路穎慧 康念欣 袁炎炎 李晴霞 譚鵬

摘要 目的：評價不同比例黃連-吳茱萸配伍提取物對秀麗隱桿線蟲的毒性效應(yīng)。方法：以秀麗隱桿線蟲為模式生物，制備不同比例黃連-吳茱萸配伍水提物，測定各水提物對秀麗隱桿線蟲壽命、體長及運(yùn)動行為的影響。每組30條線蟲觀察存活率，每天在相同時間觀察線蟲數(shù)量，以最后一條線蟲死亡時間作為最長壽命;每組40條線蟲觀察體長，用Image J軟件測量死亡線蟲虛擬體長;每組30條線蟲觀察頭尾擺動和身體彎曲頻率，測定1 min內(nèi)線蟲頭部擺動的次數(shù)（從一側(cè)擺向另一側(cè)再擺回來）和20 s內(nèi)身體彎曲的次數(shù)（認(rèn)為線蟲相對于身體的長軸移動一個正弦周期的波長為1次身體彎曲）。結(jié)果：與黃連組比較，隨吳茱萸相對比例增加，秀麗隱桿線蟲的死亡率顯著降低（P<0.01）;體長顯著減少（P<0.01）;對秀麗隱桿線蟲的運(yùn)動行為沒有明顯的抑制作用。結(jié)論：吳茱萸在一定程度上能夠降低黃連對秀麗隱桿線蟲的毒性，延長其壽命;在生長發(fā)育和神經(jīng)方面影響較小，本研究為黃連和吳茱萸的配伍與炮制減毒研究提供了新的方法。

關(guān)鍵詞 黃連;吳茱萸;秀麗隱桿線蟲;壽命;體長;運(yùn)動行為;毒性;炮制減毒

Abstract Objective：To evaluate the toxic effects of different proportions of Coptidis Rhizoma and Tetradium ruticarpum extracts on Caenorhabditis elegans.Methods：Coptidis Rhizoma was used as model organism and preparing water extracts of Coptidis Rhizoma and Tetradium ruticarpum in different proportions。Assessing the effects of various water extracts on the survival rate，body length，head and tail swinging frequency and body bending frequency of C.elegans.The number of 30 C.elegans were observed and counted at the same time every day，and the death time of the last C.elegan was taken as the maximum life span.The body length of 40 C.elegans was measured by Image J software after C.elegans were killed in the oven and photographed.Counting the number of head and tail swinging frequency of 30 C.elegans in 1min（from one side to the other and back again） and the number of body bending frequency of 30 C.elegans in 20s（the movement of nematodes relative to one wavelength along the long axis of the nematode was taken as one body bending） to evaluate the effects on motor behavior of C.elegans.Results：Compared with the group of Coptidis Rhizoma，as the relative proportion of Tetradium ruticarpum increasing，the mortality rate of C elegans was significantly decreased（P<0.01）.The body length was significantly reduced（P<0.01）.In the aspect of locomotion behavior，the addition of Tetradium ruticarpum can′t significantly reduces the frequency of head swing and body flexion of C.elegans.Conclusion：To a certain degree Tetradium ruticarpum can reduce the toxicity of Coptidis Rhizoma to C elegans，extending its life.In terms of growth and nerves，it has less affection.And the research provided a new method for the study of Coptidis Rhizoma and Tetradium ruticarpum in pairing and concoction.

Keywords Coptidis Rhizoma; Tetradium ruticarpum; Caenorhabditis elegans; Lifespan; Body length; Sports behavior; Toxicity; Concoct attenuation

中圖分類號：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.24.002

黃連為毛茛科植物黃連Coptis chinensis Franch.、三角葉黃連Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hsiao或云連Coptis teeta Wall.的干燥根莖?？?，寒，歸心、脾、胃、肝、膽、大腸經(jīng)。具有清熱燥濕，瀉火解毒的作用，用于濕熱痞滿，嘔吐吞酸，瀉痢等癥[1]。黃連中所含化學(xué)成分主要有生物堿類，以小檗堿含量最高，還有巴馬汀、表小檗堿、四氫小檗堿等。除此之外，還含有木脂素類、黃酮類、鞣質(zhì)、酸性成分、多糖等多種成分。在降糖、抗菌、抗炎、抗氧化等方面有顯著的藥理作用[2]。吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.、石虎Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.var.officinalis（Dode）Huang或疏毛吳茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.var.bodinieri（Dode）Huang的干燥近成熟果實(shí)。辛、苦，熱，有小毒，歸肝、脾、胃、腎經(jīng)[1]。具有散寒止痛，降逆止嘔，助陽止瀉的功效[3]，用于厥陰頭痛，寒疝腹痛，寒濕腳氣等癥。吳茱萸中所含化學(xué)成分主要有生物堿類，以吳茱萸堿和吳茱萸次堿為主，還有揮發(fā)油、檸檬苦素類和黃酮類化合物等多種成分[4-5]。在抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛、抑菌、降血脂等方面有顯著的藥理作用。

