張焱，冉麗權(quán)，張寶喆，張明珠

昆明醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，昆明 650106

外泌體是由各種細(xì)胞分泌到細(xì)胞外液中的特異性細(xì)胞外囊泡，其可攜帶蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等生物活性分子并將這些分子轉(zhuǎn)運(yùn)到鄰近或遠(yuǎn)處的細(xì)胞，從而改變靶細(xì)胞的基因表達(dá)、信號(hào)傳遞和整體功能［1］。微小RNA（miRNA）是由各種細(xì)胞產(chǎn)生的單鏈非編碼RNA，其可通過(guò)外泌體從供體細(xì)胞轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，在受體細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄后干擾基因表達(dá)，在各種生物過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用［2］。纖維化的主要特征是成纖維細(xì)胞增殖、活化或轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，大量細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）異常增多或過(guò)度沉積，可導(dǎo)致組織、器官結(jié)構(gòu)受損甚至器官衰竭。大量研究表明，外泌體源性miRNA在纖維化疾病中發(fā)揮重要作用。本文就外泌體源性miRNA在纖維化疾病中的作用機(jī)制及其相關(guān)信號(hào)通路綜述如下。

1 外泌體源性miRNA在纖維化疾病中的作用機(jī)制

1.1 介導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖分化 成纖維細(xì)胞是全身結(jié)締組織中最常見(jiàn)的細(xì)胞類型，也是ECM的主要來(lái)源，其可以被各種化學(xué)信號(hào)（如細(xì)胞因子、趨化因子和生長(zhǎng)因子等）激活并加快增殖和分化，形成可以上調(diào)基質(zhì)生成速率的肌成纖維細(xì)胞，表達(dá)α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）并產(chǎn)生大量具有收縮作用的膠原蛋白，從而促進(jìn)纖維化的發(fā)生［3］。外泌體可通過(guò)旁分泌或自分泌的方式將攜帶的miRNA遞送至成纖維細(xì)胞，促進(jìn)其增殖分化，從而影響纖維化進(jìn)程。

外泌體可以介導(dǎo)多種類型細(xì)胞與成纖維細(xì)胞之間的串?dāng)_，遞送miRNA至成纖維細(xì)胞發(fā)揮作用。研究顯示，在缺氧或血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)下，miR-208a在心肌細(xì)胞來(lái)源的外泌體中表達(dá)上調(diào)，并可通過(guò)外泌體旁分泌的方式轉(zhuǎn)移到心臟成纖維細(xì)胞中。含有miR-208a的外泌體有助于促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和向肌成纖維細(xì)胞的分化，這些效應(yīng)是由miR-208a靶向降低雙特異性酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)激酶2（Dyrk2）的表達(dá)來(lái)介導(dǎo)的［4］。YAO等［5］研究發(fā)現(xiàn)，M2型巨噬細(xì)胞分泌的外泌體可攜帶miR-328進(jìn)入肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞并促進(jìn)其增殖分化。miR-328能夠靶向家族序列相似基因13A（FAM13A）并下調(diào)其表達(dá)，而沉默F(xiàn)AM13A可上調(diào)Ⅰ型膠原和α-SMA的表達(dá)，刺激了肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞的增殖并促進(jìn)肺纖維化。此外，心肌細(xì)胞來(lái)源的含miR-217的外泌體在體外可增強(qiáng)成纖維細(xì)胞的活性，促進(jìn)靶細(xì)胞纖維化標(biāo)志基因如Ⅰ型膠原α1鏈、α2鏈以及纖維連接蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)心肌纖維化［6］。

1.2 介導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化 肌成纖維細(xì)胞被認(rèn)為是產(chǎn)生和沉積病理性ECM的主要效應(yīng)細(xì)胞，不同類型的細(xì)胞均可能分化為肌成纖維細(xì)胞參與纖維化。目前，已經(jīng)提出的肌成纖維細(xì)胞來(lái)源包括成纖維細(xì)胞、周細(xì)胞、骨髓源性單核細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化等［7］。

上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化是上皮細(xì)胞失去細(xì)胞黏附和極性，獲得遷移和侵入性質(zhì)以成為間充質(zhì)細(xì)胞的過(guò)程。LV等［8］取絕經(jīng)后大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（AD‐MSCs）進(jìn)行培養(yǎng)，將轉(zhuǎn)染miR-214的ADMSCs分泌的外泌體注入絕經(jīng)后大鼠膀胱，發(fā)現(xiàn)miR-214能夠靶向線粒體融合蛋白2（Mfn2）來(lái)介導(dǎo)纖維化過(guò)程。Mfn2被認(rèn)為是控制細(xì)胞增殖和組織纖維化的重要調(diào)節(jié)因子，抑制miR-214可以靶向上調(diào)Mfn2的表達(dá)，促進(jìn)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程，導(dǎo)致膀胱壁纖維化。

