劉勃興 趙安奇 劉 暢 王利麗 張雪佳吳同壘 高桂生 史秋梅 張志強(qiáng)

(河北科技師范學(xué)院，河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，秦皇島，066004)

大腸桿菌(Escherichiacoli)是畜禽生產(chǎn)中的常見致病菌，不同類型的大腸桿菌所致發(fā)病癥狀存在差異。腸外致病性大腸桿菌可引起動(dòng)物急性敗血癥、呼吸道炎癥以及泌尿道炎癥等[1]。毛皮動(dòng)物也可感染大腸桿菌，主要表現(xiàn)為腹瀉、肺炎，嚴(yán)重可致敗血癥死亡。尤其是大腸桿菌性肺炎，近年來(lái)在毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖中十分常見，是造成毛皮動(dòng)物死亡的最主要病原之一[2]。大腸桿菌感染還可引起懷孕母畜流產(chǎn)[3]。前期報(bào)道從多種動(dòng)物流產(chǎn)胎兒分離出致病性大腸桿菌，揭示其可能是重要的致流產(chǎn)病原[4-7]。大腸桿菌感染引起毛皮動(dòng)物流產(chǎn)鮮見報(bào)道，2015、2018年的2例報(bào)道首次從流產(chǎn)藍(lán)狐(Vulpeslagopus)和水貂(Mustelavison)胎兒體內(nèi)分離大腸桿菌，懷疑其可能在毛皮動(dòng)物上引發(fā)流產(chǎn)的致病原[4-5]。

春季是毛皮動(dòng)物繁殖季節(jié)，也是流產(chǎn)的高發(fā)季節(jié)。在毛皮動(dòng)物上能夠引起流產(chǎn)的病原主要有阿留申病毒、偽狂犬病毒、犬瘟熱病毒等病毒性病原以及加德納氏菌(Gardnerellavaginalis)、布氏桿菌(Brucella)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)等細(xì)菌性病原。除此之外，附紅細(xì)胞體(Eperythrozoon)、旋毛蟲(Trichinellaspiralis)、蛔蟲(Ascarislumbricoides)等寄生蟲也可能引起流產(chǎn)[8-9]。多種病原均可導(dǎo)致毛皮動(dòng)物流產(chǎn)，使臨床診斷流產(chǎn)原因難度增加，因此，大腸桿菌往往被忽略。

2019年5月接診到一起貉(Nyctereutesprocyonoides)流產(chǎn)病例，對(duì)其致病原進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果未檢測(cè)到可致母貉出現(xiàn)流產(chǎn)癥狀的病毒、寄生蟲等病原。對(duì)流產(chǎn)胎兒肝臟、脾臟、心臟等臟器細(xì)菌進(jìn)行分離鑒定，分離到1株能在血瓊脂平板上出現(xiàn)β溶血環(huán)的大腸桿菌，將分離菌株接種小鼠，證實(shí)其具有較強(qiáng)致病性，感染懷孕母鼠可致流產(chǎn)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)其致病和耐藥情況復(fù)雜。

1 材料與方法

1.1 材料

貉流產(chǎn)胎兒來(lái)自秦皇島市某發(fā)病貉養(yǎng)殖場(chǎng)送樣，無(wú)菌采取肝臟、脾臟、心臟等臟器。

1.2 主要試劑與儀器

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，均購(gòu)自北京陸橋科技股份有限公司；哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基(羊血)，購(gòu)自廣州迪景微生物科技有限公司；革蘭氏染色液，購(gòu)自北京博奧拓達(dá)科技有限公司；藥敏紙片，購(gòu)自杭州天和微生物科技股份有限公司；ID32E腸道菌鑒定試條，購(gòu)自法國(guó)梅里埃公司；D2000 plus DNA marker，購(gòu)自中科瑞泰科技有限公司；E.coliO型診斷血清，購(gòu)自天津生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司；2×TaqMaster Mix，細(xì)菌DNA基因組提取試劑盒，購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司。PCR儀器、瓊脂糖凝膠電泳成像儀、立式自動(dòng)壓力蒸氣滅菌器、無(wú)菌工作臺(tái)、隔水式恒溫培養(yǎng)箱等，由河北科技師范學(xué)院/河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)試驗(yàn)室提供。PCR擴(kuò)增引物合成和序列測(cè)定服務(wù)均由上海生工生物公司完成。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

