楊東鋒，李傳俠，王義義

1 天津市寧河區(qū)醫(yī)院，天津301500；2 天津市海河醫(yī)院

帕金森病（PD）是常見的神經(jīng)退行性疾病，目前尚缺乏有效治療手段，大多數(shù)患者會(huì)隨著疾病的不斷進(jìn)展喪失生活自理能為，給患者家庭和社會(huì)帶來精神和經(jīng)濟(jì)上的雙重負(fù)擔(dān)［1］。由于PD 發(fā)展至一定程度后較難控制，因此如何在疾病早期對疾病進(jìn)行有效的診斷和治療已成為臨床研究重點(diǎn)［2］?？扇苄粤馨图?xì)胞活化基因3（sLAG3）是淋巴細(xì)胞活化基因3（LAG3）的裂解產(chǎn)物。LAG3 可經(jīng)跨膜金屬蛋白酶介導(dǎo)裂解為sLAG3，sLAG3可在血液中穩(wěn)定表達(dá)，且其表達(dá)水平可較好的反映組織細(xì)胞中LAG3 的表達(dá)水平。近年來有研究［3］顯示，LAG3 可調(diào)控 PD 發(fā)病中的重要因子α-突觸核蛋白（α-Syn）的表達(dá)，可能在PD的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用。微小RNA（miR?NA）是一類內(nèi)源性的小分子單鏈RNA，具有較豐富的生物學(xué)功能，如調(diào)控細(xì)胞的分裂、參與免疫炎癥的調(diào)節(jié)等，目前已發(fā)現(xiàn)多種miRNA 與PD 的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，如 miR-7［4］、miR-133b［5］等。研究［6］顯示，miR-221 在阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病中異常表達(dá)。本研究觀察了血清sLAG3、miR-221 水平對PD患者的診斷效能，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年1月—2019年12月天津市寧河區(qū)醫(yī)院收治的PD 患者92 例，記為PD 組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①PD 診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《中國帕金森病的診斷標(biāo)準(zhǔn)（2016 版）》中的相關(guān)內(nèi)容［7］；②臨床資料完整；③未同時(shí)參與其他研究；④患者或其家屬對本次研究知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并有其他類型的腦部疾病，有明確的腦外傷史；②合并有惡性腫瘤者；③合并有嚴(yán)重的心、肝、腎等重要臟器功能障礙者；④合并有自身免疫性疾病者；⑤合并有嚴(yán)重感染者。另選取同期體檢健康志愿者50例作為對照組。PD 組92 例患者中，男58 例、女 34 例，年齡（61.23 ±10.26）歲，病程（3.67± 3.01）年，合并高血壓27例，合并糖尿病23 例，文化程度初中及以下40 例、高中38 例、大專及以上 14 例。對照組男 30 例、女 20 例，年齡（60.89±9.52）歲，合并高血壓11例，合并糖尿病10 例，文化程度初中及以下21 例、高中19 例、大專及以上10 例。PD 組和對照組的性別、年齡、文化程度、合并高血壓和合并糖尿病等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。所有PD 患者均采用帕金森病評定量表（UPDRS）評估病情的嚴(yán)重程度［8］，包括精神行為、情感障礙、日常生活、運(yùn)動(dòng)能力、治療的并發(fā)癥5 個(gè)部分。本研究主要選用其中的第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ部分，其中UPDRS Ⅰ評分、UPDRS Ⅱ評分、UPDRS Ⅲ評分分別代表了患者的精神活動(dòng)和情感障礙、日常生活能力及運(yùn)動(dòng)功能，各項(xiàng)目均分為5 個(gè)等級，計(jì)分為0～4 分，分?jǐn)?shù)越高表示癥狀越重。同時(shí)，依據(jù)Hoehn-Yahr 分級將患者進(jìn)行分組。Hoehn-Yahr 分級是根據(jù)患者的病情嚴(yán)重程度將其分成 0 期、1 期、1.5 期、2 期、2.5 期、3 期、4 期、5 期這8 個(gè)分期，分期越高代表病情越嚴(yán)重。92 例PD 患者中，1～2 期 38 例，納入到輕度組，2.5～3 期 30 例，納入到中度組，4～5 期 24 例，納入到重度組［9］。本研究經(jīng)天津市寧河區(qū)醫(yī)院倫理委員會(huì)同意并批準(zhǔn)。

1.2 兩組研究對象血清sLAG3 檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附法。收集所有研究對象的空腹靜脈血5 mL，采用離心機(jī)以3 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心10 min，移取上清液至EP 管，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清sLAG3 水平。Elisa 試劑盒購自英國Abcam 公司，Elx800 酶標(biāo)儀購自美國Biotek 公司，相關(guān)檢測均嚴(yán)格遵循對應(yīng)試劑盒的操作指南進(jìn)行。