內(nèi)皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化可促進(jìn)纖維化發(fā)生發(fā)展，而其反向過(guò)程（間充質(zhì)細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化）有助于減少間充質(zhì)細(xì)胞增殖、遷移和合成膠原引發(fā)的纖維化［9］。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)缺氧處理的內(nèi)皮祖細(xì)胞及內(nèi)皮祖細(xì)胞來(lái)源的外泌體中miR-133高表達(dá)，miR-133可通過(guò)外泌體傳遞到心臟成纖維細(xì)胞，增加心臟成纖維細(xì)胞血管生成并促使間充質(zhì)細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化；間充質(zhì)細(xì)胞獲得內(nèi)皮細(xì)胞樣功能并參與心臟損傷區(qū)域的血管生成，在逆轉(zhuǎn)心肌纖維化中發(fā)揮重要作用［10］。這提示了外泌體可通過(guò)攜帶相關(guān)miRNA來(lái)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞及間充質(zhì)細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)化，以發(fā)揮其雙向調(diào)節(jié)作用。

1.3 介導(dǎo)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞凋亡在纖維化啟動(dòng)中也發(fā)揮著重要作用，如干細(xì)胞分泌的外泌體可調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡以影響纖維化，而其攜帶的miRNA和蛋白質(zhì)是發(fā)揮功能的關(guān)鍵物質(zhì)。研究顯示，經(jīng)血源性干細(xì)胞（MenSC）來(lái)源的外泌體能夠通過(guò)調(diào)節(jié)肺泡上皮細(xì)胞凋亡來(lái)改善肺纖維化，MenSCs來(lái)源外泌體miRNA let-7可通過(guò)靶向抑制肺上皮細(xì)胞中凝集素樣氧化型低密度脂蛋白受體1（LOX1），調(diào)節(jié)活性氧、線粒體DNA損傷和NLRP3炎癥小體活化，從而減少肺泡上皮細(xì)胞凋亡，改善肺纖維化［11］。

2 外泌體源性miRNA介導(dǎo)纖維化的相關(guān)信號(hào)通路

2.1 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）/Smad信號(hào)通路 TGF-β是一種多效性細(xì)胞因子，可調(diào)節(jié)包括細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、免疫和ECM沉積等生物學(xué)過(guò)程，被認(rèn)為是纖維化過(guò)程中的關(guān)鍵角色，其信號(hào)通路的激活參與了大多數(shù)器官的病理性纖維化［12］。TGF-β通路中的效應(yīng)物Smad蛋白在其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用，具有競(jìng)爭(zhēng)性的促纖維化和抗纖維化作用［13］。研究顯示，外泌體miRNA可通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β/Smad信號(hào)通路在纖維化中發(fā)揮作用。

TGF-β能夠以同源二聚體的形式與TGF-β2型受體（TGF-βR2）結(jié)合，募集并激活TGF-βR1?；罨腡GF-βR1可使Smad2和Smad3磷酸化，與Smad4復(fù)合并移位至細(xì)胞核，從而參與目標(biāo)基因表達(dá)的調(diào)控［13］。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體攜帶的一組特異性miRNA（miR-21、miR-23a、miR-125b和miR-145）表達(dá)明顯增加，通過(guò)外泌體介導(dǎo)的細(xì)胞間轉(zhuǎn)移，這些miRNA可直接影響TGF-β/Smad2信號(hào)通路中TGF-β2、TGF-βR2和Smad2的表達(dá)，通過(guò)抑制TGFβ/Smad2信號(hào)通路的激活來(lái)抑制成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的分化，從而減少α-SMA的表達(dá)和Ⅰ型膠原的沉積，在抗纖維化中發(fā)揮關(guān)鍵作用［14］。

Smad7是Smad2/3的負(fù)調(diào)控因子，與Smad2和Smad3競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合活化的TGF-βR1，從而減少TGFβ/Smad的信號(hào)傳遞，具有抑制纖維化的作用［13］。研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞來(lái)源的含miR-21-5p的外泌體可以介導(dǎo)骨髓巨噬細(xì)胞和肌腱細(xì)胞的細(xì)胞間串?dāng)_，miR-21-5p通過(guò)降解相應(yīng)的mRNA來(lái)減少Smad7蛋白表達(dá)，而Smad7作為負(fù)調(diào)控因子可抑制TGF-β信號(hào)通路活化；miR-21-5p抑制Smad7的表達(dá)使肌腱細(xì)胞中的TGF-β1信號(hào)通路被激活，可上調(diào)Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、α-SMA的表達(dá)，從而誘導(dǎo)肌腱損傷后修復(fù)愈合的纖維化反應(yīng)［12］。

