蔡國俊 郭春艷 譚仲廷 吳鳳嬋 李安定 張麗敏 彭熙

摘 ?要：細(xì)菌群落在土壤健康和植物的生長中起著重要作用，而作物的連作對其有著顯著的影響。為探明百香果連作對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響，本研究以種植‘臺農(nóng)1號’百香果1年（TF）、2年（TS）、3年（TT）、4年（TFo）及0年（撂荒地，TZ）的土壤為材料，利用Illumina高通量測序技術(shù)對不同種植年限土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性開展分析研究。結(jié)果表明，所有土壤樣本共檢測出2418個OTUs，分屬28門、70綱、170目、269科、465屬、963種，其中變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）是主要的優(yōu)勢菌門，細(xì)菌群落的豐富度和多樣性指數(shù)隨連作年限的增加表現(xiàn)為先增加后降低。分析發(fā)現(xiàn)，百香果連作對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有顯著影響，其中綠彎菌門（Chloroflexi）、厚壁菌門（Firmicutes）和芽孢桿菌屬（Bacillus）的相對豐度隨連作年限的增加而顯著升高，研究結(jié)果可為百香果連作障礙發(fā)生機(jī)制的進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：西番蓮;連作障礙;高通量測序;細(xì)菌群落多樣性;土壤微生物

中圖分類號：S667.9 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Abstract： Soil bacteria play key roles in determining soil health and plant growth. Previous studies showed that conti-nuous cropping of crops altered a significant imbalance of soil bacteria communities. Five soil samples from 0 year to 4 years （TZ， TF， TS， TT， TFo ） of continuous cropping P. edulis were used as the materials， 16S rRNA was analyzed based on the Miseq platform of Illumina Company to study the soil bacterial community structure and diversity in different continuous cropping years of P. edulis. A total of 2418 OTUs for bacterial diversity were generated from the five sam-ples， which were classified in 28 phyla， 70 classes， 170 orders， 269 families， 465 genera and 963 species. Among them， Proteobacteria， Acidobacteria and Actinobacteria were the dominant phylum in the tested samples. The Ace， Chao， Shannon and Coverage index of soil bacteria increased first and then decreased with the increase of continuous cropping years. Continuous cropping of P. edulis had a significant impact on the structure of soil bacterial communities， but the influence rule on the main types species was different from the research results of other crops， with the relative abundance of Chloroflexi， Firmicutes and Bacillus increased with the increase of continuous cropping years. The research results would provide a research foundation and theoretical basis for the mechanism of continuous cropping obstacles of P. edulis in the further studies.

Keywords： passion fruit; continuous cropping obstacles; high-throughput sequencing; bacterial diversity; soil microbial

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.12.036

百香果（Passiflora edulis Sims， 2n=18）原產(chǎn)北美洲，是西番蓮科（Passifloraceae）西番蓮屬（Passiflora）植物[1]，其在食用和藥用等方面具有較大的社會經(jīng)濟(jì)價值，在巴西、哥倫比亞、越南等國家及我國臺灣地區(qū)廣泛用于鮮果、飲料、香料等商業(yè)化發(fā)展[2-4]。百香果于20世紀(jì)80年代引入我國大陸地區(qū)，目前，在我國南部的廣西、福建、海南、廣東，及西南的貴州和云南等地區(qū)的種植面積已逾4萬hm2[5]，因其當(dāng)年種植當(dāng)年見效，近年來，百香果產(chǎn)業(yè)在脫貧攻堅過程中起到了重要的作用，其中，貴州省自2019年以來，便將百香果作為主要的扶貧產(chǎn)業(yè)進(jìn)行規(guī)?；l(fā)展，種植面積已超過1萬hm2。

百香果雖為多年生藤本植物，但在實踐中，其種植第一年產(chǎn)量較高，從第二年開始，病蟲害發(fā)生頻次和程度增加，從而導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)的降低，為了克服這一問題，生產(chǎn)中一般采用一年一種，但一年一種的連作也對百香果產(chǎn)量和品質(zhì)產(chǎn)生了嚴(yán)重的影響，筆者前期的調(diào)查[6]表明，隨著百香果連作年限的增加，其葉片和果實染病率顯著升高，植株平均單株結(jié)果量和果實大小也顯著降低。Wang等[7]的研究結(jié)果表明，百香果連作土壤對百香果苗的生長具有抑制作用，并且隨著連作年限的增加，抑制效果也逐漸增加。

