官凌霄，高飛飛，王 華，2，3*，李 華，2，3

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，陜西楊凌 712100；3.國家林業(yè)和草原局葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，陜西楊凌 712100）

葡萄酒香氣是衡量葡萄酒感官質(zhì)量的重要指標(biāo)之一[1]。影響葡萄酒香氣的因素有很多，比如品種差異、氣候條件、釀造工藝等。在一定程度上，果實(shí)成熟度也會(huì)影響葡萄酒的香氣[2]，選擇一個(gè)最佳的葡萄采收期對(duì)于生產(chǎn)高品質(zhì)葡萄酒是至關(guān)重要的[3]。葡萄酒的典型風(fēng)味主要來源于葡萄果實(shí)中的揮發(fā)性化合物[4]。通過了解果實(shí)香氣的組成，可以鑒別葡萄的成熟度及品種特性[5]。在成熟過程中，果實(shí)香氣成分變化較大，所以研究者們通常希望通過果實(shí)風(fēng)味物質(zhì)檢測來了解原料成熟度及品質(zhì)變化，方便產(chǎn)品的質(zhì)量控制[6]。

北冰紅葡萄耐寒、抗病，可延遲至12月采收[7]，具有釀造紅冰葡萄酒的潛質(zhì)[8]。劉歡等[8]對(duì)通化地區(qū)的4種山葡萄品種進(jìn)行對(duì)比研究得出，北冰紅葡萄香氣物質(zhì)的種類和含量均最高，馥郁獨(dú)特，有奶酪香、花香、果香以及油脂等香氣。為了延長保鮮期、提高成熟度或釀造冰酒可以選擇延遲采收，但這并不適合所有葡萄，對(duì)果實(shí)品質(zhì)和生長特性有較高的要求[9]。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrom etry，GC-MS）方法廣泛用于分離、鑒定和量化風(fēng)味成分，頂空固相微萃取技術(shù)（headspace-solid phase microextraction，HS-SPME）是將風(fēng)味成分引入GC儀器的一種相對(duì)簡單的技術(shù)，適合葡萄與葡萄酒香氣的表征[10]。實(shí)驗(yàn)選取延遲采收的幾個(gè)時(shí)期，采用HS-SPME結(jié)合GC-MS的方法，并基于主成分分析（principal component analysis，PCA）和聚類分析（cluster analysis，CA）法對(duì)不同采收期北冰紅葡萄果實(shí)香氣成分進(jìn)行分析，討論渭北旱塬地區(qū)的北冰紅葡萄延遲采收的最佳時(shí)期，以期為北冰紅葡萄的推廣以及優(yōu)質(zhì)北冰紅葡萄酒的釀造提供理論參考，指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

北冰紅葡萄，2013年引種栽培于西北農(nóng)林科技大學(xué)合陽葡萄試驗(yàn)示范站，共10行，株行距1.0 m×2.5 m，籬形架，單干雙臂樹形，8月中旬成熟[11]。合陽葡萄試驗(yàn)示范站位于渭北旱塬地區(qū)，海拔708.8 m，屬于暖溫帶大陸性季風(fēng)氣候，2017年平均氣溫13.16 ℃，年降水量656.27 mm，年日照2 329.93 h。實(shí)驗(yàn)采用對(duì)角線五點(diǎn)取樣法進(jìn)行取樣，每點(diǎn)選取四株葡萄樹，每串葡萄分上、下、左、右、前、后進(jìn)行采樣，每次采樣500粒。采收期依次為：2017年9月20日（HT1）、10月20日（HT2）、11月20日（HT3）、12月10日（HT4），均為晴天。

沒食子酸、兒茶素、蘆?。兌染?8%）：美國Sigma公司；2-辛醇（純度≥98%）：上海源葉生物科技有限公司；福林酚（分析級(jí)）：北京索萊寶科技有限公司；甲醇（色譜級(jí)）：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉（分析純）：廣東光華科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

