劉夢月 趙文玉

研究進(jìn)展

eDNA技術(shù)在極地水環(huán)境中的應(yīng)用進(jìn)展

劉夢月1,2趙文玉1,2

(1湖南省水生資源食品加工工程技術(shù)研究中心, 長沙理工大學(xué)化學(xué)與食品工程學(xué)院, 湖南 長沙 410004;2洞庭湖水環(huán)境治理與生態(tài)修復(fù)湖南省重點實驗室, 長沙理工大學(xué)水利工程學(xué)院, 湖南 長沙 410004)

應(yīng)用環(huán)境DNA(eDNA)技術(shù)高效準(zhǔn)確地完成極地水生態(tài)系統(tǒng)(極區(qū)大洋, 近岸海域及湖泊、溪流等)中生物的物種鑒別、多樣性分析等研究工作, 對開發(fā)極地地區(qū)生物資源、預(yù)測全球水生態(tài)系統(tǒng)變化趨勢和平衡穩(wěn)定和研究極端生境生態(tài)學(xué)問題等具有重要價值。近年來, eDNA技術(shù)發(fā)展迅速, 有效地改進(jìn)了傳統(tǒng)方法在水生態(tài)系統(tǒng)研究中的缺點, 提高了對水生生物的調(diào)查工作的效率。文章綜述了eDNA技術(shù)對極地水環(huán)境中的魚類、底棲生物、浮游生物、浮游細(xì)菌、病毒等水生生物的生物多樣性分析、物種鑒定、種群結(jié)構(gòu)分析及生態(tài)學(xué)等方面研究的應(yīng)用進(jìn)展。eDNA技術(shù)作為一種新興的生物調(diào)查方法, 有能力加速更新分子時代的現(xiàn)代生物多樣性調(diào)查的方法, 在研究極地水生生物多樣性上具有極大的前景。

eDNA 極地 水環(huán)境 水生生物 生物多樣性

0 引言

環(huán)境DNA(簡稱eDNA)指直接從環(huán)境樣品(如土壤、水和沉積物等)獲得的遺傳物質(zhì)(DNA片段)[1-2]。eDNA技術(shù)是通過從各環(huán)境介質(zhì)中提取出特異性的DNA識別片段, 使用DNA測序技術(shù)分析所提取環(huán)境DNA的識別片段情況, 定性或者定量地分析生物體在環(huán)境介質(zhì)中的具體分布情況和生態(tài)功能特征[1-2]。eDNA對原位采樣生境中的生物類群無擾動性, 因此還有可能改善極地水生態(tài)系統(tǒng)的環(huán)境管理和評估方法[3]。eDNA技術(shù)在水生態(tài)系統(tǒng)可以進(jìn)行目標(biāo)物種的鑒別(如外來入侵物種、瀕危物種和珍稀物種)、生物多樣性監(jiān)測與評價等工作。

1 eDNA技術(shù)的發(fā)展簡介

eDNA技術(shù)發(fā)展離不開DNA測序技術(shù)的發(fā)展, 自20世紀(jì)70年代中期的第一代測序技術(shù)誕生以來, DNA測序技術(shù)已經(jīng)取得了重大進(jìn)展[4-5](圖1)。第一代測序技術(shù)出現(xiàn)在1977年, 即Maxam和Gilbert發(fā)明的化學(xué)降解法及Sanger的雙末端終止法[6-7]?；诘谝淮鷾y序技術(shù)的發(fā)展, 2003年提出的條形碼技術(shù)通過用特定的短DNA序列將物種進(jìn)行比對, 實現(xiàn)了對生物的分類鑒定[8]。接下來應(yīng)運而生的第二代測序技術(shù)(next-generation sequencing technology, NGS, 即高通量測序技術(shù)), 解決了第一代測序通量低、無法達(dá)到大規(guī)模應(yīng)用的問題, 為生物分子研究做出了巨大貢獻(xiàn)。eDNA宏條形碼技術(shù)在二代測序的基礎(chǔ)上通過對eDNA片段進(jìn)行測序, 并將所得序列與標(biāo)準(zhǔn)條形碼對比, 鑒定目標(biāo)生物的種類[9]。1988年, Handelsman等[10]提出的宏基因組學(xué)概念為研究微生物提供了新的思路和方法。但直到基于第二代測序技術(shù)的宏基因組學(xué)分析方法建立才使直接從環(huán)境樣本中提取基因組DNA后進(jìn)行測序分析成為可能。宏基因組學(xué)技術(shù)是基因克隆文庫的進(jìn)一步深化, 避免了微生物培養(yǎng)的繁瑣過程, 促進(jìn)了對極端環(huán)境下生物多樣性及功能的認(rèn)識, 在eDNA技術(shù)的應(yīng)用中扮演不可或缺的角色[11]。隨著人們對DNA的研究進(jìn)一步發(fā)展, 第三代測序技術(shù)已不再依賴聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)技術(shù)[12]。