1.3 兩組研究對象血清miR-221 檢測 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法。取離心后的血清，采用mir Vana RNA Isolation Kit 提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測定RNA 的濃度和純度，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄提取cDNA，利用7900HT 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 系統(tǒng)，以U6作為內(nèi)參基因進(jìn)行PCR 反應(yīng)。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s，共 40 個(gè)循環(huán)。引物序列如下：miR-221 上游引物為5′-GGACCACCGCT?CATCGCTAA-3′，下游引物為5′-GTTACTATATGC?CAAGCCCTAG-3′。U6 上游引物為 5′-CGCTTCG?GCAGCACATATAC-3′，下 游 引 物 為 5′-TTCAC?GAATTTGCGTGTCAT-3′。以 2-ΔΔCt表示血清中 miR-221的相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pear?son 相關(guān)分析法。采用受試者工作特征曲線（ROC）評價(jià)血清sLAG3、miR-221 水平對PD 的診斷效能。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組研究對象血清sLAG3 水平、miR-221 相對表達(dá)量比較 PD 組血清sLAG3 水平、miR-221 相對表達(dá)量分別為（932.54 ± 173.18）pg/mL、31.63 ±6.42，對照組分別為（705.96 ± 113.58）pg/mL、23.98± 4.89，兩組相比，P均＜0.001。

2.2 不同病情嚴(yán)重程度的PD 患者血清sLAG3 水平、miR-221 相對表達(dá)量比較 重度組血清sLAG3水平、miR-221 相對表達(dá)量分別為（1 048.88 ±126.87）pg/mL、37.08 ± 4.51，中 度 組 分 別 為（926.87 ± 163.52）pg/mL、32.03 ± 6.84，輕度組分別為（863.54 ± 142.67）pg/mL、27.87 ± 4.36，組間相比，P均＜0.05。

2.3 PD 患者血清 sLAG3 水平、miR-221 相對表達(dá)量與UPDRS 評分的相關(guān)性 PD 患者UPDRS Ⅰ評分、UPDRS Ⅱ評分、UPDRS Ⅲ評分分別為（4.91 ±1.58）分、（20.15 ± 8.36）分、（34.81 ± 12.54）分。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，PD 患者血清sLAG3 水平與UPDRS Ⅰ評分、UPDRS Ⅱ評分、UPDRS Ⅲ評分均呈正相關(guān)（r分別為0.384、0.426、0.453，P均＜0.05），血清miR-221相對表達(dá)量與UPDRS Ⅰ評分、UPDRS Ⅱ評分、UPDRS Ⅲ評分均呈正相關(guān)（r分別為0.421、0.378、0.352，P均＜0.05）。

2.4 血清sLAG3、miR-221 水平對PD 的診斷效能血清sLAG3 水平診斷PD 的曲線下面積為0.828（95%CI為0.762～0.894），取截?cái)嘀禐?87.62 pg/mL時(shí)，血清sLAG3水平診斷PD的敏感度為55.43%、特異度為94.00%。血清miR-221 水平診斷PD 的曲線下面積為 0.801（95%CI為 0.728～0.874），取截?cái)嘀禐?7.22 時(shí)，血清miR-221 水平診斷PD 的敏感度為71.74%、特異度為72.00%。取血清sLAG3 水平截?cái)嘀禐?87.62 pg/mL、miR-221 水平截?cái)嘀禐?7.22 時(shí)，血清 sLAG3 聯(lián)合 miR-221 水平診斷 PD 的敏感度為80.43%、特異度為76.00%。

3 討論

PD 又稱震顫麻痹，靜止性震顫是PD 患者常見的首發(fā)癥狀，除此之外，患者還常常出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)遲緩、肌強(qiáng)直、姿勢步態(tài)障礙、嗅覺障礙等臨床癥狀，嚴(yán)重影響患者的運(yùn)動(dòng)功能和日常生活，使得患者的生活質(zhì)量明顯降低［10］。PD 多發(fā)于中老年人，且其發(fā)病率會(huì)隨著年齡的增加而增加，近年來隨著我國老年化社會(huì)的到來，PD 患者的數(shù)量呈明顯上升的趨勢［11］?；颊叩呐R床癥狀是診斷PD 的重要依據(jù)，但PD 起病隱匿，通常需要在患者多巴胺能神經(jīng)元和（或）紋狀體內(nèi)多巴胺水平明顯減少時(shí)才會(huì)出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，因此在疾病早期進(jìn)行診斷存在一定的困難，臨床在診斷PD時(shí)易出現(xiàn)誤診、漏診的現(xiàn)象［12］。生物標(biāo)志物是傳統(tǒng)方法診斷疾病的重要補(bǔ)充，其在疾病中通常呈異常表達(dá)，可通過臨床檢驗(yàn)其表達(dá)水平來分析患病的可能性，且與臨床癥狀、評分量表等具有一定主觀因素的診斷手段相比，生物標(biāo)志物更加客觀，可減少主觀因素的干擾，近年來在輔助臨床診斷疾病上起到了重要作用。