固相微相萃取頭（50/30 μm DVB/CAR/PDMS）：美國Supelo公司；GC-MS-QP2010 Ultra氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，Cary-60紫外-可見光光度計(jì)：日本島津公司；5424R離心機(jī)：德國Eppendorf 公司；KH-500DE超聲波清洗機(jī)：昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；610手持折光儀：上海淋譽(yù)貿(mào)易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 基本理化指標(biāo)測定方法

穗質(zhì)量、百粒質(zhì)量以及出汁率用電子天平稱量得出；參考王華[12]的方法，可溶性固形物采用便攜式手持折光儀測定，總酸采用NaOH 滴定法（以酒石酸計(jì)），還原糖采用斐林試劑滴定法（以葡萄糖計(jì)）；總花色苷采用pH示差法[13]，結(jié)果以mg/g花青素-3-O-葡萄糖苷表示；總酚（以沒食子酸計(jì)）采用福林-肖卡法[14]；單寧（以兒茶素計(jì)）采用甲基纖維素沉淀法[15]；總黃烷-3-醇（以兒茶素計(jì)）采用P-DMACA-鹽酸法[16]；總類黃酮（以蘆丁計(jì)）采用NaNO3-AlCl3比色法[17]。

1.3.2 香氣物質(zhì)測定方法

將100 g葡萄去籽放入研缽中，加入液氮冷凍后迅速手工研磨成粉，置于50 mL離心管中，靜置，4 ℃、10 000 r/min離心5 min，取上清液。在20 mL樣品瓶中加入1.5 g NaCl、5 mL上清液、10 μL 0.230 g/L 2-辛醇內(nèi)標(biāo)液，待用[18]。

色譜柱：DB-wax色譜柱（30 m×250 μm×0.25 μm）；升溫程序：起始溫度從40 ℃開始，保留4 min，再以4 ℃/min的速度升溫至120 ℃，以6 ℃/min的速度升至240 ℃，保留11 min；載氣：氦氣（He）；不分流進(jìn)樣；電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量70eV；離子源溫度230℃，接口溫度為230 ℃；質(zhì)譜掃描范圍為35～350 amu。

將檢測出的揮發(fā)性成分在美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）14譜庫、wiley及香精香料譜庫檢索比對(duì)，并結(jié)合保留指數(shù)進(jìn)行定性分析[19]。采用內(nèi)標(biāo)法[20]進(jìn)行半定量分析。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析和主成分分析（PCA）[21]，每份樣品3個(gè)重復(fù)，取平均值，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用Duncan 新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性分析，顯著差異P＜0.05，采用Origin 2018軟件進(jìn)行繪制柱狀圖和主成分分析載荷圖，采用Excel 2010軟件繪制表格，采用R語言pheatmap軟件繪制聚類熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同采收期對(duì)北冰紅葡萄理化指標(biāo)的影響

表1 不同采收期北冰紅葡萄的基本理化指標(biāo)Table 1 Basic physical and chemical index of Beibinghong grape with different harvest time

從表1可以看出，北冰紅葡萄果實(shí)的各類基本理化指標(biāo)具有顯著性差異（P＜0.05）。其中，隨采收期推遲，百粒質(zhì)量呈先增后減趨勢，穗質(zhì)量和出汁率呈逐漸減小的趨勢，原因可能在于掛果時(shí)間過長果實(shí)脫水造成；可溶性固形物、還原糖的含量呈逐漸增加的趨勢，滴定酸含量逐漸減小。此外，四個(gè)采收期的糖酸比均大于20。

對(duì)果實(shí)中多酚物質(zhì)含量進(jìn)行監(jiān)控非常重要[22]。從表1亦可以看出，除總單寧外，北冰紅葡萄的總酚、總類黃酮、總黃烷醇、總花色苷含量均呈先增后減的趨勢，并在11月20日達(dá)到峰值，依次為40.94 mg/g、31.70 mg/g、1.16 mg/g、15.94 mg/g。