維通利華試驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.4 病原菌的分離鑒定

1.4.1 病原菌的分離、鑒別培養(yǎng)與革蘭氏染色

用滅菌后棉簽無(wú)菌蘸取肝臟、心臟、脾臟等臟器樣品，接種于血瓊脂平板上，37℃恒溫培養(yǎng)12 h，挑取單個(gè)菌落接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯，37℃ 200 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)12 h。將分離菌分別在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上分區(qū)劃線，37℃恒溫培養(yǎng)12 h后觀察菌落狀態(tài)。對(duì)分離菌進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢。

1.4.2 生化特性鑒定

參考李文艷[10]的方法，用ID32E腸道菌鑒定試條對(duì)分離菌進(jìn)行生化鑒定，并用ATB自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定。

1.4.3 分離菌的16S rDNA鑒定

用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取細(xì)菌DNA，并以其為模板，參考張志強(qiáng)等[11]的16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR，引物序列：16Sr-F(5′CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCATCATGGCTCAG-3′)；16Sr-R(5′-CAACAGAGTTTGATCATCATGGCTCAG-3′)。將PCR產(chǎn)物送上海生工生物公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果拼接，用NCBI BLAST分析比對(duì)。

1.4.4 大腸桿菌血清型檢測(cè)

采用單因子血清玻片凝集法測(cè)定大腸桿菌的血清型，具體操作參照試劑說(shuō)明書。

1.5 致病性試驗(yàn)

試驗(yàn)前參考文獻(xiàn)[10]處理母鼠使其懷孕。選取8周齡小鼠，公母各1只合籠。次日，觀察母鼠是否有陰門栓形成，若有，則判定為妊娠，繼續(xù)飼養(yǎng)6 d后挑選5只懷孕母鼠進(jìn)行試驗(yàn)。

參考李巧玲等[4]及張志強(qiáng)等[11]的攻毒劑量，進(jìn)行致病性試驗(yàn)。未懷孕組小鼠5只，每只小鼠腹腔注射0.2 mL菌液(菌液濃度為1.0×108cfu/mL)，懷孕組母鼠5只，每只母鼠腹腔注射0.2 mL菌液(菌液濃度為1.0×104cfu/mL)。對(duì)照組未懷孕小鼠和懷孕母鼠各5只，每只小鼠腹腔注射0.2 mL無(wú)菌PBS。觀察并記錄每組小鼠狀態(tài)。

1.6 毒力基因檢測(cè)

以提取分離菌DNA為模板，用PCR方法檢測(cè)分離菌毒力基因攜帶情況。大腸桿菌毒力基因參考文獻(xiàn)[12](表1)，PCR反應(yīng)程序退火溫度 58℃。

表1 毒力基因引物Tab.1 Virulence gene primers

續(xù)表1

1.7 藥物敏感性試驗(yàn)

按照美國(guó)臨床和試驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)的標(biāo)準(zhǔn)，采用K-B藥敏紙片法對(duì)分離菌進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)。試驗(yàn)重復(fù)3次，取抑菌圈直徑平均值為最終結(jié)果。

1.8 耐藥基因檢測(cè)

參照1.4.3中的方法提取細(xì)菌基因組，用 PCR方法檢測(cè)分離菌耐藥基因。大腸桿菌耐藥基因引物(表2)及PCR反應(yīng)程序參照文獻(xiàn)[13]。

表2 耐藥基因引物Tab.2 Drug resistance gene primers

續(xù)表2

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的分離鑒定

2.1.1 分離菌菌落形態(tài)與革蘭氏染色

分離菌在血瓊脂平板上培養(yǎng)，菌落有明顯β溶血環(huán)。在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，分離菌菌落呈紫黑色，有金屬光澤。在麥康凱瓊脂上培養(yǎng)，分離菌菌落呈紅色。對(duì)分離菌進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢。鏡檢結(jié)果為革蘭氏染色陰性桿菌，兩端鈍圓。根據(jù)細(xì)菌菌落形態(tài)與革蘭氏染色鏡檢結(jié)果初步判定為大腸桿菌。

