汪佳佳 胡慧敏 潘雪峰 陳霞 莊昕波 張濤 陳銀基

摘要：以小麥和大麥為材料，分別采用混合物提取法、乙醇提取法、異丙醇結合DTT提取法、異丙醇結合DTT兩步提取法、水—氯化鈉—乙醇三步提取法及水—氯化鈉—乙醇水浴提取法對小麥和大麥進行麩質蛋白提取，比較不同方法提取液中蛋白質的質量濃度，并進行SDS-PAGE分析比較其蛋白組成的差異。結果顯示，除水—氯化鈉—乙醇提取法不能完整提取小麥麩質蛋白，其余幾種方法均成功提取麩質蛋白?；旌衔锾崛》ā?0%乙醇提取法、異丙醇結合DTT提取法、70%乙醇提取法從大麥中提取的麩質蛋白質量濃度較高。混合物提取法提取液中SDS-PAGE條帶數(shù)最多，并且可以提取高分子量麥谷蛋白。

關鍵詞：小麥；大麥；麩質蛋白；提??；SDS-PAGE

中圖分類號：TS201.2 文獻標識碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20210224

小麥和大麥是面食的主要來源，也是必需氨基酸及許多生物活性成分的潛在來源[1-2]，其麩質蛋白主要由麥醇溶蛋白和麥谷蛋白組成，是麥類中的貯藏蛋白，約占麥類蛋白的80%[3]。當麩質蛋白與水混合時，麥醇溶蛋白通過形成分子內二硫鍵賦予面團延展性，麥谷蛋白通過形成分子間二硫鍵賦予面團黏彈性，二者的組成和結構會影響面團的形成及其制品烘焙品質。麩質蛋白是引起乳糜瀉的主要因素，研究[4]表明，麥醇溶蛋白中含有豐富的脯氨酸和谷氨酰胺，是麩質蛋白中最主要的抗原成分，能夠觸發(fā)免疫反應，其中包含刺激性表位最多的是α-/β-醇溶蛋白，能夠觸發(fā)免疫反應，導致乳糜瀉。

乳糜瀉（Celiac disease）是一種由T細胞介導的慢性小腸炎癥性疾病，由基因易感個體攝入小麥和大麥中的麩質蛋白引起[5]。乳糜瀉是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結果，遺傳因素主要包括人類白細胞抗原HLA-DQ2和HLA-DQ8，環(huán)境因素主要包括麩質蛋白上的T細胞表位和麩質蛋白中富含的脯氨酸[6]。根據(jù)血清學和活檢，估計全球乳糜瀉的平均患病率分別為1.4%和0.7%，但區(qū)域差異較大[7]。患者終生嚴格執(zhí)行無麩質飲食是目前治療乳糜瀉的唯一可靠方法。因此，探索和篩選高效的麩質蛋白提取方法對小麥和大麥麩質蛋白檢測與應用具有重要意義。

本研究選取混合物提取法[8]、60%乙醇提取法[9]、異丙醇結合DTT提取法[10]、異丙醇結合DTT兩步提取法[11]、70%乙醇提取法、水—氯化鈉—乙醇三步提取法[12]等麩質蛋白提取具有代表性的方法以及在三步提取法基礎上改進的水—氯化鈉—乙醇三步水浴提取法對小麥麩質蛋白進行提取，并對提取液進行SDS-PAGE分析，以期篩選高效適宜的麩質蛋白提取方法，為麩質蛋白檢測工作及無麩質食品研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥（過60目篩）：產(chǎn)自河南商丘；大麥（過60目篩）：產(chǎn)自吉林通化；Cocktail提取液：德國拜發(fā)公司；無水乙醇（分析純）：無錫市亞盛化工有限公司；異丙醇（分析純）、鹽酸（分析純）、丙酮（分析純）：南京化學試劑有限公司；氯化鈉（分析純）、冰醋酸（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；BSA標準品5×G250染色液、DTT（分析純）、5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液、PBS稀釋液、5×蛋白質上樣緩沖液、考馬斯亮藍R250、TEMED：北京索萊寶科技有限公司；AP（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；預染蛋白Marker：賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 主要儀器

