周子康，許平

（1 上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，上海200240；2 上海交通大學(xué)微生物代謝國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200240）

許多原核和真核細(xì)胞系統(tǒng)是生產(chǎn)高附加值化合物、天然產(chǎn)物和生物能源的最佳宿主。經(jīng)典的代謝工程方法非常適合于改善通路通量和提高產(chǎn)品產(chǎn)量。但是，這種方法在改變復(fù)雜細(xì)胞表型的能力上非常有限。復(fù)雜表型包括生長(zhǎng)速率、生物轉(zhuǎn)化率和耐受性，而全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控工程（global transcription machinery engineering,gTME）是改變復(fù)雜細(xì)胞表型的通用方法。這種方法主要是引入通用轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白的突變，引發(fā)基因網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞代謝的重編程。通過將突變蛋白表達(dá)與表型選擇和篩選聯(lián)系起來，從而篩選出引發(fā)新的復(fù)雜細(xì)胞表型的突變體。但是，由于很難從頭預(yù)測(cè)突變蛋白序列與功能之間的聯(lián)系，因此通常通過創(chuàng)建轉(zhuǎn)錄因子的突變文庫并選擇可改善所需表型的突變庫來簡(jiǎn)化該方法。gTME 已成功應(yīng)用于原核和真核系統(tǒng)，提高了微生物的環(huán)境耐受性、代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量和底物的利用率，包括乙醇耐受性[1-2]、番茄紅素產(chǎn)量的提升[2]和木糖發(fā)酵過程的優(yōu)化[3]。因此，gTME 是基于轉(zhuǎn)錄水平菌株開發(fā)的有效工具，可以單獨(dú)使用或與其他代謝工程技術(shù)結(jié)合使用，構(gòu)建更高效的細(xì)胞工廠。

1 全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控及其原理

細(xì)胞生長(zhǎng)過程中有著嚴(yán)格的調(diào)控機(jī)制，可通過對(duì)轉(zhuǎn)錄元件的精準(zhǔn)調(diào)控，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞中各個(gè)基因的時(shí)序性轉(zhuǎn)錄。細(xì)胞代謝途徑的復(fù)雜性決定了基因與表型之間并非簡(jiǎn)單的線性對(duì)應(yīng)關(guān)系。某些特定的表型通常由多個(gè)基因控制。傳統(tǒng)的代謝工程方法主要針對(duì)單一基因進(jìn)行修飾，但由于代謝途徑的高度復(fù)雜性，導(dǎo)致代謝工程的表型往往不能符合預(yù)期要求[4-5]。因而，只有同時(shí)對(duì)多個(gè)控制基因同時(shí)進(jìn)行修飾才能得到目標(biāo)表型。人們對(duì)轉(zhuǎn)錄水平和細(xì)胞表型之間關(guān)系的深入認(rèn)識(shí)，使得直接操控轉(zhuǎn)錄組獲得目的表型成為可能，通過細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，改進(jìn)細(xì)胞的某些代謝性能[1-2,6-8]。

全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控工程利用易錯(cuò)PCR、定點(diǎn)突變等技術(shù)對(duì)細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子或其他轉(zhuǎn)錄元件進(jìn)行定向或非定向的突變修飾，調(diào)節(jié)RNA 聚合酶對(duì)啟動(dòng)子的結(jié)合能力，改變細(xì)胞轉(zhuǎn)錄效率，使得基因的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生整體改變。整體轉(zhuǎn)錄水平的變化可以引發(fā)多基因控制的細(xì)胞表型，通過不斷篩選可以實(shí)現(xiàn)復(fù)雜表型的定向進(jìn)化。此外，基因上游調(diào)控區(qū)域也能影響細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄水平。這些調(diào)控區(qū)域可與特定蛋白結(jié)合，實(shí)現(xiàn)下游轉(zhuǎn)錄的“激活”或“抑制”，形成“+”或“-”的調(diào)控途徑，由不同的調(diào)控途徑聯(lián)結(jié)成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同控制細(xì)胞內(nèi)的各種代謝過程。Martínez-Antonio[9]和Richard等[10]分別研究了大腸桿菌和釀酒酵母中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，證實(shí)原核和真核細(xì)胞的功能與轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)高度相關(guān)，多層次的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和全局轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控著其他轉(zhuǎn)錄元件，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)部轉(zhuǎn)錄過程的精準(zhǔn)調(diào)控。轉(zhuǎn)錄組水平的多樣性賦予了細(xì)胞不同的表型[3,11-13]。相比紫外誘變、定點(diǎn)突變等方法，全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控效率更高，可以引發(fā)代謝途徑上多個(gè)基因轉(zhuǎn)錄的同時(shí)微調(diào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜代謝途徑的快速優(yōu)化，從而高效獲得目的表型。