2.1.2 生化特性鑒定

用ID32E腸道菌鑒定試條對(duì)分離菌進(jìn)行生化鑒定，并用ATB自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定，生化鑒定結(jié)果顯示：d-葡萄糖、賴氨酸脫羧酶、L-阿拉伯糖、d-甘露醇、肌醇、d-半乳糖酸鹽同化、d-海藻糖、β-葡萄糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶、d-麥芽糖、蔗糖、酚紅檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，經(jīng)ATB自動(dòng)生化鑒定儀分析結(jié)果為大腸桿菌。

表3 LCE-1菌株生化鑒定結(jié)果Tab.3 Biochemical identification results of LCE-1 strain

2.1.3 分離菌16S rDNA鑒定

將分離菌用16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，將PCR產(chǎn)物送上海生工生物公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果用NCBI BLAST進(jìn)行序列比對(duì)，分離菌與大腸桿菌屬同源性最高。

從GenBank上下載大腸桿菌屬參考菌株以及腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的克雷伯菌屬(Klebsiella)、沙門菌屬(Salmonella)，以及巴氏桿菌科(Pasteurellaceae)的巴氏桿菌屬(Pasteurella)參考菌株的16 S rDNA序列，用Lasergene軟件的Megalign功能進(jìn)行序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)分離菌與其他大腸桿菌屬參考菌株處于同一分支，與腸桿菌科的沙門參考菌株、克雷伯參考菌株屬于同一個(gè)大分支，而與巴氏桿菌科成員親近性相對(duì)較遠(yuǎn)。

2.1.4 大腸桿菌血清型檢測(cè)

通過(guò)玻片凝集試驗(yàn)檢測(cè)分離菌，結(jié)果顯示分離菌為O89血清型大腸桿菌。結(jié)合鑒定培養(yǎng)基培養(yǎng)、革蘭氏染色、生化鑒定、16S rDNA基因測(cè)序分析的試驗(yàn)結(jié)果，判定分離菌為大腸桿菌，命名為L(zhǎng)CE-1。

2.2 致病性試驗(yàn)

將LCE-1菌以每只0.2 mL菌液(菌液濃度為1.0×108cfu/mL)的劑量感染未懷孕小鼠，24 h后LCE-1組小鼠全部死亡，對(duì)照組小鼠無(wú)死亡。對(duì)照組小鼠連續(xù)觀察2周，小鼠均無(wú)死亡，精神狀態(tài)良好，無(wú)任何病征。

將LCE-1菌以每只0.2 mL菌液(菌液濃度為1.0×104cfu/mL)感染懷孕母鼠，24 h后LCE-1組懷孕母鼠出現(xiàn)流產(chǎn)病征，精神萎靡。72 h后5只LCE-1組母鼠全部流產(chǎn)，并有1只母鼠死亡。對(duì)照組懷孕小鼠無(wú)變化。10 d后，對(duì)照組小鼠陸續(xù)正常分娩。

將死亡小鼠肝臟、脾臟、心臟，流產(chǎn)母鼠子宮細(xì)菌分離鑒定，同樣分離到大腸桿菌。

2.3 毒力基因檢測(cè)

采用用PCR對(duì)LCE-1菌的毒力基因進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示：vat、iroN、iucD、ECs3737、irp2、fyuA6種毒力基因檢測(cè)陽(yáng)性。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明LCE-1攜帶多種毒力基因，其致病性可能與這6種毒力基因有關(guān)。

2.4 藥物敏感性試驗(yàn)

采用K-B紙片法對(duì)LCE-1菌株進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果判定參照CLSI標(biāo)準(zhǔn)。試驗(yàn)結(jié)果顯示：LCE-1對(duì)麥迪霉素、呋喃唑酮、苯唑西林、克林霉素、萬(wàn)古霉素、紅霉素、米諾環(huán)素、多粘菌素B、丁胺卡那、復(fù)方新諾明、多西環(huán)素、氯霉素、卡那霉素、氨芐西林、頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢呋辛、青霉素、四環(huán)素共19種藥物耐藥；對(duì)哌拉西林、頭孢唑林、頭孢哌酮、羧芐西林、頭孢曲松、新霉素6種藥表現(xiàn)中敏；對(duì)環(huán)丙沙星、頭孢他啶、氧氟沙星、慶大霉素、諾氟沙星5種藥物表現(xiàn)敏感(表4)。其中，萬(wàn)古霉素、氧氟沙星、諾氟沙星為農(nóng)業(yè)部公告的禁用獸藥，只用于試驗(yàn)研究。分離菌的藥物敏感性試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，LCE-1菌多重耐藥性十分嚴(yán)重。