細(xì)菌在土壤中廣泛分布，并且具有較高的豐度，其通過利用植物根際分泌物作為營養(yǎng)源與植物形成相互作用，從而影響植物的生長發(fā)育[8]。土壤細(xì)菌群落平衡與否，對植物的生長發(fā)育起著重要的影響[9]，研究表明，作物連作會破壞土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，促進(jìn)有害菌物的生長，抑制有益微生物的繁殖，從而對作物的生長、產(chǎn)量和品質(zhì)造成負(fù)面影響[10-11]，該觀點在馬鈴薯[12]、紅薯[13]、菠蘿[14]、大豆[15]等作物連作的研究中得到驗證。連作對細(xì)菌群落的影響因作物種類的不同而不盡相同[12，16]，目前對百香果連作的研究，僅Wang等[7]對百香果連作土壤的自毒作用開展了研究，陳曉婷等[17]對百香果連作土壤微生物生物量進(jìn)行了定量研究，結(jié)果表明隨著百香果連作年限的增加，土壤細(xì)菌與放線菌數(shù)量呈顯著下降趨勢，而真菌數(shù)量呈顯著上升趨勢，但對百香果連作后土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其多樣性如何變化并未開展相關(guān)分析，百香果連作對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響如何尚未清楚。本文以我國栽培最多的‘臺農(nóng)1號’百香果為對象，利用高通量測序技術(shù)，對不同連作年限百香果土壤細(xì)菌群落變化開展研究，旨在探索百香果連作對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性的影響，為進(jìn)一步解釋百香果連作障礙發(fā)生機(jī)理提供依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

百香果種植基地位于貴州省黔南布依族苗族自治州平塘縣克度鎮(zhèn)（1065236 E，254338 N），海拔約850 m，屬亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候，年平均氣溫16.8 ℃，年均降水量1100 mm～ 1300 mm，無霜期310 d，土壤為白云質(zhì)砂壤土。該基地為撂荒地自2016年以來逐年開墾而來，種植方式均為一年一種，最長的地塊已連續(xù)種植百香果4 a。筆者前期對該基地不同連作年限百香果的農(nóng)藝性狀的調(diào)查結(jié)果顯示[6]，隨著連作年限的增加，百香果葉片和果實的染病率及病害程度均顯著增加，同時其果實大小、單株結(jié)果量及產(chǎn)量均顯著降低。

1.2 ?方法

1.2.1 ?實驗設(shè)計 ?研究對象選取該基地種植年限為1年（TF）、2年（TS）、3年（TT）、4年（TFo）且種植品種均為紫果百香果（Passifora edulis）的根區(qū)土壤，以及種植年限為0年（TZ）的撂荒地土壤。不同年限地塊百香果種植株行距為2 m×2 m，“門”字型搭架，每年3月下旬定植，統(tǒng)一水肥和修剪管理，次年2月清園，種植年限4 a的地塊（TFo）為2016年3月開始種植，1年（TF）地塊為2019年3月種植。撂荒地植被主要為白茅（Imperata cylindrica）等雜草。

1.2.2 ?樣品采集與制備 ?2020年1月3日，天氣晴朗，在不同年限百香果種植地中隨機(jī)選擇3個相距50 m以上的地塊，每個地塊按照相鄰兩點間距離不小于3 m，且相鄰3點不在同一水平直線上的原則，采集5個百香果根區(qū)深10～20 cm的表土，5點混合，去除殘渣、過2 mm孔徑土壤篩混勻后，用四分法分取部分樣品裝入無菌離心管置于干冰中保存，運(yùn)回實驗室放入–70 ℃冰箱凍存，用于核酸提取。

1.2.3 ?核酸提取及測序 ?使用Omega Bio-Tek公司（Omega Bio-Tek， Norcross， GA， USA）提供的土壤DNA試劑盒提取土壤微生物總DNA，使用338-F（5-ACTCC TACGGGAGGCAGCAG-3）和806R（5-GGACTA CHVGGGTWTCTAAT-3）[18]引物對土壤細(xì)菌16S rRNA V3-V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用MiseqPE300平臺（Illumina， San Diego，USA）進(jìn)行高通量進(jìn)行測序、拼接。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

使用fastp[19]（https：//github.com/OpenGene/ fastp）軟件對原始測序序列進(jìn)行質(zhì)控，使用FLASH[20]（http：//www.cbcb.umd.edu/software/flash）軟件進(jìn)行拼接。在97%相似水平上對優(yōu)化序列進(jìn)行OUT聚類，在聚類過程中過濾序列總數(shù)少于7，出現(xiàn)樣本數(shù)少于3個的OUT，并去除葉綠體目（Chloroplast）和豐度較低且未注釋到的物種，并按最小樣本序列數(shù)對所得的OUT序列進(jìn)行抽平，生成OUT數(shù)據(jù)表，采用RDPclassifier對97%相似水平的OTU序列進(jìn)行分類學(xué)分析，并對比Silva（Release132http：//www.arb-silva.de），Green?gene（Release 13.5 http：//greengenes.secondgenome. com/）數(shù)據(jù)庫，在各個分類水平統(tǒng)計樣品的群落組成。運(yùn)用mothur（version v.1.30.1 http：//www.