黃連和吳茱萸常配伍或炮制后使用。萸黃連，即以吳茱萸煎液與凈黃連拌勻，待液吸盡，炒干，具有疏肝和胃止嘔的作用，用于肝胃不和，嘔吐吞酸[1]。二者配伍使用的歷史非常悠久，首載于北宋的《太平圣惠方》，黃連-吳茱萸1∶1配伍組成茱萸丸，用于下痢水瀉[6]。最著名的是朱震亨的《丹溪心法·火六》中記載的左金丸，由黃連-吳茱萸6∶1配伍而成。此外，歷代還有許多黃連-吳茱萸配伍的方劑。見表1。

黃連、吳茱萸一苦一辛、一寒一熱、一陰一陽，二藥配伍體現(xiàn)了“辛開苦降”“反佐”的思想，是中醫(yī)治療八法中“和”法的代表，極具中醫(yī)特色[7-8]。因此，黃連-吳茱萸配伍的藥理作用一直是研究的熱點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)，黃連水提物可對小鼠造成急性毒性作用，其毒性與乙酰膽堿酯酶抑制、腸道P-糖蛋白功能受損、腸黏膜Ⅰ相及Ⅱ相代謝能力降低等因素有關(guān)[9]。有文獻(xiàn)報(bào)道黃連經(jīng)口急性毒性LD50為18.82 g/kg。有研究者以0.5 mg/mL劑量以0.2 mL/10 g灌胃小鼠，造成肝損傷，其病理變化隨著劑量的增加而加重[10]。而在黃連之前給予吳茱萸，其毒性明顯降低。

評價中藥的毒性，主要采用動物實(shí)驗(yàn)，以嚙齒類動物如大鼠、小鼠、豚鼠等為主，也有應(yīng)用犬或猴為實(shí)驗(yàn)對象的[11]。這些實(shí)驗(yàn)動物價格高昂、飼養(yǎng)困難、試驗(yàn)周期長，而且傳統(tǒng)化學(xué)藥物的毒理學(xué)評估方式不能解釋清楚成分復(fù)雜的中藥的毒性機(jī)制。所以，評價中藥的毒性需要一種迅速、簡便、可靠的方法。作為一種結(jié)構(gòu)簡單、生命周期短，與人類基因保守性較高的模式動物[12]，秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis Elegans，簡稱“線蟲”）因此被廣泛用于生命科學(xué)領(lǐng)域。李煜等[13]以秀麗隱桿線蟲的發(fā)育、運(yùn)動、消化功能、壽命和繁殖能力為指標(biāo)，評估威尼斯不動桿菌（Av）的致病性，說明秀麗隱桿線蟲可以作為致病性評價體系的篩選方案。有研究利用線蟲（N2 strain）建立了糞腸球菌持久感染模型[14-16]，并用其研究金黃色葡萄球菌的關(guān)鍵致病因子。線蟲還可作為抗衰老領(lǐng)域研究的動物模型，王麗萍等[17]發(fā)現(xiàn)，其自主設(shè)計(jì)合成的新型模擬酶-抗壞血酸過氧化物酶（DhHP-6）可延長野生型線蟲的平均壽命。秀麗隱桿線蟲因?yàn)槭蔷哂懈叨缺Ｊ匦缘暮唵味嗉?xì)胞真核生物，可以用于細(xì)胞凋亡的深入研究[18]。Kokel等[19]發(fā)現(xiàn)含萘的環(huán)境可以阻止線蟲體內(nèi)部分細(xì)胞的凋亡，這種現(xiàn)象在缺少凋亡酶-胱天蛋白酶的情況下更加明顯。秀麗隱桿線蟲也是研究發(fā)育生物學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)的理想模型動物。在帕金森病的研究中，有學(xué)者在研究多巴胺能神經(jīng)元損傷時，用化學(xué)藥物誘導(dǎo)秀麗隱桿線蟲制作轉(zhuǎn)基因模型[20]。此外，秀麗隱桿線蟲還可用于中藥活性及毒性的評價，以壽命、體長、運(yùn)動行為、產(chǎn)卵率等為指標(biāo)，魏巍等[21]發(fā)現(xiàn)蓖麻水提物可以使線蟲的生殖能力降低或喪失，許云等[22]發(fā)現(xiàn)芫花素可以抑制線蟲的運(yùn)動行為，對其有一定的毒性?；谏鲜鰞?yōu)勢，線蟲在測試環(huán)境生態(tài)毒性、篩選藥物、研究人類疾病、評價中藥毒性等方面得到廣泛應(yīng)用。