2 全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控在代謝工程中的應(yīng)用

2.1 gTME在原核生物中的應(yīng)用

gTME 可以同時(shí)上調(diào)或下調(diào)數(shù)百個(gè)基因，尤其是那些涉及DNA 識(shí)別的成分，如全局轉(zhuǎn)錄因子和RNA 聚合酶亞基。 將來自耐輻射球菌（Deinococcus radiodurans）的全局調(diào)控因子IrrE 引入大腸桿菌，以增強(qiáng)其對(duì)乙醇、丁醇和乙酸鹽脅迫的抗性[14]。同樣，來自密蘇里游動(dòng)放線菌（Actinoplanes missouriensis）、 橙 黃 小 單 孢 藻（Micromonospora aurantiaca） 和 沙 里 氏 單 胞 菌（Salinispora arenicola）的外源西格瑪因子σHrdB，被引入游動(dòng)放線菌中，用于隨機(jī)誘變/DNA 改組，成功地提高了游動(dòng)放線菌中替考拉寧（太古霉素）的產(chǎn)量。據(jù)報(bào)道，最佳突變菌株可產(chǎn)生5.3mg/mL 替考拉寧，產(chǎn)量是原始菌株的2 倍[15]；Alper 等[2]發(fā)現(xiàn)gTME 在番茄紅素的生物合成過程中效果顯著。他們從4 種大腸桿菌中分離出各自的σ70因子，對(duì)各自編碼σ70因子的rpoD 進(jìn)行多輪隨機(jī)突變，再將突變后的rpoD 分別回補(bǔ)，測(cè)定含有突變?chǔ)?0因子的菌株中番茄紅素的產(chǎn)量。其中一株突變菌株中的番茄紅素含量達(dá)到了7.7mg/L，比野生型大腸桿菌的4.2mg/L 的番茄紅素含量提高了將近一倍。于慧敏等[16]利用gTME 的方法，以大腸桿菌為宿主，通過對(duì)大腸桿菌細(xì)胞的RNA 聚合酶中編碼σ 因子的rpoD和rpoS進(jìn)行隨機(jī)突變，建立突變文庫，通過高通量方法篩選高產(chǎn)透明質(zhì)酸的突變株。其中突變r(jià)poD 篩選獲得的菌株D72 透明質(zhì)酸的產(chǎn)量達(dá)到561.4mg/L，透明質(zhì)酸的細(xì)胞干重達(dá)到了265mg/g。

2.2 gTME在真核生物中的應(yīng)用

相比原核細(xì)胞中的唯一的四亞基組分RNA 聚合酶，真核生物有三種RNA 聚合酶，聚合酶Ⅰ存在于核仁，聚合酶Ⅱ和聚合酶Ⅲ存在于核質(zhì)。聚合酶I 合成除5S 以外的rRNA，聚合酶Ⅱ主要是RNA聚合酶，聚合酶Ⅲ合成tRNA 和5S rRNA。另外，真核生物轉(zhuǎn)錄需大量轉(zhuǎn)錄因子，它們按順序結(jié)合到聚合酶上共同完成轉(zhuǎn)錄[17]。正是這種復(fù)雜性，為gTME 技術(shù)在真核細(xì)胞中的應(yīng)用提供更多的突變靶標(biāo)。Alper 等[1]通過易錯(cuò)PCR 對(duì)釀酒酵母RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子TFIID 中TAF25 亞基和與TATA 序列結(jié)合的SPTl5亞基進(jìn)行多輪突變，篩選出對(duì)高濃度葡萄糖和乙醇耐受的酵母菌株；Cao 等[18]在釀酒酵母中引入TPS1（6-磷酸-海藻糖合酶）可以使釀酒酵母在18%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇中的存活率更高，最終乙醇生產(chǎn)濃度提高約15%；Jung 等[19]通過抑制ATH1（酸性海藻糖酶）的表達(dá)促進(jìn)了酵母在8%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇條件下的生長(zhǎng)，并使乙醇生產(chǎn)率提高了約100%。Qiu等[20]利用易錯(cuò)PCR對(duì)釀酒酵母的RNAP Ⅱ的Rpb7 亞基進(jìn)行突變，篩選乙醇高耐受性和高產(chǎn)突變株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，突變株的乙醇產(chǎn)量約為122g/L（理論產(chǎn)率的96.58%），比對(duì)照組增加了40%。同時(shí)，DNA 微陣列分析表明，發(fā)酵12h后，突變株中有369個(gè)基因存在表達(dá)差異，涉及糖酵解、酒精發(fā)酵、氧化應(yīng)激反應(yīng)等。由此可見，全局轉(zhuǎn)錄工程著眼于直接調(diào)控細(xì)胞整體基因轉(zhuǎn)錄水平，指向性強(qiáng)，方法簡(jiǎn)便。對(duì)所得到的突變體進(jìn)行分子機(jī)制的解析可為進(jìn)一步定向改造提供關(guān)鍵的研究目標(biāo)。

