacia)和基因組變異型Ⅱ (B.multivorans)為引起囊性纖維化的主要病原菌[25];基因組變異型Ⅸ的種名為B.pyrrocinia。Bcc中不同種間的recA基因同源性在94%～95%,同種相似度在98%～99%[25]。從表1可知,Z1的recA基因與B.pyrrocinia DSM-10685的同源性為97.75%,低于界定同種的閾值,但是比較接近。采用內(nèi)切酶HaeⅢ對(duì)這兩段序列進(jìn)行RFLP分析,Z1的recA基因完全酶切消化后得到的DNA片段長(zhǎng)度分別為144 bp、546 bp、583 bp、772 bp、843 bp、864 bp、876 bp、940 bp 和1 009 bp,而B.pyrrocinia DSM10685所得片段長(zhǎng)度為 144 bp、538 bp、546 bp、583 bp、772 bp、864 bp、876 bp、940 bp和1 009 bp,兩者僅有一個(gè)酶切位點(diǎn)的差異,因此我們認(rèn)為Z1應(yīng)為基因組變異型Ⅸ的一個(gè)新成員。

表1 菌株Z1與同屬近緣菌株間的16S rDNA同源性、recA基因同源性、ANI值、dDDH值及GC含量比較Table 1 Comparison of the 16S rDNA and recA gene identity,ANI,dDDH,and GC content between Z1 and the closely related species of the genus Burkholderia

圖5 基于recA基因序列分析構(gòu)建的進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree based on gene recA sequence analysis

2.4 菌株Z1的生理生化特征

為全面了解菌株Z1對(duì)碳源的利用情況及其酶活等各項(xiàng)生理生化特征,我們用梅里埃試紙條對(duì)Z1進(jìn)行了測(cè)定。經(jīng)試紙條測(cè)定,菌株Z1能將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽,能水解七葉苷檸檬酸鐵、凝膠及4-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷,不能產(chǎn)生色氨酸酶、脲酶、精氨酸雙水解酶、纈氨酸芳胺酶、胱氨酸芳胺酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-糖醛酸苷酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、N-乙酰-葡萄糖胺酶、α-甘露糖苷酶、β-巖藻糖苷酶,能產(chǎn)生堿性磷酸酶、酯酶(C4)、類脂酯酶(C8)、類脂酶(C14)、亮氨酸芳胺酶、酸性磷酸酶、苯酚-AS-BI-磷酸水解酶,能發(fā)酵阿拉伯糖、木糖、D-側(cè)金盞花醇、半乳糖、葡萄糖、乳糖、纖維二糖、麥芽糖、巖藻糖產(chǎn)酸,能同化葡萄糖、葡萄糖酸鉀、N-乙酰葡萄糖胺、阿拉伯糖、甘露糖、甘露醇、乙酰葡萄糖胺、麥芽糖、羊蠟酸、己二酸、蘋果酸、檸檬酸鈉、苯乙酸、D-核糖、肌醇、蔗糖、辛二酸鹽、L-丙氨酸、5-酮基-葡萄糖酸鹽、L-絲氨酸、D-蜜二糖、L-巖藻糖、D-山梨醇、組氨酸、2-酮基-葡萄糖酸鹽、L-脯氨酸。經(jīng)與文獻(xiàn)中同源菌株相應(yīng)數(shù)據(jù)[26～28]比較,發(fā)現(xiàn)菌株Z1的大部分生理生化特征與吡咯伯克霍爾德氏菌一致,僅個(gè)別指標(biāo)存在差異(表2),這支持了其為基因組變異型Ⅸ中一員的結(jié)論。

2.5 基因組分析

伯克霍爾德氏菌生活范圍廣,適應(yīng)能力強(qiáng),代謝種類多樣,因而其基因組也較大,平均約7.5 Mb,大小位列細(xì)菌的前5%。伯克霍爾德氏菌的大多數(shù)種都含有兩條染色體,0～6個(gè)質(zhì)粒。生活在真菌體內(nèi)的B.rhizoxinica(現(xiàn)已更名為M.rhizoxinica)例外,只含有1條染色體,其基因組大小為3.75 Mb。不同于鏈霉菌等其他細(xì)菌,大多數(shù)伯克霍爾德氏菌的必需基因與非必需基因分別位于兩條不同的染色體上[29]。

經(jīng)全基因組測(cè)序及拼接獲得菌株Z1的基因組序列,其含有兩條染色體(3.7 Mb和3.5 Mb)及1個(gè)大質(zhì)粒(1.2 Mb),總長(zhǎng)8.4 M,GC含量66.28%。經(jīng)在線次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因簇預(yù)測(cè)軟件antiSMASH分析,我們發(fā)現(xiàn)其基因組中含有萜類(terpene)、細(xì)菌素(bacteriocin)、非核糖體肽(nonribosomal peptide,NRP)等15個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成基因簇,其中一個(gè)長(zhǎng)約94 kb的基因簇與occidiofungin的生物合成基因簇相似度達(dá)88%。