mothur.org/wiki/Schloss_SOP#Alpha_diversity）計算細(xì)菌群落的豐度、多樣性和覆蓋度指數(shù)（Chao、Shannon 、Simpson、Ace、Coverage）并用Welch's t test進(jìn)行組間差異檢驗。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?測序數(shù)據(jù)

本研究基于Illumina高通量測序平臺，對不同連作年限百香果土壤進(jìn)行細(xì)菌16S rRNA序列V3-V4區(qū)進(jìn)行高通量測序分析，結(jié)果如表1所示，15個土壤樣本共獲得683 325條原始序列（sequences），過濾和去除出現(xiàn)樣本數(shù)較少和未注釋物種的序列后，共獲得394 528條有效序列，序列長度范圍在202～526 bp之間，平均序列長度為413.82 bp。各樣本覆蓋率均大于98%，說明各樣本細(xì)菌基因序列被檢出的概率較高，能較真實地反映樣本的細(xì)菌群落，測序深度滿足要求。在3%的差異閾值下，采用RDP classifier對獲得的序列進(jìn)行分類，共獲得2418個細(xì)菌OTUs，歸類為28門、70綱、170目、269科、465屬、963種。

2.2 ?稀釋曲線與Alpha多樣性分析

2.2.1 ?稀釋曲線 ?從圖1A的Sobs指數(shù)稀釋曲線可知，隨著測序數(shù)據(jù)量增加，Sobs指數(shù)逐漸趨于平緩，說明測序數(shù)據(jù)量合理;Shannon多樣性指數(shù)曲線隨著樣本測序數(shù)據(jù)的增加，最終趨于平坦（圖1B），說明測序數(shù)據(jù)能反映樣本中絕大多數(shù)的微生物多樣性信息。

2.2.2 ?Alpha多樣性分析 ?不同連作年限百香果土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)如表2所示，Coverage指數(shù)表示樣本的文庫覆蓋率，其數(shù)值越高，表示樣本中序列被測出的概率越高，如表2所示，各樣本Coverage指數(shù)均大于98%，說明各樣本細(xì)菌基因序列被檢出的概率較高，能較真實地反映樣本的細(xì)菌群落;Ace和Chao指數(shù)反映細(xì)菌群落的豐富度程度，指數(shù)值越高，樣本細(xì)菌豐富度越高;Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)反映樣本中細(xì)菌群

落的多樣性程度，Shannon值越大，表明細(xì)菌多樣性越高，Simpson指數(shù)值越大，表明細(xì)菌優(yōu)勢度越高，均勻性越低，多樣性越低。各樣本Ace、Chao、Shannon和Simpson指數(shù)差異顯著（P<0.05），如表2所示，隨著種植年限的增加，百香果種植土壤細(xì)菌的豐富度、多樣性指數(shù)均呈先增加后降低的趨勢，其中Ace和Chao指數(shù)在種植第2年時達(dá)到最大，Shannon多樣性指數(shù)在連作第3年時達(dá)到峰值，Simpson指數(shù)在前3年逐漸降低，連作4 a時與撂荒地相近。上述結(jié)果說明連作能顯著影響百香果根區(qū)土壤細(xì)菌群落的多樣性。

2.3 ?土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

2.3.1 ?不同連作年限土壤細(xì)菌群落物種組成 ?通過高通量測序表明，不同連作年限百香果土壤細(xì)菌群落中，相對豐度大于1%的門類有15種（圖2），主要優(yōu)勢種類為變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actin?obacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、浮霉菌門（Planctomycetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、疣薇菌門（Verrucomicrobia）和Candidata division WPS-2，約占所有細(xì)菌豐度的85%～95%，其中變形菌門、變形菌門、放線菌門和綠彎菌門等4種細(xì)菌類群是百香果種植土壤中的主要菌群，占所有細(xì)菌總數(shù)的80%以上。

