車(chē)美玲 孟宏杰 唐培安 王康旭

摘要：為探明角蛋白相關(guān)基因——KAP19-2在害蟲(chóng)磷化氫（PH3）抗性產(chǎn)生中的作用，以赤擬谷盜為研究對(duì)象，利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)解析角蛋白相關(guān)基因KAP19-2在赤擬谷盜不同發(fā)育時(shí)期、不同抗性種群及PH3脅迫后的表達(dá)模式。定量結(jié)果表明：KAP19-2主要在剛羽化3 h后的成蟲(chóng)體內(nèi)大量表達(dá)，是蛹期平均表達(dá)水平的22.79倍，與其他發(fā)育時(shí)期表達(dá)量均存在顯著性差異；同時(shí)，該基因在抗性種群的表達(dá)量高于敏感種群，并具有顯著性差異，其相對(duì)表達(dá)量與赤擬谷盜不同抗性種群的抗性倍數(shù)呈正相關(guān)。在PH3脅迫處理?xiàng)l件下，KAP19-2基因在敏感種群處理6 h后的相對(duì)表達(dá)量最低，在抗性種群處理20 h后的相對(duì)表達(dá)量最低。因此認(rèn)為該基因參與PH3抗性形成。

關(guān)鍵詞：赤擬谷盜；角蛋白；磷化氫抗性；KAP19-2

中圖分類(lèi)號(hào)：S379.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.20210225

赤擬谷盜（Tribolium castaneum）是一種危害性強(qiáng)的世界性?xún)?chǔ)糧害蟲(chóng)，通過(guò)直接取食、糞便污染及加速霉變等方式對(duì)儲(chǔ)糧進(jìn)行危害。在儲(chǔ)藏物害蟲(chóng)防治方面，磷化氫（PH3）具有高毒力、低殘留、無(wú)植物毒性、使用方便等特點(diǎn)，是防治儲(chǔ)藏物害蟲(chóng)性能最優(yōu)良的熏蒸劑之一。赤擬谷盜在國(guó)內(nèi)倉(cāng)庫(kù)通常使用PH3熏蒸處理進(jìn)行防治，由于長(zhǎng)期單一使用，導(dǎo)致赤擬谷盜PH3抗性日益嚴(yán)重，對(duì)國(guó)儲(chǔ)糧安全構(gòu)成重大威脅[1-4]。轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究表明，赤擬谷盜不同PH3抗性種群基因表達(dá)量存在明顯差異，其中包括角蛋白相關(guān)基因KAP19-2，該基因在赤擬谷盜PH3抗性種群為上調(diào)基因[4]，但其在PH3抗性行成中的功能尚不清楚。

角蛋白是纖維結(jié)構(gòu)蛋白家族之一，它是構(gòu)成頭發(fā)、角、爪和人體皮膚外層的主要蛋白質(zhì)。角蛋白可保護(hù)上皮組織細(xì)胞免受損傷或壓力。角蛋白單體組成束以形成中間纖維蛋白[5]。早期研究認(rèn)為中等纖維（Intermediate Filament，IF）僅存于脊椎動(dòng)物細(xì)胞中[6]，陳新華等[7]通過(guò)免疫印跡等實(shí)驗(yàn)表明斜紋夜蛾和甜菜夜蛾細(xì)胞中的IF主要由角蛋白組成。角蛋白KAPs被認(rèn)為是與毛質(zhì)性狀相關(guān)的蛋白家族，研究的對(duì)象集中于家兔、綿羊和人等，研究的內(nèi)容多見(jiàn)于遺傳多樣性方面[8]。本實(shí)驗(yàn)采用熒光定量PCR技術(shù)探究赤擬谷盜KAP19-2基因的發(fā)育表達(dá)模式，預(yù)測(cè)特定基因在赤擬谷盜不同發(fā)育時(shí)期的作用及功能；分析該基因在PH3脅迫前后的表達(dá)模式，從分子生物學(xué)的角度驗(yàn)證相關(guān)基因在PH3抗性形成的作用，為揭示赤擬谷盜PH3抗性形成機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 供試蟲(chóng)源

本實(shí)驗(yàn)選用采自5個(gè)不同地區(qū)的赤擬谷盜種群，分別為蘇州胥口（XK）、云南西雙版納（YN）、常德金健（JJ）、成都（CD）、深圳（SZ），并已在南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院儲(chǔ)糧害蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室連續(xù)培養(yǎng)，試蟲(chóng)飼養(yǎng)和設(shè)備使用參照文獻(xiàn)[3]描述的操作方式進(jìn)行，試蟲(chóng)詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