THZ-82恒溫振蕩器：國華電器有限公司；DHG-90338S-Ⅲ型烘箱：中國上海滬粵明科學儀器有限公司；vortex_genie 2型渦旋混合器：美國Scientific Industries公司；TWS-24型四孔恒溫水浴鍋：上海喆圖科學儀器有限公司；TG16WS型高速臺式離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；SpectraMax 190型酶標儀：美國Molecular Devices公司；Mini-PROTEAN型電泳儀：美國BIO-RAD公司；ChemiDocTMXRS+型凝膠成像系統(tǒng)：美國BIO-RAD公司。

1.3 麩質蛋白的提取

1.3.1 混合物提取法

稱取0.1 g樣品，加入1 mL Cocktail提取液，渦旋混勻，于50 ℃孵育40 min。冷卻樣品，然后加入3 mL 80%乙醇，室溫條件下振蕩1 h。5 000 r/min離心10 min，收集上清液（樣品A）。

1.3.2 乙醇提取法

稱取0.1 g樣品，加入1 mL 60%或70%的乙醇溶液，渦旋混勻，振蕩提取2 h，7 000 r/min離心10 min，收集上清液。分別將60%和70%乙醇提取的樣品編號為B和C。

1.3.3 異丙醇結合DTT提取法

稱取0.1 g樣品，加入1 mL 50%異丙醇—1% DTT—50 mmoL/L Tris-HCl （pH 7.5），渦旋混勻，振蕩提取2 h，7 000 r/min離心10 min，收集上清液（樣品D）。

1.3.4 異丙醇結合DTT兩步提取法

稱取0.1 g樣品，加入50%異丙醇，渦旋混勻，超聲10 min，回旋振蕩30 min，7 000 r/min離心10 min，收集上清液1；向沉淀加入1 mL 50%異丙醇—1% DTT—50 mmoL/L Tris-HCl （pH 7.5），超聲10 min，60 ℃加熱30 min，每5 ～ 10 min混勻一次，7 000 r/min離心10 min，收集上清液2，沉淀再次用1 mL 50%異丙醇—1% DTT—50 mmoL/L Tris-HCl（pH 7.5）提取，步驟同上，得上清液3，合并3次上清液（樣品E）。

1.3.5 水—氯化鈉—乙醇三步提取法

稱取0.1 g樣品，加入1 mL蒸餾水，振蕩提取30 min，7 000 r/min離心10 min，棄上清液；加入1 mL 0.5 mol/L的NaCl溶液，振蕩提取30 min，7 000 r/min離心10 min，棄上清液；加入1 mL 70%乙醇溶液，振蕩提取30 min，7 000 r/min離心10 min，收集上清液（樣品F）。

1.3.6 水—氯化鈉—乙醇三步水浴提取法

稱取0.1 g樣品，加入1 mL蒸餾水，超聲10 min，于水浴中提取40 min，每5 ～ 10 min混勻一次，7 000 r/min離心10 min，棄上清液；加入1 mL0.5mol/L的NaCl溶液，超聲10 min，于水浴中提取40 min，每5 ～ 10 min混勻一次，7 000 r/min離心10 min，棄上清液；加入1 mL 70%乙醇溶液，超聲10 min，于水浴中提取40 min，每5 ～ 10 min混勻一次，7 000 r/min離心10 min，收集上清液。分別將40、50、60 ℃下水浴提取的樣品編號為G40、G50、G60。

以上方法提取的蛋白質均置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 麩質蛋白質量濃度的測定

采用Bradford法。取出冷凍保存的蛋白樣品，待其恢復至室溫，渦旋混勻，用PBS稀釋液將各樣品稀釋5倍，渦旋混勻；取BSA蛋白標準品10 μL，用PBS稀釋液稀釋至250 μL，使溶液最終質量濃度為0.2 mg/mL。取2 mL 5×G250染色液，加入8 mL超純水，混勻成1×G250染色液。將標準品按0、2、4、6、8、12、16、20 μL分別加到96孔板中，加PBS稀釋液補足到20 μL；將各樣品加20 μL到96孔板中，每孔均做3組平行。每孔加入200 μL 1×G250染色液，室溫放置3 ～ 5 min。用酶標儀測定A595 nm值。最后，根據(jù)標準曲線計算出樣品中蛋白質量濃度。