3 全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控提升菌株耐受性

隨著gTME 方法的發(fā)展，已有許多通過gTME技術(shù)提高菌株耐受性的報(bào)道。Alper等[2]在大腸桿菌中通過篩選突變的全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子σ70，不僅提高了番茄紅素的產(chǎn)量，同時(shí)使得突變株能夠雙重耐受60g/L乙醇和高濃度的SDS；Klein-Marcuschamer等[21]應(yīng)用gTME 技術(shù)對(duì)植物乳桿菌的σ 因子進(jìn)行改造，發(fā)現(xiàn)僅將σ因子中345位的Gln替換成Lys就可以顯著提高植物乳桿菌對(duì)乳酸和高濃度鹽的雙重耐受性；Gao等[22]隨機(jī)突變大腸桿菌σD因子，從突變文庫中篩選出的耐酸突變體在pH 3.17 條件下生長(zhǎng)速率是野生型的1.5 倍；Matsui 等[23]對(duì)釀酒酵母的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子PDR1進(jìn)行單點(diǎn)突變，成功篩選出有機(jī)溶劑耐受的菌株。突變株能在異辛烷/YPD 兩相系統(tǒng)中將3-氧代丁酸丁酯還原成3-羥基丁酸丁酯；Basak 等[24]將甲苯作為選擇壓力，利用易錯(cuò)PCR 將大腸桿菌的全局調(diào)控因子CRP 進(jìn)行隨機(jī)突變和建庫篩選，在誘變文庫中篩選到了一株能夠耐受0.23%甲苯的突變體，而這個(gè)甲苯濃度下的野生型菌株的生長(zhǎng)被完全抑制。進(jìn)一步的研究表明，改造CRP可以明顯改善大腸桿菌在氧化應(yīng)激條件下的耐受性，通過高通量篩選得到了耐受突變株OM3，該菌株能夠在12mmol/L H2O2條件下生長(zhǎng)，而野生型的生長(zhǎng)則被完全抑制。Zhou等[25]在大腸桿菌中表達(dá)全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子IrrE顯著促進(jìn)了酸性條件下惡臭假單胞菌的生長(zhǎng)和提高了尼古丁的降解效率?？梢灶A(yù)見，gTME 在工業(yè)微生物的育種中將得到更廣泛的應(yīng)用。

4 結(jié)語

代謝工程學(xué)的出現(xiàn)旨在改善細(xì)胞特性，以生產(chǎn)有用的化學(xué)藥品并用于更廣泛的生產(chǎn)生活應(yīng)用場(chǎng)景中。進(jìn)一步的細(xì)胞改良和多基因表型的調(diào)控需要同時(shí)精準(zhǔn)控制多個(gè)基因的表達(dá)。全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控概念的出現(xiàn)，適時(shí)地?cái)U(kuò)展了代謝工程的應(yīng)用范圍。gTME可以通過修飾負(fù)責(zé)協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)整個(gè)轉(zhuǎn)錄組水平的調(diào)控，從而控制生物合成途徑中關(guān)鍵酶的表達(dá)水平，最終確定代謝網(wǎng)絡(luò)的方向、通量和平衡[26]。這種方法已經(jīng)在細(xì)胞工程、代謝工程應(yīng)用實(shí)例中取得了成功，使其目標(biāo)化合物的產(chǎn)量、宿主細(xì)胞耐受性等有了顯著的提高和改善。細(xì)胞全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控工程的研究表明，細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)具有很大的彈性，可通過多種手段對(duì)代謝通量進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行重編程，從而獲得性能優(yōu)良的工業(yè)微生物菌種。gTME 結(jié)合生物信息學(xué)相關(guān)技術(shù)，將使人們獲得更多的基因與表型之間的關(guān)系信息，為更快速改造細(xì)胞的代謝和生理功能提供新的方向。