將不同連作年限土壤細(xì)菌優(yōu)勢門類排名前9增加而增大的趨勢。

在屬水平上，將相對豐度排名前30位的屬進(jìn)行聚類分析，繪制成熱圖（圖4），結(jié)果顯示相對豐度排名前30位的細(xì)菌來源于變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、浮霉菌門（Planc-tom?ycetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、WPS-2、己科河菌門（Rokubacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）等9個門類，其中變形菌門、酸桿菌門和放線菌門占前30屬中的66.7%，分別為10屬、5屬和5屬。

所有樣本中，相對豐度大于1%的屬有24屬，相對豐度占58.51%，其中相對豐度最高的10屬占總豐度的40.68%，依次分別為酸桿菌門Subgroup_2目下的未定名屬（占8.57%）、變形菌門根瘤菌目的未定名屬（占5.12%）、酸桿菌目未定名屬（占4.81%）、熱酸菌屬（Acidothermus，占4.38%）、Elsterales目未定名屬（占3.52%）、出芽菌科（Gemmataceae）未定名屬（占2.78%）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium， 占2.71%）、Candidatus Solibacter（占2.43%）、水球菌屬（Aquisphaera，占2.16%）、酸桿菌門Subgroup_6綱下未定名屬（占2.11%）、變形菌門Acidibacter屬（占2.09%）。

方差分析結(jié)果表明，不同連作年限土壤細(xì)菌間，前30屬的相對豐度差異顯著（P<0.05），其中酸桿菌門Subgroup_2目下的未定名屬、Aquisphaera、Acidibacter、Bryobacter、分枝桿菌屬（Mycobacterium）等屬的豐度隨連作年限的增加而顯著降低，而芽孢桿菌屬（Bacillus）、酸桿菌門Subgroup_6綱下未定名屬等屬豐度隨連作年限增加而顯著增大。

2.3.2 ?不同連作年限土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu) ?為了進(jìn)一步對細(xì)菌群落物種組成差異進(jìn)行分析，探討不同連作年限間群落細(xì)菌組成的相似性或差異性，基于Bray-Curtis距離算法，采用主坐標(biāo)分析（PCoA）對不同連作年限土壤細(xì)菌群落差異進(jìn)行分析，結(jié)果如圖5所示，在OUT水平上，PC1與 PC2分別解釋方差為54.96%和17.02%，累計解釋能力達(dá)71.98%，不同連作年限間土壤細(xì)菌群落差異顯著（P=0.001，R=1），撂荒地土壤樣本與百香果種植地樣本在第一主成分上很好地被區(qū)分，種植第一年（TF）與種植第二年（TS）土壤細(xì)菌群落組成較相近;每個處理的3個重復(fù)樣本的聚集性較好，顯示出較好的重復(fù)性，第一年種植的土壤細(xì)菌組內(nèi)差異較大。同時，采用Bray-Curtis算法對15個土壤樣本細(xì)菌群落進(jìn)行樣本層級聚類分析，結(jié)果表明（圖6）：15個土壤樣本明顯聚集為5組，與5個連作年限對應(yīng)，其中連作3 a的樣本（TT）單獨為一簇，與其他4個樣本分開; 第一年種植（TF）和第二年種植（TS）的樣本與撂荒地（TZ）的相似距離較近，說明百香果連作顯著影響土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。

3 ?討論

3.1 ?百香果不同連作年限土壤細(xì)菌多樣性

基于IlluminaMiseq高通量測序平臺，對不同連作年限百香果土壤進(jìn)行細(xì)菌16S rRNA序列V3-V4區(qū)的高通量測序，以研究百香果不同連作年限下土壤細(xì)菌群落變化，結(jié)果表明，百香果不同種植年限間土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)差異顯著，細(xì)菌豐富度和多樣性隨著種植年限的增加均表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢，其中Ace和Chao指數(shù)在種植第2年時達(dá)到最大，Shannon多樣性指數(shù)在連作第3年時達(dá)到峰值，Simpson指數(shù)在前3年逐漸降低，連作4 a時與撂荒地相近。與Zhang等[21]對棉花長期連作的研究結(jié)果相似，原因可能是開墾直接改變了原生系統(tǒng)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化，撂荒地開墾后，隨著有機(jī)肥等養(yǎng)分輸入，增加了細(xì)菌的豐富度和多樣性，但長時間連作后又使土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。有研究表明[22]，施肥和耕作年限對土壤微生物有著顯著的影響，前人對苜蓿的研究[23-26]也表明，苜蓿土壤細(xì)菌豐富度指數(shù)和多樣性在連作10 a內(nèi)呈增加趨勢，但在連作10～16 a內(nèi)呈降低趨勢，與本研究表現(xiàn)出相似的趨勢。