1.5 SDS-PAGE電泳分析

取出冷凍保存的蛋白質樣品，待其恢復至室溫，渦旋混勻，每個樣品加入4倍體積100%丙酮，-20 ℃冷凍過夜。第2天取出樣品，升溫至4 ℃，10 000 r/min離心15 min，棄上清液，沉淀樣品在50 ℃烘箱中干燥。

向沉淀中加入200 μL稀釋后的1×蛋白質上樣緩沖液，100 ℃加熱5 min，取5 μL上樣。采用10%的分離膠和4%的濃縮膠，電泳條件為恒流電壓80 V。電泳完畢后，用10%三氯乙酸溶液固定15 min，固定后用考馬斯亮藍R-250對蛋白進行染色過夜，脫色液脫色6 h，用凝膠成像系統(tǒng)成像。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗中數(shù)據(jù)用軟件SPSS 16.0進行分析，采用ANOVA分析，并通過Duncan’s法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 提取方法對提取液中麩質蛋白質量濃度的影響

不同提取方法提取小麥和大麥中麩質蛋白的質量濃度如表1所示。從表1可以看出，不同提取方法對同一種谷物麩質蛋白提取效果不同，同種方法對不同谷物麩質蛋白的提取效果有較大差異?；旌衔锾崛》?、60%乙醇提取法、70%乙醇提取法和異丙醇結合DTT提取法提取大麥中麩質蛋白的質量濃度高于小麥中麩質蛋白的質量濃度；異丙醇結合DTT兩步提取法、水—氯化鈉—乙醇三步提取法和水—氯化鈉—乙醇水浴提取法提取小麥中麩質蛋白的質量濃度顯著高于大麥中麩質蛋白的質量濃度。

不同提取方法提取小麥麩質蛋白的結果顯示，60%乙醇提取與混合物提取法、異丙醇結合DTT提取法、異丙醇結合DTT兩步提取法、水—氯化鈉—乙醇三步提取法及水—氯化鈉—乙醇水浴40 ℃提取的麩質蛋白質量濃度有顯著性差異（P<0.05）。水—氯化鈉—乙醇三步提取法和混合物提取法提取的麩質蛋白質量濃度較前面的幾種方法差，但是高于水—氯化鈉—乙醇三步水浴40 ℃提取和異丙醇結合DTT兩步提取法。異丙醇結合DTT提取法對小麥麩質蛋白的提取效果最差。

不同提取方法提取大麥中麩質蛋白的結果顯示，混合物提取法、60%乙醇提取、70%乙醇提取的麩質蛋白質量濃度無顯著性差異（P>0.05），但是與其他6種方法差異顯著（P<0.05）。水—氯化鈉—乙醇三步提取法效果較差，水—氯化鈉—乙醇三步水浴提取法中，40 ℃提取的麩質蛋白質量濃度最高，與小麥的恰好相反。

2.2 SDS-PAGE電泳分析

2.2.1 條帶數(shù)比較

采用ImageJ軟件分析得到的不同提取方法電泳條帶數(shù)如表2所示。從表2可以看出，混合物提取法和水—氯化鈉—乙醇三步提取法提取得到的小麥中麩質蛋白條帶數(shù)較多，乙醇和異丙醇提取法得到的條帶數(shù)較少。對于大麥麩質蛋白的提取，混合物提取法得到的條帶數(shù)最多，其他幾種方法差異不大。

2.2.2 圖譜分析

對不同提取方法提取的小麥和大麥麩質蛋白進行SDS-PAGE鑒定，結果如圖1所示。

從圖1（a）可以看出，大部分方法提取出來的高分子量麥谷蛋白為3個條帶。D、G40、G50、G60 4個樣品的條帶顏色較淺，可能是高分子質量麥谷蛋白含量較低。水—氯化鈉—乙醇三步水浴提取法中不同水浴溫度所得條帶有所差異，其中50 ℃水浴得到的條帶顏色最深，40、60 ℃水浴得到的顏色較淺，可能是50 ℃條件下提取的高分子質量麥谷蛋白含量最高。水—氯化鈉—乙醇三步提取法的樣品在80 ～ 130 kDa條帶缺失，可能是此樣品中的高分子質量麥谷蛋白含量非常低。