1.1.2 主要試劑和儀器

HiScript？ II 1st Strand cDNA Synthesis Kit、ChamQTM SYBR？ Qpcr Master Mix：南京諾唯贊生物科技股份有限公司；Loading Buffer（Takara），50×TAE（Solarbio），Trizol？ Reagent（分析純，Invitrogen），瓊脂糖（HyAgarose），三氯甲烷、無(wú)水乙醇、異丙醇（分析純），濃硫酸（優(yōu)級(jí)純），

Zn3P2。

7500型熒光定量PCR儀：賽默飛世爾科技有限公司；BSC-250型恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；Hamilton 7000型氣密性注射器：北京英偉達(dá)科技有限公司；HL-200- PH3型PH3氣體報(bào)警儀：北京佳糧科貿(mào)有限公司。

1.2 試蟲(chóng)處理

不同發(fā)育時(shí)期樣本收集（供試蟲(chóng)源：XK）：將帶有卵的飼料在適宜飼養(yǎng)條件下培養(yǎng)至孵化，收集足量（數(shù)百頭）1齡幼蟲(chóng)，部分置于液氮中冷凍保存?zhèn)溆茫溆嘤紫x(chóng)置于添加飼料的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，待其蛻皮后，收集足量的2齡幼蟲(chóng)，按照上述方法保存及培養(yǎng)，依次收集足量的3、4、5齡幼蟲(chóng)，預(yù)蛹，5日齡蛹，羽化后3 h、7 d成蟲(chóng)（羽化7 d后，試蟲(chóng)發(fā)育趨于成熟[9] ）。每個(gè)樣本均設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

不同抗性種群樣本收集（供試蟲(chóng)源：XK、YN、JJ、CD、SZ）：挑選羽化后7 d左右的赤擬谷盜成蟲(chóng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)（無(wú)性別區(qū)分）。PH3氣體制備：由Zn3P2粉末和10%的硫酸反應(yīng)生成PH3氣體，采用聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）推薦的PH3發(fā)生裝置收集氣體，氣體發(fā)生裝置見(jiàn)圖1。使用PH3氣體檢測(cè)儀測(cè)定氣體濃度。

PH3脅迫：對(duì)YN和SZ種群的試蟲(chóng)進(jìn)行PH3脅迫處理。在生物測(cè)定的基礎(chǔ)上，選擇試蟲(chóng)的LC30作為PH3脅迫濃度，并設(shè)置不同的時(shí)間梯度，采用熏蒸法進(jìn)行脅迫處理，具體方法：將每個(gè)種群至少50頭羽化后7～10 d的成蟲(chóng)放入熏蒸瓶中，并密封，根據(jù)試蟲(chóng)的亞致死濃度，用氣密性注射器抽取一定量的PH3氣體（YN：17 μL；SZ：5 mL），分別注入各熏蒸瓶中，用蠟封注射口，然后將其置于溫度（30±1）℃、濕度（75±5）%、無(wú)光照的培養(yǎng)箱中密閉熏蒸。分別處理1、2、6、12、20 h。PH3脅迫結(jié)束后，迅速挑選生理狀態(tài)良好的赤擬谷盜，分別置于凍存管中，做好標(biāo)記，并置于液氮中冷凍保存?zhèn)溆?。以未處理? h）的試蟲(chóng)作為空白對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.3 試蟲(chóng)總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成

采用Trizol 法[10]提取上述收集和處理的試蟲(chóng)的總RNA，用酶標(biāo)儀測(cè)定RNA濃度和純度，并通過(guò)1%的瓊脂糖凝膠電泳，觀察條帶是否清晰完整，以便進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。然后按照HiScript？Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，合成cDNA，并放于-20 ℃冰箱保存。

1.4 內(nèi)參基因的選擇及定量PCR引物設(shè)計(jì)

參照文獻(xiàn)[11]使用RPS6作為試蟲(chóng)不同發(fā)育時(shí)期定量實(shí)驗(yàn)的內(nèi)參基因；選擇雙內(nèi)參組合：RPS18和RPL13作為不同抗性種群試蟲(chóng)定量實(shí)驗(yàn)的內(nèi)參基因。使用NCBI中的Primer-Blast設(shè)計(jì)用于熒光定量PCR的所有引物。定量引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。相關(guān)引物、內(nèi)參基因序列見(jiàn)表2。