2.6 菌株Z1的抑真菌物質(zhì)分析

伯克霍爾德氏菌產(chǎn)生的抑真菌物質(zhì)種類豐富,包括 burkholdines[30]、occidiofungins[31]及 pyrrolnitrin[32]等。其中,burkholdines和occidiofungins屬于環(huán)脂肽,能夠裂解血細(xì)胞,且兩者結(jié)構(gòu)非常相似,在骨架上只有一個(gè)氨基酸不同(圖6)。Occidiofungins由1個(gè)β-羥基天冬酰胺(β-hydroxy asparagine,BHN)、1 個(gè) β-羥基酪氨酸(β-hydroxy tyrosine,BHY)、兩個(gè)絲氨酸、1個(gè)甘氨酸、1個(gè)天冬酰胺、1個(gè)2,4-二氨基丁酸(2,4-diamino butyric acid,DABA)及1個(gè)來(lái)源于脂肪酸途徑的非蛋白氨基酸脫水縮合而成。而burkholdines的骨架中沒(méi)有DABA,取而代之的是天冬酰胺。兩者均含有1個(gè)由11個(gè)碳原子組成的直鏈烷烴及1個(gè)木糖。

表2 菌株Z1與同屬近緣菌株的表型差異特征Table 2 Differential phenotype characteristics of strain Z1 and strains of closely related species of the genus Burkholderia

菌株Z1能抑制多種植物病原真菌及白色念珠菌,其基因組中含有與抑真菌環(huán)脂肽occidiofungin生物合成基因簇高度同源的基因簇。為進(jìn)一步探討Z1抑真菌活性物質(zhì)的成分,我們對(duì)該菌的發(fā)酵液進(jìn)行了高分辨質(zhì)譜分析。從質(zhì)譜結(jié)果中可找到質(zhì)荷比為1 216.588 3[M+H]+(calcd for C52H86N11O22,1 216.594 3,4.9×10-6)的峰,該值與occidiofungin B的相對(duì)分子質(zhì)量非常接近;除此之外,亦能找到質(zhì)荷比為1 214.571 4[M+H]+(calcd for C52H84N11O22,1 214.578 7,6.0×10-6)及 1 230.564 1[M+H]+(calcd for C52H84N11O23,1 230.573 6,7.7×10-6)的峰,這與 burkholdine-1213和 burkholdine-1229的相對(duì)分子質(zhì)量也非常接近。對(duì)于1 215.556 5[M+H]+、1 083.515 3[M+H]+、1 231.550 1[M+H]+和1 099.507 4[M+H]+,目前尚未在已報(bào)道文獻(xiàn)中找到與其相對(duì)分子質(zhì)量一致的化合物,但是它們的二級(jí)質(zhì)譜碎片離子與文獻(xiàn)報(bào)道的burkholdine-1097的許多碎片離子[33]相同,且兩兩相差132 Da,與丟失木糖的片段吻合,木糖的相對(duì)分子質(zhì)量為150 Da(圖7),因此我們推測(cè)其可能為burkholdine的新衍生物。

圖6 Occidiofungin B、burkholdine-1213及burkholdine-1229的結(jié)構(gòu)、分子式和相對(duì)分子質(zhì)量紅色部分為兩種環(huán)脂肽在骨架上的不同之處。Fig.6 The structure,chemical formula and monoisotopic mass of occidiofungin B,burkholdine-1213 and burkholdine-1229The red color indicates the difference between the backbones of occidiofungins and burkholdines.

據(jù)報(bào)道,某些能產(chǎn)生occidiofungins或burkholdines的伯克氏菌株可在血平板上產(chǎn)生溶血圈[34]。菌株Z1在血平板上培養(yǎng)48 h后,菌落周圍亦出現(xiàn)了非常明顯的溶血圈(圖2C)。結(jié)合高分辨質(zhì)譜分析結(jié)果,我們推測(cè)菌株Z1產(chǎn)生的抑真菌物質(zhì)很可能為 occidiofungin B、burkholdine-1213、burkholdine-1229及burkholdine的新衍生物。

3 討論

伯克霍爾德氏菌屬的細(xì)菌能以自由生活或寄生的方式廣泛存在于陸地、水域等多種環(huán)境中。許多伯克霍爾德氏菌均具有生物防治的功能,例如:B.rinojensis能抑殺節(jié)肢動(dòng)物,可開發(fā)為殺蟲劑[29];B.contaminans等菌株能合成多種抗真菌物質(zhì)。有些伯克霍爾德氏菌能促進(jìn)植物的生長(zhǎng),在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中可將其用作生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑或復(fù)合肥料,如具有固氮功能的B.ambifaria和B.caribensis。另外,有的伯克霍爾德氏菌還可以分解土壤中殘留的農(nóng)藥、凈化污水[29]。20世紀(jì)90年代,美國(guó)環(huán)保局批準(zhǔn)用于多種植物病原真菌防治的菌劑Deny?、Blue Circle?及Intercept?等的主要成分均為伯克霍爾德氏菌[35],在我國(guó)亦有類似產(chǎn)品,如“亞寶”。此外,也有一些伯克霍爾德氏菌株是動(dòng)植物病原菌。