LAG3 是一種編碼與CD4 同源的跨膜糖蛋白，LAG3 基因位于人染色體12p13.32 上，分布于活化的 T 淋巴細(xì)胞、NK 細(xì)胞、B 細(xì)胞、樹突樣細(xì)胞膜表面，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能和炎癥反應(yīng)的作用［13］。LAG3 可經(jīng)跨膜金屬蛋白酶介導(dǎo)裂解為sLAG3，sLAG3 可在血液中穩(wěn)定表達(dá)，且其表達(dá)水平可較好的反映組織細(xì)胞中LAG3 的表達(dá)水平。本研究結(jié)果顯示，PD 患者的血清sLAG3 水平明顯高于健康人群，且其表達(dá)水平與病程嚴(yán)重程度密切相關(guān)，提示sLAG3在PD患者血清中呈異常高表達(dá)，可能參與了疾病的發(fā)生發(fā)展。GUO 等［14］的研究表明，LAG3 的基因多態(tài)性與中國女性人群的PD 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。α-Syn 是PD 發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵因子，其可促進(jìn)線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激反應(yīng)，并能導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和特定的多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞死亡，α-Syn 在細(xì)胞間朊病毒樣傳播行為是PD 病理擴(kuò)散的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［15］。研究［3］顯示，LAG3是α-Syn的轉(zhuǎn)運(yùn)受體，多巴胺神經(jīng)元細(xì)胞膜表達(dá)的LAG3 可以和α-Syn 特異性結(jié)合，觸發(fā)內(nèi)吞作用進(jìn)入神經(jīng)元胞體，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，而在抑制LAG3 的表達(dá)后以上作用則明顯減少，提示LAG3 可能通過調(diào)控α-Syn 的傳播參與PD 的進(jìn)展。

miR-221是miR-221/222家族的一員，基因位于X 染色體的 p11.3 區(qū)［16］。近年來的研究［17］發(fā)現(xiàn)，miR-221 與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)，如阿爾茨海默病、膠質(zhì)瘤等。miR-221 作為miRNA 的一種亞型，其可在血液中穩(wěn)定表達(dá)，便于臨床檢測，符合作為輔助臨床診斷生物標(biāo)志物的基本條件。本研究結(jié)果顯示，PD 患者的血清miR-221 水平明顯高于健康人群，且其表達(dá)水平與病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)。周梅等［18］研究亦顯示，miR-221 在 PD 患者血清中呈異常高表達(dá)，與本研究結(jié)果一致。有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)［19］證實(shí)，HOX 轉(zhuǎn)錄反義RNA 主要是通過促進(jìn)miR-221 的表達(dá)來誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。神經(jīng)退行性疾病患者特定部位有明顯的鐵沉積，當(dāng)鐵含量增多時(shí)則會(huì)出現(xiàn)脂類過氧化反應(yīng)、自由基生成、線粒體功能異常等情況，促進(jìn) PD 的發(fā)生發(fā)展［20］。有相關(guān)研究［21］顯示，miR-211 可調(diào)節(jié)PD 模型中轉(zhuǎn)鐵蛋白受體2 的表達(dá)，影響鐵元素的積累，進(jìn)而在PD等神經(jīng)退行性病變疾病的發(fā)生發(fā)展中起到一定的作用。

本研究通過初步分析發(fā)現(xiàn)，sLAG3、miR-221 均在PD患者血清中呈異常表達(dá)，且表達(dá)水平與病情密切相關(guān)，二者均有作為診斷PD 生物標(biāo)志物的潛力。進(jìn)一步的 ROC 分析發(fā)現(xiàn)，血清 sLAG3、miR-221 對PD 的診斷價(jià)值較高，sLAG3 和 miR-221 的曲線下面積分別為0.828、0.801。然而單一指標(biāo)診斷通常具有一定的局限性，如sLAG3 診斷PD 的特異性雖然很高，但敏感度較低，發(fā)現(xiàn)真陽性的能力較弱，因此本研究進(jìn)一步分析了sLAG3、miR-221 聯(lián)合診斷的價(jià)值，結(jié)果顯示，聯(lián)合診斷可進(jìn)一步提高對PD 的診斷價(jià)值，敏感度和特異度均較單一指標(biāo)診斷時(shí)明顯提高。

綜上所述，PD 患者血清 sLAG3 水平、miR-221相對表達(dá)量均升高，與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)關(guān)系。檢測血清sLAG3、miR-221有助于PD的診斷。