2.2 不同采收期對(duì)北冰紅葡萄香氣成分的影響

由表2可知，渭北旱塬地區(qū)北冰紅葡萄共檢測出50種香氣物質(zhì)，可分為6類，其中酯類物質(zhì)種類最多，C6化合物總含量最高，與前人研究結(jié)果一致[23]。對(duì)比四個(gè)時(shí)期香氣物質(zhì)含量可以得出，隨采收期的推遲，香氣物質(zhì)總含量總體呈減少的趨勢，這種變化與成熟過程中天氣、溫度以及品種本身特性有很大的關(guān)系[24]。

表2 不同采收期北冰紅葡萄的香氣成分Table 2 Aroma components of Beibinghong grape with different harvest time

續(xù)表

圖1 不同采收期北冰紅葡萄香氣成分種類（A）及含量（B）Fig.1 Aroma components types (A) and contents (B) of Beibinghong grape with different harvest time

由圖1可知，酯類物質(zhì)是葡萄果香和花香的主要貢獻(xiàn)者[25]。隨采收期推遲，酯類物質(zhì)種類和含量均呈先增后減的趨勢，存在顯著差異。醇類物質(zhì)是葡萄香氣中比較重要的一類物質(zhì)[26]。隨著采收期的推移，醇類物質(zhì)的種類和含量均呈現(xiàn)遞減的趨勢。翟婉麗等[27]對(duì)楊凌地區(qū)媚麗葡萄采收期確定進(jìn)行研究，計(jì)算香氣數(shù)據(jù)可知，隨采收期推遲，酯類物質(zhì)種類含量呈先增后減趨勢，醇類物質(zhì)種類含量均呈遞減趨勢，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與其變化規(guī)律一致。醛酮類物質(zhì)是葡萄中重要的羰基化合物。酮類物質(zhì)能帶給葡萄花香、果香、油脂味等氣味。醛類物質(zhì)在葡萄中存在較多，在酒中會(huì)被還原成醇，不能穩(wěn)定存在[28]。不同采收期醛酮類物質(zhì)的種數(shù)和含量基本處于穩(wěn)定狀態(tài)，變化不大，該類物質(zhì)的種類和含量理論上無法為確定最佳采收期提供參考。C6化合物和苯衍生物在葡萄和葡萄酒中的含量很高[29]。其中C6化合物對(duì)葡萄香氣成分的貢獻(xiàn)較大[30]，是重要的風(fēng)味化合物[31]。本實(shí)驗(yàn)的C6化合物主要是指C6醇和C6醛。隨采收期推遲，C6化合物含量總體呈遞減的趨勢，苯衍生物的含量呈先減后增的趨勢。此外，還檢測到了一些C13-降異戊二烯類物質(zhì)以及萜烯類物質(zhì)。萜烯類化合物是感官評(píng)價(jià)的重要物質(zhì)，具有典型性，可作為葡萄的品種特征香氣[32]。C13-降異戊二烯類物質(zhì)主要由類胡蘿卜素降解產(chǎn)生[33]，氣味閾值極低，極易被感知出來，是重要的風(fēng)味物質(zhì)。

對(duì)表1中的50種香氣物質(zhì)進(jìn)行特征香氣分析。一般認(rèn)為氣味活度值（odor activity value，OAV）＞1的香氣物質(zhì)可能為該品種的特征香氣或主體香氣成分。根據(jù)OAV，即香氣濃度與香氣閾值的比值[34]，可以計(jì)算得出OAV＞1的香氣物質(zhì)有20種。其中辛酸乙酯、β-大馬士酮、己醛等香氣物質(zhì)的閾值較低或含量較高，它們的OAV遠(yuǎn)高于其他物質(zhì)，是重要的呈香物質(zhì)。

2.2.1 聚類分析

圖2 不同采收期北冰紅葡萄香氣成分聚類熱圖Fig.2 Clustering heat map of aroma components of Beibinghong grape with different harvest time