本研究采用選擇性培養(yǎng)基從野生竹子根際靶向性篩得伯克霍爾德氏菌Z1,其具有廣譜抑真菌活性(圖1)。與其16S rRNA基因及recA基因序列同源性最高的菌株分別為B.contaminans LMG-23361 和 B.pyrrocinia DSM10685(表 1,圖 4～5)。兩者都是Bcc成員,其基因組中均含有大量抑菌活性天然產(chǎn)物的生物合成基因簇,但不含有主要致病因子[36]。這將大幅降低大規(guī)模應(yīng)用時(shí)的安全風(fēng)險(xiǎn)。雖然Z1與多株近緣菌株間的dDDH值及ANI值均低于新種鑒定閾值,達(dá)到界定新種的標(biāo)準(zhǔn)(表1),但有差異的生理生化指標(biāo)不多(表2)。鑒于伯克霍爾德氏菌屬新種鑒定的復(fù)雜性,本論文不敢貿(mào)然將該菌認(rèn)定為新種。該菌與近緣菌株間確實(shí)存在差異。Bcc菌群目前已有9個(gè)基因組變異型,每個(gè)基因組變異型又包含多個(gè)菌株,它們的形態(tài)特征非常相似,但基因組水平上的差異達(dá)到新種鑒定標(biāo)準(zhǔn)[8]。綜合本文對(duì)Z1及其近緣菌株的基因組序列分析及生理生化特征的測(cè)定結(jié)果,我們認(rèn)為菌株Z1極可能是Bcc基因組變異型Ⅸ(B.pyrrocinia)中的一員。

圖7 菌株Z1代謝產(chǎn)物的高分辨質(zhì)譜分析質(zhì)荷比分別為 1 230.564 1[M+H]+(A)、1 231.550 1[M+H]+(B)、1 099.507 4[M+H]+(C)、1 214.571 4[M+H]+(D)、1 215.556 5[M+H]+(E)及1 083.515 3[M+H]+(F)的衍生物的母離子的二級(jí)質(zhì)譜圖。兩個(gè)或多個(gè)衍生物共有的碎片離子用紅色標(biāo)出,衍生物A與B、D與E之間相差1 Da的碎片離子用藍(lán)色表示。質(zhì)荷比為547.332 9[M+H]+、718.393 7[M+H]+和832.437 7[M+H]+的碎片離子與文獻(xiàn)[33]報(bào)道一致,其中832.437 7[M+H]+為burkholdines特有的碎片離子。Fig.7 The HRMS analysis of the metabolites of Z1Shown here are the MS2 spectrum for the masses with a m/z of 1 230.564 1[M+H]+(A),1 231.550 1[M+H]+(B),1 099.507 4[M+H]+(C),1 214.571 4[M+H]+(D),1 215.556 5[M+H]+(E)and 1 083.515 3[M+H]+(F)respectively.The numbers in red color indicate the MS2 fragments shared by two or more different derivatives,while the blue numbers highlight fragments with an increase of 1 Da compared with A and B,D and E,separately.The mass fragments with m/z of 547.332 9[M+H]+,718.393 7[M+H]+and 832.437 7[M+H]+are consistent with the ones in former publications,while the 832.437 7[M+H]+is unique for burkholdines.

結(jié)合抑菌活性、高分辨質(zhì)譜、血平板試驗(yàn)及基因組序列分析結(jié)果,我們認(rèn)為菌株Z1產(chǎn)生的抑真菌活性物質(zhì)應(yīng)為環(huán)脂肽occidiofungins和burkholdines。盡管Z1基因組中僅存在與occidiofungin生物合成基因簇高度相似的基因簇(相似度88%),但這兩種環(huán)脂肽結(jié)構(gòu)類似,考慮到腺苷?；Y(jié)構(gòu)域(adenylylation domain)寬松的底物特異性,這在生物合成途徑上是完全可行的。目前已報(bào)道的能產(chǎn)生occidiofungins的伯克霍爾德氏菌有B.pyrrocinia Lyc2[37]、B.contaminans MS14[31];能產(chǎn)生burkholdines的菌有B.ambifaria 2.2N[33]。雖然兩種環(huán)脂肽結(jié)構(gòu)非常相似,但既能合成occidiofungins又能合成burkholdines的菌株在國(guó)內(nèi)外尚沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道,且Z1還能合成burkholdine的新衍生物(圖7),這為研制具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新生防菌劑奠定了基礎(chǔ)。