分子量為50 ～ 70 kDa的區(qū)間主要分布的是ω-醇溶蛋白（50 ～ 70 kDa）和D-型低分子質量麥谷蛋白（50 ～ 60 kDa），二者存在交叉，很難被清晰地區(qū)分開。所有方法提取的蛋白在D-型低分子質量麥谷蛋白區(qū)域存在條帶，但無分子質量較高的ω-醇溶蛋白（60 ～ 70 kDa）。從整個ω-醇溶蛋白和D-型低分子質量麥谷蛋白區(qū)域可知，幾種方法提得的蛋白質差異性不大。

分子質量為30 ～ 50 kDa的區(qū)間主要分布的是低分子質量麥谷蛋白和α-，β-，γ-醇溶蛋白。其中B-型低分子質量麥谷蛋白主要分布在40 ～ 50 kDa，C-型低分子質量麥谷蛋白主要分布在30 ～ 40 kDa，α-，β-，γ-醇溶蛋白主要分布在30 ～ 45 kDa。由于低分子質量麥谷蛋白和α-，β-，γ-醇溶蛋白的分子質量區(qū)間存在交叉，因而想要嚴格地區(qū)分出各種蛋白，存在一定難度。從圖1可以看出，分子質量在40 ～ 50 kDa蛋白差異較小，樣品B、C、E及G50的蛋白在30 ～ 40 kDa條帶顏色更深。

30 kDa以下區(qū)域，水—氯化鈉—乙醇三步提取法提得的蛋白條帶較少，顏色較淺，其余幾種方法條帶更多，顏色更深。有研究[13—14]證明，提取液中加入的還原劑會影響免疫反應，但還原劑DTT或β-巰基乙醇能提高麥谷蛋白的提取效率，而混合物提取法所用的Cocktail提取液中β-巰基乙醇和胍氯化物以1∶100稀釋后不會影響免疫反應。

從圖1（b）可以看出，混合物提取法對醇溶蛋白的提取效果較好，條帶清晰，除混合物提取法和異丙醇結合DTT兩步提取法提取出了高分子質量谷蛋白外，其余幾種方法均未能提取，但對醇溶蛋白的提取量都較高，無顯著差別。綜上，水—氯化鈉—乙醇三步提取法提取的麩質蛋白量較少，其余幾種方法提取的量較高；幾種方法均不能很好地提取出大麥中的高分子質量谷蛋白，相對而言異丙醇結合DTT提取法對高分子質量谷蛋白的提取效果最佳。

3 結 論

采用9種不同的方法提取小麥和大麥中的麩質蛋白，并對其提取效果進行比對分析，結論如下：除水—氯化鈉—乙醇提取法不能完整提取小麥麩質蛋白，其余幾種方法均成功提取麩質蛋白。采用Bradford法測定蛋白濃度結果顯示，60%乙醇提取法和70%乙醇提取法提得的小麥中麩質蛋白濃度最高，是提取小麥麩質蛋白的最優(yōu)的兩種方法；對于大麥中麩質蛋白的提取，70%乙醇提取法提得的蛋白濃度最高，異丙醇結合DTT法次之。而混合物提取法提取小麥和大麥中麩質蛋白得到SDSPAGE條帶數(shù)最多，顯示混合物提取法可以提取麥類中高分子量麥谷蛋白。

參 考 文 獻

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Wang Jiajia1， Hu Huimin2， Pan Xuefeng1， Chen Xia3， Zhuang Xinbo1， Zhang Tao1， Chen Yinji1

（ 1. School of Food Science and Engineering， Nanjing University of Finance and Economics， Nanjing， Jiangsu 210023； 2. Anhui Yunyan Food Technology Co.， Ltd.， Xuancheng， Anhui 341881；

3. Agricultural and Rural Bureau of Gaochun District， Nanjing， Jiangsu 211300 ）

Abstract： Gluten of wheat and barley were extracted by nine extraction methods， SDS-PAGE was applied to separate and compare the extraction results. The results revealed that the extraction method of H2O-NaCl-ethanol could not completely extract gluten proteins， While other methods were successful. Mixture extraction， 60% ethanol extraction， Isopropanol/DTT extraction and 70% ethanol extraction obtained higher gluten content in barley. The mixture extraction method extracts the largest number of SDS-PAGE bands in grains and can extract high-molecular-weight glutenin.

Key words： wheat， barley， glulen protein， extraction method， SDS-PAGE