由圖2可以看出，不同采收期北冰紅葡萄的香氣主要可以聚為四類。其中，第Ⅰ類的香氣物質(zhì)（乙酸乙酯、月桂酸乙酯等）在HT3時(shí)期表現(xiàn)突出，說明這類香氣物質(zhì)含量隨采收期的推遲呈先增后減的趨勢，在11月達(dá)到最大值，結(jié)合表2感官特征可知，它們主要帶給北冰紅葡萄果香味；第Ⅱ類的香氣物質(zhì)比較復(fù)雜，乙酸己酯、橙花醇等在HT2時(shí)期比較突出，賦予北冰紅葡萄果香、花香等味道，反-2-壬烯醛、反-3-己烯醇等在前三個(gè)時(shí)期的含量均高于HT4時(shí)期，它們主要帶來青草的香味；第Ⅲ類香氣物質(zhì)（癸酸乙酯、棕櫚酸乙酯等）則相反是在HT4時(shí)期含量比較高；第Ⅳ類香氣物質(zhì)的含量在HT1時(shí)期最高，有香葉基丙酮、1-辛烯-3-醇等，賦予北冰紅葡萄花香等味道。從四個(gè)時(shí)期來看，HT2和HT3兩個(gè)時(shí)期的香氣輪廓更為接近，與HT4距離最遠(yuǎn)，差異較大。

2.2.2 主成分分析

由圖3可知，HT2和HT3時(shí)期的香氣物質(zhì)位于前兩個(gè)主成分的正向端，香氣復(fù)雜馥郁，根據(jù)數(shù)據(jù)點(diǎn)和處理點(diǎn)之間的距離以及數(shù)據(jù)點(diǎn)和處理點(diǎn)分別與原點(diǎn)構(gòu)成矢量之間的夾角可知，這兩個(gè)時(shí)期的香氣主要為乙酸乙酯、水楊酸甲酯、丁酸乙酯、異戊醇等十余種物質(zhì)，且這些物質(zhì)均與這兩個(gè)時(shí)期呈正相關(guān)關(guān)系。同時(shí)這些物質(zhì)也恰好位于聚類熱圖中的前兩類，亦說明主成分分析與聚類分析結(jié)果一致。對(duì)比HT2、HT3時(shí)期來看，HT1時(shí)期位于第二主成分的負(fù)向端，HT4位于第一主成分負(fù)向端，處理點(diǎn)與香氣數(shù)據(jù)點(diǎn)之間距離都比較遠(yuǎn)，且香氣成分簡單，總體表現(xiàn)不太突出，對(duì)于釀造香氣馥郁的葡萄酒，不建議在這兩個(gè)時(shí)期采收。綜上所述，渭北旱塬地區(qū)的北冰紅葡萄建議根據(jù)天氣情況選擇在HT2或HT3時(shí)期采收。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)以渭北旱塬地區(qū)4個(gè)不同時(shí)期采收的北冰紅葡萄為樣本，測定了相關(guān)基本理化指標(biāo)和香氣成分，通過比較各類香氣物質(zhì)總量，并結(jié)合聚類分析和主成分分析方法分析了各時(shí)期香氣成分特征。結(jié)果表明，HT2和HT3時(shí)期的香氣物質(zhì)更復(fù)雜馥郁，賦予北冰紅葡萄濃郁的果香和花香味道；同時(shí)參考基本理化指標(biāo)等相關(guān)數(shù)據(jù)來看，HT3時(shí)期北冰紅葡萄的各類酚類物質(zhì)含量均最高，有利于釀造優(yōu)質(zhì)葡萄酒。HT4時(shí)期北冰紅葡萄香氣的種類和數(shù)量均明顯少于其他幾個(gè)時(shí)期，這可能與葡萄干縮和天氣驟冷等變化有關(guān)，香氣物質(zhì)會(huì)隨果實(shí)干化程度不斷變化，但這可能不是北冰紅葡萄HT4時(shí)期香氣物質(zhì)種類含量降低的主要原因，而氣溫變化可能為影響因素之一。綜上所述，渭北旱塬地區(qū)北冰紅葡萄的建議最佳采收期為11月中下旬。