前期研究用秀麗隱桿線蟲評價了黃連的毒性效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)黃連水提取物對線蟲有較為強(qiáng)烈的毒性，本研究則通過測定不同質(zhì)量濃度的黃連-吳茱萸不同比例配伍提取物對線蟲的死亡率、體長和運(yùn)動行為的影響，探究黃連、吳茱萸反佐配伍的減毒效果，為黃連、吳茱萸的臨床使用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為使用線蟲快速評價中藥的不良反應(yīng)方式提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 野生型N2秀麗隱桿線蟲（C.elegans of Wild-type Strain）于20 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、大腸桿菌OP50于4 ℃冰箱中保存，均由中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所提供。

1.1.2 藥物 黃連（北京市雙橋燕京中藥飲片廠，批號：1604034），經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院楊瑤珺教授鑒定為毛茛科黃連屬植物黃連Coptis chinensis Franch.干燥根莖。吳茱萸（安徽益生源藥業(yè)有限公司，批號：17090470），經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院楊瑤珺教授鑒定為蕓香科植物吳茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.的干燥近成熟果實(shí)。

1.1.3 試劑與儀器 瓊脂粉（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號：20200518）、蛋白胨（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號：20181206）、胰蛋白胨（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號：20180206）、膽固醇（北京博奧拓達(dá)科技有限公司，批號：160612）、酵母粉（賽默飛世爾科技公司，美國，批號：1149159）、氯化鈉（北京化工廠，批號：20160105）、磷酸二氫鉀（北京化工廠，批號：20190516）、氫氧化鉀（北京化工廠，批號：20161124）、硫酸鎂（北京化工廠，批號：20150317）、氯化鈣（北京化工廠，批號：20160808）、十二水合磷酸氫二鈉（北京化工廠，批號：20160216）、氯化銨（北京化工廠，批號：20150929）等均為分析純。

千分之一電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，型號：BSA224S）、立式高壓蒸汽滅菌器（上海云泰儀器儀表有限公司，型號：LT-CPS50C）、恒溫水浴鍋（余姚市上通溫控儀器廠，型號：HHS11S）、超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司，型號：SB25-12DTD）、微量移液器（Eppendorf公司，型號：K36113B）、生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司，型號：LRH-150）、體式顯微鏡（上海尼康儀器有限公司，型號：SMZ800N）。

1.2 方法

1.2.1 黃連-吳茱萸水提物的制備 準(zhǔn)確稱取黃連、吳茱萸共12 g，粉碎后加6倍量水（72 mL）在200 mL燒瓶內(nèi)水浴回流1.5 h，濾過，藥渣再加4倍水（48 mL），回流1 h，濾過，合并兩次濾液，水浴蒸干，濾過，得到黃連-吳茱萸水提液，加熱揮干，得到黃連吳茱萸水提物，使用時用大腸桿菌溶液配成所需濃度。黃連-吳茱萸配伍比例見表2。

1.2.2 培養(yǎng)基及緩沖液的配制 LB液體培養(yǎng)基、線蟲生長培養(yǎng)基（NGM培養(yǎng)基）和M9緩沖液的配方見表3。

1.2.3 線蟲的基本培養(yǎng) 將秀麗隱桿線蟲放于NGM培養(yǎng)基上，投喂大腸桿菌OP50，在22 ℃恒溫培養(yǎng)箱培育。為保證線蟲的生活空間和食物充足，每3 d轉(zhuǎn)板1次，并保持培養(yǎng)基潔凈[23]。