1.5 熒光定量PCR

熒光定量PCR反應(yīng)采用ChamQTM SYBR？ qPCR Master Mix（Low Rox Premixed）試劑盒，使用ABI 7500 PCR系統(tǒng)（Applied Biosystems，USA）進(jìn)行qPCR，對(duì)角蛋白相關(guān)基因KAP19-2的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)中的每個(gè)種群設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。每個(gè)熒光定量PCR反應(yīng)對(duì)3個(gè)重復(fù)樣品（生物重復(fù)）進(jìn)行3次（技術(shù)重復(fù)），按照試劑盒說(shuō)明書(shū)配制溶液，操作方法參考文獻(xiàn)[3]。

1.6 基因引物篩選及驗(yàn)證

使用1%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度和電泳條帶數(shù)目判斷引物是否有非特異性，使用ABI 7500 PCR系統(tǒng)（Applied Biosystems，USA）進(jìn)行qPCR，根據(jù)熔解曲線的單一性判斷引物的特異性。取樣品的cDNA模板，將其依次稀釋5個(gè)濃度梯度，測(cè)定并計(jì)算PCR擴(kuò)增效率（E）和相關(guān)系數(shù)（R2）。擴(kuò)增效率按式（1）計(jì)算。綜合參考引物特異性驗(yàn)證的結(jié)果與引物擴(kuò)增效率，最終篩選出用于熒光定量PCR的最佳引物。

E = （10-1/K-1） × 100% （1）

式中：E為擴(kuò)增效率，%；K為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均數(shù)±SD表示，運(yùn)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用單因素方差分析（One-Way ANOV）中的Turkey式多重比較法，對(duì)赤擬谷盜3條表皮相關(guān)基因在不同發(fā)育時(shí)期和不同組織的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行差異顯著性分析（P = 0.05，置信區(qū)間為95%）。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA質(zhì)量分析

圖2為提取的赤擬谷盜不同發(fā)育時(shí)期、不同種群赤擬谷盜的總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。由圖2可知，RNA條帶清晰明亮，無(wú)彌散現(xiàn)象，酶標(biāo)儀檢測(cè)得OD260/OD280均在1.8～2.2的范圍內(nèi)，說(shuō)明RNA完整性良好、未降解，可作為合成cDNA模板。

2.2 引物特異性驗(yàn)證和擴(kuò)增效率分析

采用普通PCR擴(kuò)增角蛋白KAP19-2基因和3個(gè)內(nèi)參基因，并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增片段，擴(kuò)增片段符合預(yù)期，條帶單一且清晰明亮，表明無(wú)引物二聚體等現(xiàn)象，所設(shè)計(jì)的引物具有特異性。使用ABI 7500 PCR系統(tǒng)對(duì)引物進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶解曲線分析（圖3），可以發(fā)現(xiàn)，每條引物的熔解曲線都是單一峰，且4對(duì)引物的相關(guān)系數(shù)在0.997～0.998，擴(kuò)增效率在99.92%～102.70%（表3），符合PCR對(duì)特異性引物的試驗(yàn)要求，可用于后續(xù)定量試驗(yàn)。

2.3 赤擬谷盜KAP19-2基因在不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)模式分析

赤擬谷盜角蛋白KAP19-2基因在試蟲(chóng)不同發(fā)育時(shí)期的相對(duì)表量如圖4所示。角蛋白相關(guān)基因KAP19-2主要在剛羽化成蟲(chóng)期大量表達(dá)，是蛹期平均表達(dá)水平的22.79倍，與其他發(fā)育時(shí)期表達(dá)量均存在顯著性差異（P<0.05）；其他發(fā)育時(shí)期表達(dá)量較少。

2.4 赤擬谷盜KAP19-2基因在不同PH3抗性種群的表達(dá)模式分析

赤擬谷盜角蛋白KAP19-2基因在不同PH3抗性種群的相對(duì)表達(dá)水平如圖5所示。由圖5可知，KAP19-2基因在抗性種群的表達(dá)量高于敏感種群且具有顯著性差異（P<0.05），且該基因的相對(duì)表達(dá)量與抗性倍數(shù)呈正相關(guān)。

2.5 赤擬谷盜KAP19-2基因在PH3脅迫下的表達(dá)模式分析

敏感（YN）和抗性（SZ）種群赤擬谷盜KAP19-2基因在PH3脅迫前后的相對(duì)表達(dá)水平如圖6所示。由圖6可知：敏感種群KAP19-2基因處理1 h和6 h后，與未處理組（0 h）相比其相對(duì)表達(dá)量顯著下降（P<0.05）?？剐苑N群KAP19-2基因經(jīng)PH3處理不同時(shí)間后，其相對(duì)表達(dá)量呈先上升再下降的趨勢(shì)，在處理20 h時(shí)出現(xiàn)最低值，相比未處理組（0 h）差異顯著（P<0.05）；該基因在脅迫前后的相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著性差異（P>0.05）。PH3脅迫對(duì)該基因在敏感和抗性種群中的表達(dá)模式具有不同的影響。