表4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Drug sensitivity test results

2.5 耐藥基因檢測(cè)

用PCR對(duì)LCE-1菌的耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果顯示：四環(huán)素類(tetA、tetC、tetD)、β-內(nèi)酰胺類藥(blaTEM、blaTEM1、blaOXA1)氨基糖苷類(aadA1、strA-strB)、磺胺類(sul1、sul2)耐藥基因檢測(cè)陽(yáng)性。試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，LCE-1攜帶多種耐藥基因，進(jìn)一步解釋了為何LCE-1多重耐藥情況如此嚴(yán)重。

3 討論

大腸桿菌為一種在自然條件下普遍存在的條件性致病菌，可感染多種家畜、家禽以及人類發(fā)病。動(dòng)物感染大腸桿菌后常出現(xiàn)腹瀉、敗血癥、免疫力降低等癥狀。本研究在秦皇島某貉養(yǎng)殖場(chǎng)懷孕母貉流產(chǎn)病因進(jìn)行診斷，對(duì)送檢流產(chǎn)胎兒進(jìn)行病毒(阿留申病毒、偽狂犬病毒、犬瘟熱病毒)、寄生蟲(附紅細(xì)胞體、旋毛蟲、蛔蟲)、細(xì)菌(加德納氏菌、布氏桿菌、銅綠假單胞菌)檢測(cè)，結(jié)果均為陰性。但在肝臟、脾臟、心臟等臟器分離出1株優(yōu)勢(shì)菌株，該菌株菌落在血瓊脂平板有明顯β溶血環(huán)。通過(guò)伊紅美藍(lán)、麥康凱鑒定培養(yǎng)基培養(yǎng)觀察菌落形，革蘭氏染色鏡檢觀察細(xì)菌形態(tài)初步判定為大腸桿菌。進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)菌生化鑒定，16S rDNA 序列分析，大腸桿菌血清型檢測(cè)，最終結(jié)果判定為大腸桿菌，血清型為O89型，并命名為L(zhǎng)CE-1。

本研究進(jìn)一步對(duì)LCE-1的致病性進(jìn)行研究。本研究將LCE-1以不同劑量分別感染未懷孕小鼠以及懷孕母鼠，發(fā)現(xiàn)該菌能導(dǎo)致未懷孕小鼠死亡，懷孕母鼠流產(chǎn)。剖檢死亡小鼠，發(fā)現(xiàn)其內(nèi)臟器官出現(xiàn)嚴(yán)重的出血，并從死亡小鼠肝臟、脾臟和心臟，流產(chǎn)母鼠子宮內(nèi)同樣分離到大腸桿菌。表明LCE-1是致小鼠死亡以及懷孕母鼠流產(chǎn)的病原。但LCE-1是否可致母貉流產(chǎn)還需進(jìn)一步研究。前有報(bào)道從流產(chǎn)藍(lán)狐、水貂胎兒中分離到致病大腸桿菌，2004年趙傳芳等[14]從流產(chǎn)貉的子宮內(nèi)膜分離到致病大腸桿菌，本研究從貉流產(chǎn)胎兒臟器分離出具有較強(qiáng)致病性大腸桿菌，表明在臨床診斷貉流產(chǎn)病時(shí)，大腸桿菌是不可忽略的重要病原。

大腸桿菌的致病性主要與其攜帶的毒力基因有關(guān)[15]，為了研究其致病原因，本研究初步對(duì)LCE-1大腸桿菌的毒力基因進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其攜帶有vat、iroN、iucD、ECs3737、irp2、fyuA毒力基因。Vat為空泡形成毒素基因，可導(dǎo)致宿主細(xì)胞空泡化；ECs3737為ETT2毒力島標(biāo)志基因；iucD為氣桿菌素編碼基因，iroN為鐵結(jié)合性復(fù)合物內(nèi)化的受體，irp2和fyuA為強(qiáng)毒力島(HPI)的編碼基因，這4個(gè)大腸毒力基因都可以影響機(jī)體鐵攝取，這可能是致病的主要因素。而大腸桿菌發(fā)揮致病作用為一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，空泡形成毒素基因Vat、ETT2毒力島基因與攝鐵系統(tǒng)的毒力基因的共同存在可能才是最終導(dǎo)致母畜流產(chǎn)的原因。但目前大腸桿菌致母畜流產(chǎn)的致病機(jī)制以及流產(chǎn)癥狀與毒力基因之間的關(guān)系尚不明確。