3.2 ?百香果不同連作年限細(xì)菌種類組成

高通量測序結(jié)果表明，百香果種植地樣品中共鑒定細(xì)菌28門，其中變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、浮霉菌門（Planctomycetes）是樣品中的主要優(yōu)勢門類，土壤細(xì)菌優(yōu)勢菌門類組成與馬鈴薯[12]、紅薯[13]、菠蘿[14]、西紅柿[27]和煙草[28]等作物相似，其中變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）也被認(rèn)為是高通量測序下，農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)和其他土壤類型中最常見的菌門[29]。綠彎菌門（Chloroflexi）的相對豐度隨種植年限的增加呈逐漸升高的趨勢，厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）相對豐度在前3年連作中也呈逐漸升高的趨勢，與對紅薯[13]的研究結(jié)果相似，但與對黑胡椒（black pepper）[30]、大豆[15]和馬鈴薯[12]等作物的研究結(jié)果相反，這可能是因為連作對不同作物土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響不同導(dǎo)致，以往的研究認(rèn)為，即使在相同的土壤條件下，不同植物種類和根系分泌物決定了土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)[16， 31]。

在屬水平上，芽孢桿菌屬（Bacillus）、酸桿菌門Subgroup_6綱下未定名屬豐度隨連作年限增加而顯著增大，前者與對大豆[15]的研究結(jié)果相似，后者與對棉花[21]的研究結(jié)果相似。有研究認(rèn)為，芽孢桿菌屬（Bacillus）細(xì)菌可以產(chǎn)生毒素以抑制土壤內(nèi)的其他菌物和動物的生長發(fā)育[32-33]，一些研究[34]認(rèn)為，芽孢桿菌屬（Bacillus）產(chǎn)生的毒素可以抑制土壤內(nèi)有害昆蟲和病菌的生長，所以作物連作時，芽孢桿菌屬（Bacillus）細(xì)菌豐度降低導(dǎo)致土傳病蟲害增加可能是連作障礙發(fā)生的原因之一，但本研究和對大豆[15]的研究結(jié)果表明，隨著連作年限的增長，該屬細(xì)菌豐度呈顯著升高的趨勢，這也可能會因芽孢桿菌屬（Bacillus）豐度增加，其產(chǎn)生的毒素亦會對作物本身及有益菌產(chǎn)生毒害作用，從而產(chǎn)生連作障礙。

3.3 ?不同連作年限土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

基于樣本OUT組成及Bray-Curtis算法的主坐標(biāo)分析（PCoA）和樣本層級聚類分析結(jié)果均表明，不同連作年限樣本間細(xì)菌群落組成和結(jié)構(gòu)均存在顯著差異，而同一種植年限3個重復(fù)樣本間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)較為相似，結(jié)果與大部分作物連作的研究[13， 30， 34]得到的結(jié)論相同，即作物長期連作可能會極大地影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。但與其他作物相比，本研究結(jié)果中，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的相似距離并未隨著連作年限的增加而增加，而是和細(xì)菌多樣性指數(shù)的變化趨勢較為相似，即呈現(xiàn)細(xì)菌群落相似距離隨連作年限的增加呈先增加后降低的趨勢，其中撂荒地細(xì)菌群落與連作第3年（TT）的細(xì)菌群落相似距離最大，出現(xiàn)這種結(jié)果的原因可能與耕作年限有關(guān)，同時，如討論3.2中所述，雖然連作對土壤細(xì)菌整體的群落組成及結(jié)構(gòu)有顯著的影響，但因作物及物種基因型間的差異，不同作物連作對微生物種類及豐度的影響也各不相同，甚至?xí)玫较喾吹慕Y(jié)果。

4 ?結(jié)論

本研究通過16S rRNA高通量測序研究了百香果連作土壤細(xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，百香果連作顯著影響了土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性，土壤細(xì)菌的豐富度和多樣性隨連作年限的增加表現(xiàn)為先增加后降低;變形菌門（Proteobac-teria）、酸桿菌門（Acidobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）是百香果種植土壤中的主要優(yōu)勢菌門，連作對放線菌門（Actinobacteria）影響不顯著，綠彎菌門（Chloroflexi）和厚壁菌門（Firmicutes）相對豐度隨連作年限的增加顯著升高。百香果連作對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有顯著影響，但對細(xì)菌主要種類的影響規(guī)律與其他作物研究結(jié)果有所區(qū)別，因此，需要進(jìn)一步從更長連作周期和多樣本開展百香果連作對土壤微生物群落及百香果生長發(fā)育影響的研究，以探明百香果連作障礙發(fā)生機(jī)制。

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