2.2 核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）信號(hào)通路 早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子1（Egr1）是一種在多種細(xì)胞類型中表達(dá)的鋅指轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)激活Toll樣受體4（TLR4），能夠活化下游NF-κB觸發(fā)信號(hào)級(jí)聯(lián)，誘導(dǎo)一系列炎癥因子的表達(dá)，參與炎癥、凋亡和纖維化的調(diào)節(jié)，可導(dǎo)致急性心肌梗死后的心肌損傷。Egr1是miR-146a的靶標(biāo)，在TLR4/NF-κB信號(hào)通路中起重要作用。脂肪干細(xì)胞來(lái)源外泌體中的miR-146a可抑制急性心肌梗死誘導(dǎo)的Egr1、TLR4表達(dá)和NF-κB p65的磷酸化，逆轉(zhuǎn)TLR4/NF-κB信號(hào)激活，在減少炎癥反應(yīng)和纖維化中起著重要作用［15］。

2.3 Wnt/β-Catenin信號(hào)通路 Wnt/β-Catenin信號(hào)通路是啟動(dòng)纖維化的另一重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在細(xì)胞增殖、分化和再生中起作用，可調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生和器官、組織纖維化。Wnt蛋白是一種分泌型糖蛋白，Wnt信號(hào)途徑為Wnt蛋白與Frizzled家族的細(xì)胞膜受體和脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6結(jié)合，阻止β-Catenin的磷酸化和降解，引起胞內(nèi)β-Catenin積累，使其移位到細(xì)胞核，從而誘導(dǎo)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄［13］。研究發(fā)現(xiàn)，Wnt3a可以上調(diào)TGF-β和Smad2的表達(dá)，刺激成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變，提示W(wǎng)nt信號(hào)通路在纖維化過(guò)程中起著重要作用［16］。研究顯示，脂肪干細(xì)胞來(lái)源外泌體作為miR-21-5p的納米載體，可以激活Wnt/β-Catenin信號(hào)通路，上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶7（MMP-7）的表達(dá)［17］。MMP-7不僅可以影響ECM的重塑，還可通過(guò)Wnt/β-Catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在纖維化中發(fā)揮作用。miR-21-5p通過(guò)介導(dǎo)Wnt/β-Catenin信號(hào)通路促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和遷移，在體內(nèi)通過(guò)促進(jìn)再上皮化、膠原重塑、血管生成和血管成熟來(lái)促進(jìn)糖尿病患者創(chuàng)面愈合［17］。

2.4 其他信號(hào)通路 絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族參與的信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，目前已確定了4個(gè)傳統(tǒng)的MAPK亞家族包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）、c-Jun氨基末端激酶1-3（JNK1-3）、p38 MAPK以及最近發(fā)現(xiàn)的ERK5，其中ERK可調(diào)控細(xì)胞的多種生理功能，參與細(xì)胞增殖、分化、遷移和凋亡過(guò)程。研究顯示，間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體可被心肌細(xì)胞內(nèi)化，將miRNA轉(zhuǎn)移到心肌細(xì)胞中，其中miR-19a能夠下調(diào)心肌細(xì)胞第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶張力蛋白同源物基因（PTEN）和Bcl-2相互作用細(xì)胞死亡介導(dǎo)因子（Bim）的表達(dá)。PTEN是AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)調(diào)節(jié)分子，Bim是Bcl-2家族中重要的促凋亡因子；PTEN和Bim的減少可激活A(yù)KT和ERK信號(hào)通路，促進(jìn)心肌細(xì)胞生成和抑制凋亡，在細(xì)胞存活、增殖和凋亡中起重要作用［18］。

此外，本課題組前期通過(guò)高通量測(cè)序分析了正常牙齦來(lái)源外泌體及特發(fā)性牙齦纖維瘤來(lái)源外泌體中miRNA的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)了92個(gè)有明顯表達(dá)差異的miRNA。對(duì)表達(dá)差異的外泌體miRNA進(jìn)行通路預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其可能對(duì)PI3K/AKT和TGF-β等信號(hào)通路有調(diào)控作用，而這些信號(hào)通路也被報(bào)道與纖維化過(guò)程有關(guān)［19］。

綜上所述，外泌體來(lái)源miRNA能夠通過(guò)多種信號(hào)通路介導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖分化、間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化及細(xì)胞凋亡，進(jìn)而在纖維化疾病中發(fā)揮調(diào)控作用，未來(lái)有望成為纖維化疾病診斷的重要標(biāo)志物和治療的重要靶點(diǎn)。同時(shí)，外泌體可以將攜帶的miRNA通過(guò)旁分泌或自分泌方式傳遞給受體細(xì)胞，并在靶細(xì)胞中發(fā)揮促纖維化或抗纖維化作用，提示其也可作為遺傳物質(zhì)和藥物遞送的生物載體為治療纖維化疾病提供新的研究方向。