在不同的時(shí)間，不同的地區(qū)流行的大腸桿菌的血清型不同，其致病力也存在差異[16]。通過(guò)對(duì)LCE-1血清型鑒定，鑒定其為O89型大腸桿菌。O89型大腸桿菌為我國(guó)禽類致病大腸桿菌的流行型，在貉中分離出該血清型大腸桿菌可能為在飼料中添加有禽類產(chǎn)品或?qū)⑷耸秤煤蟮氖２耸ｏ埖蕊曃购阉?，從而引起貉發(fā)病。

在臨床治療大腸桿菌病時(shí)，有時(shí)抗生素類藥物不能有效地控制住病情，但當(dāng)前大腸桿菌病的防治還是以抗生素類藥物為主[17]。為了指導(dǎo)臨床用藥，本研究挑選30種臨床常見的藥物，發(fā)現(xiàn)LCE-1菌株對(duì)麥迪霉素、呋喃唑酮、苯唑西林等19種藥物耐藥，對(duì)哌拉西林、頭孢唑林、頭孢哌酮、羧芐西林、頭孢曲松、新霉素6種藥中敏，對(duì)環(huán)丙沙星、頭孢他啶、氧氟沙星、慶大霉素、諾氟沙星5種藥敏感。本研究選取的30種藥物種，包括了獸醫(yī)臨床常用抗生素、農(nóng)業(yè)部禁用抗生素以及人醫(yī)常用抗生素等，發(fā)現(xiàn)該大腸桿菌對(duì)19/30的藥物耐藥。胎兒在母體內(nèi)并不能直接與藥物接觸，而從流產(chǎn)胎兒臟器中分離出的LCE-1菌株表現(xiàn)為多重耐藥，由此猜測(cè)LCE-1來(lái)自于母貉，并且通過(guò)胎盤垂直傳播給胎兒，但具體原因應(yīng)進(jìn)一步研究。細(xì)菌多重耐藥性的產(chǎn)生不僅給動(dòng)物疾病的防治帶來(lái)了困難，而且還給食品安全以及人類健康也造成嚴(yán)重的威脅，應(yīng)引起大家的重視[18]。

大腸桿菌的耐藥性主要是耐藥質(zhì)粒通過(guò)接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)等方式在不同菌株之間傳遞，使敏感菌成為耐藥菌[19]，而多種耐藥基因的存在是導(dǎo)致大腸桿菌多重耐藥性的主要原因。通過(guò)對(duì)LCE-1菌的四環(huán)素類等5種類藥物耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，該菌攜帶有四環(huán)素類(tetA、tetC、tetD)、β-內(nèi)酰胺類(blaTEM、blaTEM1、blaOXA1)氨基糖苷類(aadA1、strA-strB)、磺胺類(sul1、sul2)藥物的耐藥基因。進(jìn)一步證實(shí)了大腸桿菌多重耐藥性的產(chǎn)生與耐藥基因的存在有著一定的關(guān)系。

毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖是秦皇島市的支柱產(chǎn)業(yè)，母畜流產(chǎn)可給養(yǎng)殖戶造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。在臨床診斷貉流產(chǎn)病例中，普遍認(rèn)為大腸桿菌并非是導(dǎo)致流產(chǎn)的主要病原，因此缺乏對(duì)大腸桿菌的關(guān)注。本研究在貉流產(chǎn)死胎臟器分離出致病大腸桿菌，該株菌對(duì)小鼠具有較強(qiáng)致病性，可致懷孕小鼠流產(chǎn)，并具有嚴(yán)重的多重耐藥性。本研究揭示大腸桿菌可能為貉流產(chǎn)的病原，為該病的防控奠定基礎(chǔ)。