1.2.4 線蟲的同步化處理 準(zhǔn)備一個新的NGM培養(yǎng)基，涂布20 μL新鮮食物菌OP50，挑取60條左右產(chǎn)卵期的成蟲于新培養(yǎng)基上，約2 h后挑走全部成蟲，余下留有蟲卵的培養(yǎng)基，在22 ℃無菌生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，得到同步化處于L4時期的線蟲[24]。

1.2.5 線蟲存活率的測定 在涂有0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL不同比例配伍黃連-吳茱萸水提物的NGM培養(yǎng)基中分別放置30條同步化的處于L4時期的線蟲，22 ℃下培養(yǎng)。因?yàn)榻o藥期間線蟲會產(chǎn)卵，所以每隔24 h將存活的給藥線蟲挑到新的含相同藥物質(zhì)量濃度的培養(yǎng)板上繼續(xù)培養(yǎng)，避免與新生幼蟲混雜。每天在相同時間觀察并記錄線蟲死亡的數(shù)目，當(dāng)線蟲停止運(yùn)動，觸碰沒有反應(yīng)時即認(rèn)為死亡，記錄最后一條線蟲的死亡時間為最長壽命[25]。

1.2.6 線蟲體長測定 在NGM培養(yǎng)基上涂布0.5 mg/mL不同比例配伍的黃連-吳茱萸水提物溶液配制的大腸桿菌OP50，使L4時期線蟲暴露在中24 h后，將培養(yǎng)基放在50 ℃烘箱中處理5～10 min，待線蟲全部死亡后，顯微鏡下進(jìn)行圖像采集，利用Image J軟件進(jìn)行圖像分析，測量線蟲虛擬體長。

1.2.7 線蟲頭部擺動頻率測定 L4時期線蟲經(jīng)過在0.5 mg/mL不同比例配伍的黃連-吳茱萸水提物中暴露24 h后，在未添加大腸桿菌OP50的NGM培養(yǎng)基上放置30條線蟲，滴加緩沖液，記錄60 s線蟲頭部擺動的次數(shù)（將線蟲頭部從左擺到右邊再回到左邊記為一次擺動）[26]。

1.2.8 線蟲身體彎曲頻率測定 L4時期線蟲經(jīng)過在0.5 mg/mL不同比例配伍的黃連-吳茱萸水提物中暴露24 h后，在未添加大腸桿菌OP50的NGM培養(yǎng)基上放置30條線蟲，滴加緩沖液，記錄20 s線蟲身體彎曲的次數(shù)（認(rèn)為線蟲相對于身體的長軸移動一個正弦周期的波長為1次身體彎曲）[27]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次，采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，其中計(jì)數(shù)資料以百分率表示，采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃連吳茱萸不同比例不同濃度水提物對線蟲存活率的影響 不同培養(yǎng)時間下，0.5 mg/mL黃連-吳茱萸水提物不同配伍比例組對線蟲存活率的影響。見圖1。

不同培養(yǎng)時間下，1.0 mg/mL黃連-吳茱萸水提物不同配伍比例組對線蟲存活率的影響結(jié)果見圖2。

不同培養(yǎng)時間下，2.0 mg/mL黃連-吳茱萸水提物不同配伍比例組對線蟲存活率的影響結(jié)果見圖3。

以生品黃連為對照，不同濃度黃連-吳茱萸水提物對線蟲死亡率的影響為2.0 mg/mL<1.0 mg/mL<0.5 mg/mL，2.0 mg/mL組延長線蟲壽命最為顯著。每個濃度下，不同比例配伍黃連-吳茱萸對線蟲死亡率隨吳茱萸相對比例的增加而降低，說明吳茱萸能夠抑制黃連的毒性，使線蟲壽命增加。

2.2 黃連吳茱萸不同比例水提物對線蟲身體發(fā)育的影響 在之前的研究中發(fā)現(xiàn)，黃連水提物對秀麗隱桿線蟲具有明顯的毒性作用，能使線蟲的壽命、體長、頭部擺動頻率和身體彎曲頻率顯著降低，且隨濃度增加，毒性作用增強(qiáng)。為防止毒性過大影響實(shí)驗(yàn)，選用0.5 mg/mL濃度組進(jìn)行體長和運(yùn)動行為實(shí)驗(yàn)。見圖4。對照組生品黃連線蟲體長為（291.2±5.381），黃連-吳茱萸不同比例配伍水提物組線蟲體長分別為6∶1組（242.6±5.921）、5∶2組（249.2±5.048）、2∶1組（252.6±5.499）、3∶2組（248.5±4.301）、1∶1組（250.5±6.329）、1∶2組（255.5±5.960）、吳茱萸組（229.3±4.706）。與對照組比較，各組線蟲體長均極顯著減?。≒<0.000 1），吳茱萸相對比例和線蟲體長之間無明顯線性關(guān)系。說明吳茱萸對黃連抑制的毒性有關(guān)。

