高 鋒，何明霞，張春霞，劉 靜，許欣景，曹 旸

（1.云南省熱帶作物科學(xué)研究所，云南景洪666100；2.云南省景洪宏臻農(nóng)業(yè)科技有限公司，云南景洪666100）

暗褐網(wǎng)柄牛肝菌Phlebopus portentosus（Berk.&Broomo）Boedijn，又名黑牛肝菌，隸屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycota）傘菌（Agaricomycetes）牛肝菌目（Boletales）小牛肝菌科（Boletinellaceae）脈柄牛肝菌屬（Phlebopus），分布于斯里蘭卡、越南、印度尼西亞、泰國(guó)、巴西、墨西哥、澳大利亞、新西蘭等國(guó)家，國(guó)內(nèi)的廣西、海南、云南等省區(qū)都有分布［1-7］。其子實(shí)體味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。相對(duì)于其他的分子標(biāo)記，SSR標(biāo)記的變異速度更快，適用于食用菌生產(chǎn)菌株的鑒定及遺傳多樣性的分析。在前期的工作中，我們使用由基因組數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)的15個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)33個(gè)生產(chǎn)菌株進(jìn)行了鑒定，由于樣品數(shù)量及采樣范圍的影響，僅有5個(gè)標(biāo)記表現(xiàn)出了中度多態(tài)性特征［8］。為此，在進(jìn)一步的工作中，我們擴(kuò)大了SSR標(biāo)記及樣品的篩選范圍，以期尋找到具有更好的多態(tài)性、穩(wěn)定性和重復(fù)性，能夠更充分反映暗褐網(wǎng)柄牛肝菌遺傳多樣性及群體遺傳學(xué)特征的SSR分子標(biāo)記。

1 材料和方法

1.1 樣品來(lái)源

157樣品來(lái)自12個(gè)地理群體，涉及云南、廣西、四川三個(gè)省區(qū)，部分來(lái)自澳大利亞和新西蘭。

1.2 基于基因組數(shù)據(jù)的SSR引物設(shè)計(jì)和篩選

根據(jù)文獻(xiàn)資料，SSR單元的重復(fù)次數(shù)越高，其具有高多態(tài)性的可能越大［9］。因此，本次開(kāi)發(fā)標(biāo)記主要針對(duì)二堿基重復(fù)10次以上，三堿基重復(fù)7次以上，四堿基重復(fù)6次以上，五堿基重復(fù)6次以上，及六堿基重復(fù)6次以上的SSR標(biāo)記，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度小于600 bp。具體步驟如下：

a.運(yùn)用MISA軟件搜索SSR，以暗褐網(wǎng)柄牛肝菌基因組［10］contig序列為輸入文件，分別設(shè)置軟件的definition參數(shù)（重復(fù)單元/最小重復(fù)數(shù)）為2/10、3/7、4/6、5/6和 6/6，并將 interruptions參數(shù)設(shè)置為600，即間隔小于600 bp的兩個(gè)SSR在搜索中將被劃為一個(gè)compound SSR，其余為perfect SSR。

b.設(shè)置MISA軟件的definition參數(shù)為1/8、2/5、3/4、4/4、5/4和6/4，interruptions參數(shù)為 600，對(duì)基因組contig數(shù)據(jù)再次進(jìn)行搜索。

c.選取步驟a中得到的perfect SSR，與步驟b所得結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，若該位點(diǎn)在步驟b結(jié)果中為compound SSR，則剔除該位點(diǎn)，其余位點(diǎn)可用于PCR引物設(shè)計(jì)。該步驟目的在于排除PCR產(chǎn)物中存在的多個(gè)SSR導(dǎo)致分型結(jié)果不準(zhǔn)確。

d.選取步驟c中篩選出的SSR位點(diǎn)及其上下游各600 bp的側(cè)翼序列，運(yùn)用Primer Premier 6軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，并將產(chǎn)物長(zhǎng)度控制在600 bp以下。

e.運(yùn)用本地blastn程序，將步驟d中獲得的引物序列與基因組序列進(jìn)行比對(duì)，確保該引物在基因組中有唯一的配對(duì)位點(diǎn)。

從每個(gè)地理群體樣品中隨機(jī)選取2個(gè)樣品，共20個(gè)樣品，對(duì)上述引物進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。

采用兩輪PCR的方法：第一輪，在上述引物對(duì)的正向引物上接上M13F接頭，與相應(yīng)的反向引物一起進(jìn)行PCR，退火溫度值平均61℃；第二輪，以帶熒光標(biāo)記（FAM或HEX）的M13F引物，與各特異性反向引物，對(duì)上一輪的產(chǎn)物進(jìn)行第二輪PCR，退火溫度值平均56℃。對(duì)獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定，獲取鑒定膠圖，確定模板濃度，加水稀釋，在ABI3730測(cè)序儀上進(jìn)行毛線管電泳。

1.3 SSR標(biāo)記的多態(tài)性分析

利用篩選得到引物對(duì)全部樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，合成引物時(shí)在正向引物末端加上FAM或HEX熒光標(biāo)記。PCR產(chǎn)物使用ABI 3730測(cè)序儀進(jìn)行基因分型。