3 討 論

赤擬谷盜角蛋白相關(guān)基因KAP19-2主要在羽化3 h的成蟲(chóng)期大量表達(dá)，在其他發(fā)育時(shí)期表達(dá)量較低，幼齡成蟲(chóng)到羽化3 h的成蟲(chóng)階段KAP19-2表達(dá)量上升了近44倍。轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究表明該基因在赤擬谷盜磷化氫抗性種群中為上調(diào)基因，并有研究[12]猜測(cè)該基因在節(jié)肢動(dòng)物中促進(jìn)入侵微生物在損傷部位的固定。趙濛等[8]研究發(fā)現(xiàn)阿爾巴斯白絨山羊KAP3.1基因在毛囊興盛期較低表達(dá)，在退行期前表達(dá)量達(dá)到頂峰，退行期后表達(dá)水平逐漸降低，說(shuō)明此類(lèi)基因在生長(zhǎng)過(guò)程中表達(dá)量均會(huì)發(fā)生明顯變化，猜測(cè)KAP19-2在赤擬谷盜生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮了作用。

赤擬谷盜角蛋白相關(guān)基因KAP19-2在磷化氫抗性種群中表達(dá)量呈上調(diào)趨勢(shì)，在抗性種群的相對(duì)表達(dá)量顯著高于敏感種群。由此推測(cè)，KAP19-2可能參與了赤擬谷盜磷化氫抗藥性的形成。角蛋白具有很強(qiáng)的抗?fàn)繌埿阅埽趧?dòng)物體內(nèi)起保護(hù)作用[13]。金梅等[14]發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)外源干擾，在毛囊發(fā)育的不同時(shí)期利用K26及KAP26.1基因過(guò)表達(dá)對(duì)其他基因的影響調(diào)控絨毛細(xì)度，影響發(fā)育周期。KAP19-2和KAP26.1屬于同一個(gè)家族的角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白，其功能可能相似，均影響了動(dòng)物的正常發(fā)育。為了進(jìn)一步驗(yàn)證KAP19-2基因是否介導(dǎo)赤擬谷盜磷化氫抗藥性的形成，利用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)磷化氫敏感和抗性種群赤擬谷盜KAP19-2基因在磷化氫脅迫前后的表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果表明：受磷化氫脅迫后KAP19-2在敏感種群中的表達(dá)量呈波動(dòng)變化，無(wú)明顯規(guī)律；在抗性種群中總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在2 h相對(duì)表達(dá)量達(dá)到峰值，提示磷化氫脅迫可能對(duì)抗性種群具有一定誘導(dǎo)作用，但是長(zhǎng)時(shí)期誘導(dǎo)后表達(dá)量迅速下降，可能會(huì)使抗性種群對(duì)磷化氫敏感，降低抵御磷化氫毒性的能力，這有待進(jìn)一步的研究。

參 考 文 獻(xiàn)

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Keratin Related Gene KAP19-2 of Tribolium Castaneum Participates in the Mechanism of Phosphine Resistance

Che Meiling， Meng Hongjie， Tang Peian， Wang Kangxu

（ School of Food Science and Engineering， Nanjing University of Finance and Economics/Jiangsu Modern Grain Circulation and Security Coordination Innovation Center， Nanjing， Jiangsu 210023 ）

Abstract： To study the role of keratin-associated protein 19-2 （KAP19-2） in phosphine resistance of pests， this paper took T. castaneum as the research object， analyzed the expression pattern of keratin-related gene KAP19-2 in different development stages， different resistant populations and PH3 stress by Fluorescent quantitation PCR technology. The quantitative results showed that KAP19-2 was mainly expressed in adults just 3 hours after emergence， which was 22.79 times of the average expression level in pupal stage， and there were significant differences between KAP 19-2 and other developmental stages. At the same time， the expression level of the gene in the resistant population is higher than that in the sensitive population， and there is a significant difference， and its relative expression level is positively correlated with the resistance multiple of different resistant populations of T. castaneum. Under the condition of PH3 stress， the relative expression of KAP19-2 gene was the lowest in sensitive population after 6h treatment and the lowest in resistant population after 20 h treatment. Therefore， it is considered that this gene is involved in the formation of PH3 resistance， but its specific mechanism needs further study.

Key words： T. castaneum， keratin， phosphine resistance， KAP19-2