2.3 黃連吳茱萸不同比例水提物對線蟲運(yùn)動行為的影響 神經(jīng)系統(tǒng)是對運(yùn)動行為調(diào)節(jié)起主導(dǎo)作用的系統(tǒng)，因此可用線蟲頭部擺動和身體彎曲情況反映運(yùn)動行為的好壞，從而衡量神經(jīng)系統(tǒng)的基本功能，此種方法廣泛應(yīng)用于評價藥物的神經(jīng)毒性、有機(jī)化合物的毒性以及環(huán)境污染情況等。見圖5～6。生品黃連組線蟲頭部每分鐘擺動頻率為（101.3±3.395）次，身體彎曲頻率為每20秒（35.8±1.337）次;與生品黃連組比較，6∶1、5∶2組線蟲的頭部擺動頻率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），2∶1、1∶1組的頭部擺動頻率顯著降低（P<0.01），3∶2、1∶2和吳茱萸組的頭部擺動頻率極顯著降低（P<0.000 1）;6∶1、5∶2、1∶2組線蟲的身體彎曲頻率與生品黃連組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），2∶1、1∶1組的身體彎曲頻率顯著降低（P<0.01），3∶2和吳茱萸組的身體彎曲頻率極顯著降低（P<0.000 1）。說明吳茱萸不能緩解黃連對線蟲神經(jīng)系統(tǒng)的抑制作用。

3 討論

秀麗隱桿線蟲是一種多細(xì)胞真核生物，經(jīng)過科學(xué)家長期大量的研究，已知線蟲的生命周期、細(xì)胞譜系、基因組序列等，且因?yàn)槠渖芷诙獭⒁子谂囵B(yǎng)等優(yōu)勢，可實(shí)現(xiàn)快速、高通量的化學(xué)品篩選[30]。與其他模式生物比較，雌雄同體的線蟲自體受精能產(chǎn)生非常純合的基因型，可以避免個體差異，再加上秀麗隱桿線蟲可以很好地代替嚙齒類動物進(jìn)行毒性試驗(yàn)，在預(yù)實(shí)驗(yàn)時使用更加經(jīng)濟(jì)，減少哺乳類實(shí)驗(yàn)動物的消耗，符合3R原則，保證動物福利，因此廣泛用于藥物初步毒性評價及活性篩選，能夠更加準(zhǔn)確、快速地評價中藥的生物毒性，闡明中藥毒性的作用機(jī)制，可用于建立規(guī)范的毒性評價系統(tǒng)[31-32]。

黃連性味苦、寒，歸心、脾、胃、肝、膽、大腸經(jīng)，具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效。吳茱萸性味辛、苦、熱，有小毒，歸肝、脾、胃、腎經(jīng)，具有散寒止痛、降逆止嘔、助陽止瀉的功效。黃連與吳茱萸的配伍，屬于寒熱配對，二者一寒一熱，一苦一辛，一降一升，一陰一陽，相反相成，互為母子（五行）[28-29]，雖僅兩味藥，但應(yīng)用非常廣泛。本研究發(fā)現(xiàn)吳茱萸在一定程度上能夠降低黃連對秀麗隱桿線蟲的毒性，延長其壽命，而在生長發(fā)育和神經(jīng)方面影響較小。黃連-吳茱萸配伍主要導(dǎo)致二者化學(xué)成分的溶出率增加或降低或生成新化合物，其中黃連生物堿溶出率隨黃連比例增加而降低，吳茱萸脂溶性生物堿溶出率隨黃連比例增加而升高[33]。推測黃連生物堿可能是降低線蟲壽命的主要成分，因此當(dāng)其溶出率下降后會使線蟲壽命延長。吳茱萸有小毒，還能促進(jìn)黃連生物堿在小腸部位的吸收[34]，這2個因素可能是造成吳茱萸降低黃連對線蟲發(fā)育和神經(jīng)毒性不明顯的原因，需要進(jìn)一步研究黃連、吳茱萸毒性作用的機(jī)制和配伍的機(jī)制。

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（2020-07-05收稿 責(zé)任編輯：吳珊）