使用軟件Gene mapper 4.1（Applied Biosystems Co.，Ltd.，USA），參照引物對(duì)應(yīng)關(guān)系的核心堿基重復(fù)數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)準(zhǔn)確位點(diǎn)的分析。采用Popgene 32計(jì)算等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Shannon's信息指數(shù)、期望雜合度、觀測(cè)雜合度。應(yīng)用NTSYS-pc-2.10軟件計(jì)算遺傳相似系數(shù)，用非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物設(shè)計(jì)及篩選結(jié)果

基于基因組數(shù)據(jù)，共設(shè)計(jì)得到43對(duì)SSR引物（表1），其中：兩堿基單元的位點(diǎn)4個(gè)，三堿基單元的位點(diǎn)29個(gè)，四堿基單元的位點(diǎn)4個(gè)，五堿基單元的位點(diǎn)1個(gè)，六堿基單元的位點(diǎn)5個(gè)。PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度為114～588 bp。

在預(yù)實(shí)驗(yàn)樣品中，根據(jù)毛細(xì)管電泳結(jié)果，選取擴(kuò)增成功率高、無(wú)干擾峰、多樣性高的引物作為正式試驗(yàn)的引物。最終，由43對(duì)引物中共篩選得到 30對(duì)引物，編號(hào)分別為：SSR01，SSR02，SSR03，SSR04，SSR05，SSR06 ，SSR07，SSR08，SSR09，SSR11，SSR12，SSR13，SSR14，SSR16，SSR17，SSR18，SSR20，SSR22，SSR25，SSR26，SSR27，SSR30，SSR31，SSR32，SSR33，SSR36，SSR42，SSR43，SSR47，SSR50。其中，無(wú)兩堿基單元的位點(diǎn)，三堿基單元的位點(diǎn)22個(gè)，四堿基單元的位點(diǎn)4個(gè)，五堿基單元的位點(diǎn)1個(gè)，六堿基單元的位點(diǎn)3個(gè)。PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度為114～561 bp。

表1 由基因組數(shù)據(jù)中開(kāi)發(fā)的43對(duì)引物

2.2 SSR標(biāo)記的多態(tài)性分析

30對(duì)引物在供試的157個(gè)樣品中均表現(xiàn)出多態(tài)性（表2），共檢測(cè)到229個(gè)等位基因，每個(gè)位點(diǎn)4～15個(gè)，平均7.61個(gè)；有效等位基因數(shù)介于1.58～7.01，平均值3.59；觀測(cè)雜合度介于0.18～0.8，平均值0.5；期望雜合度介于0.37～0.86，平均值0.67；Shannon's信息指數(shù)介于0.71～2.19，平均值1.43。以上指標(biāo)反應(yīng)出這30個(gè)SSR位點(diǎn)均為高度多態(tài)性位點(diǎn)。

結(jié)果顯示，157個(gè)樣品共有147種多位點(diǎn)分子表型。共享多位點(diǎn)分子表型的樣品分別來(lái)自同一采樣地點(diǎn)，推測(cè)來(lái)源于同一菌絲無(wú)性繁殖系。從聚類結(jié)果來(lái)看（圖1），樣品并未按地理群體聚在一起，說(shuō)明各個(gè)地理群體間有基因交流。來(lái)自澳大利亞和新西蘭的樣品未與來(lái)自中國(guó)的樣品完全分開(kāi)。

圖1 基于30個(gè)SSR標(biāo)記的UPGMA聚類分析

3 結(jié)論

SSR在真核、原核生物中廣泛存在，是重要分子的標(biāo)記，在基因分型、群體遺傳學(xué)、遺傳圖譜等方面被廣泛應(yīng)用。有一些SSR還具有一定的功能性，例如改變表型特征，調(diào)控基因表達(dá)等等。因此近年來(lái)關(guān)于SSR全基因組掃描方面的研究也越來(lái)越多。在本研究中，從暗褐網(wǎng)柄牛肝菌基因組中設(shè)計(jì)SSR標(biāo)記引物時(shí)，通過(guò)控制堿基單元重復(fù)次數(shù)，區(qū)別compound SSR和perfect SSR，將PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度限制放寬至600 bp，及在基因組中比對(duì)引物的唯一性等手段，獲得了43對(duì)引物。經(jīng)過(guò)實(shí)際的PCR擴(kuò)增和基因分型實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，43對(duì)引物中有30對(duì)引物都是具有高度多態(tài)性的，在157個(gè)樣品中形成了147種多位點(diǎn)分子表現(xiàn)。說(shuō)明本研究中所采用的從基因組數(shù)據(jù)中開(kāi)發(fā)SSR標(biāo)記引物的辦法是行之有效的，相比于在基因組中隨機(jī)挑選SSR位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物［8］獲得高多態(tài)性位點(diǎn)引物的概率更高。相較于低多態(tài)性的SSR標(biāo)記，高多態(tài)性的SSR標(biāo)記在菌株親緣關(guān)系鑒定，輔助遺傳育種和商業(yè)品種DNA指紋圖譜構(gòu)建中，包含更大的信息量和分辨率，能更好地發(fā)揮分子標(biāo)記的作用，因此在未來(lái)的工作中，還應(yīng)繼續(xù)尋找不同的方法用于黑牛肝菌高多態(tài)性SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)。