自步入基因組學(xué)時代, eDNA技術(shù)經(jīng)過10余年的發(fā)展, 從1987年開始在環(huán)境微生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用, 微生物學(xué)家Ogram等[13]成功地從湖底沉積物中提取出環(huán)境微生物的DNA。2000年, “eDNA”第一次在文獻(xiàn)中出現(xiàn), 該研究中利用細(xì)菌人工染色體(BAC)載體構(gòu)建了基因組DNA文庫, 并表明了BAC文庫中含有多種環(huán)境DNA, 在研究土壤微生物多樣性方面有巨大的潛力, 使eDNA技術(shù)真正得到認(rèn)可[14-15]。2008年, eDNA技術(shù)第一次運用于水生態(tài)系統(tǒng)中, 研究人員利用從水樣中提取的DNA去檢測一種原產(chǎn)于北美的入侵性兩棲動物美國牛蛙是否入侵水域中[1]。之后, eDNA技術(shù)開始廣泛應(yīng)用于水生系統(tǒng)生物研究中。2014年, 研究員第一次利用eDNA技術(shù)檢測薩卡里亞河中4種常見的入侵魚類, 調(diào)查表明了eDNA可以用作監(jiān)測淡水生態(tài)系統(tǒng)中入侵魚類的重要分子工具[16]。

隨著eDNA技術(shù)的日益成熟, 其應(yīng)用由對物種監(jiān)測的定性研究到現(xiàn)在對生物量評估的相對定量分析, 研究對象由微生物研究到兩棲動物、淡水魚類、海洋魚類、爬行動物和腹足動物研究等[17]。第二代測序技術(shù)的發(fā)展促使eDNA技術(shù)迅速推廣, 在物種鑒定研究上由當(dāng)初的單個物種鑒定過渡到整個生物群的分析鑒定[18]。比如, NGS技術(shù)已經(jīng)成功用于對無脊椎動物(大樣本)的整個群落測序工作中[19-22]。此外, 使用eDNA可監(jiān)測瀕臨滅絕的淡水昆蟲、甲殼類動物、魚類和哺乳動物, 并可以通過NGS技術(shù)來解釋對整個湖區(qū)的兩棲動物和魚類的監(jiān)測情況[23]。發(fā)展到如今的第三代測序已經(jīng)可以不需要經(jīng)過PCR擴(kuò)增, 就實現(xiàn)了對DNA分子的測序[24]。

圖1 eDNA發(fā)展歷程導(dǎo)覽圖

Fig.1. Development path of eDNA

近年來將新一代eDNA技術(shù)[24]與機器學(xué)習(xí)[25]、衛(wèi)星遙感[26-27]等技術(shù)聯(lián)用, 已經(jīng)可以大尺度、靈敏、自動地獲取生態(tài)監(jiān)測信息, 識別水生態(tài)系統(tǒng)中水生生物群落的分布情況[28]。除此之外, eDNA技術(shù)還具有以下優(yōu)點: 優(yōu)越的物種可檢測性和特異性、成本較低且不會造成生態(tài)系統(tǒng)干擾、無需獲知物種的基本信息即可進(jìn)行檢測、可在無法進(jìn)行傳統(tǒng)調(diào)查的地區(qū)實施等, 使得環(huán)境DNA技術(shù)作為一種新興的監(jiān)測方法, 雖然仍需要考慮和避免許多陷阱和障礙, 但該方法仍有能力加速更新分子時代的現(xiàn)代生物多樣性調(diào)查的方法, 在生物多樣性監(jiān)測研究上具有極大的前景[17]。

2 eDNA技術(shù)在極地生態(tài)系統(tǒng)中的應(yīng)用

極地地區(qū)終年寒冷干燥, 冰雪覆蓋, 給預(yù)測和改善極地環(huán)境的研究工作帶來極大的不便, 并且極地生態(tài)系統(tǒng)是一個巨大的、潛在的淡水和生物資源庫, 是全球生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分。極地生物是極地生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動中的重要載體, 其中有研究表明極地冰區(qū)的海洋魚類物種形成率明顯高于熱帶海洋地區(qū)[29]。隨著生物研究技術(shù)的不斷發(fā)展, 從分子和基因組水平對極地生態(tài)系統(tǒng)的研究將豐富對其的科學(xué)認(rèn)知。應(yīng)用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法對極地水生生物進(jìn)行定性和定量的研究有很大的局限性, 如原位采樣難度很大, 樣本完整性難以預(yù)測等。相對而言, 在氣候條件極為惡劣的極地地區(qū)采用eDNA技術(shù)采樣受限小、高效省時, 在研究極地水生生物方面有較為突出的優(yōu)勢。eDNA技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于極地水環(huán)境中魚類、底棲生物、浮游生物、浮游細(xì)菌、病毒等不同類群的多樣性分析與評估、物種鑒定、群落的生物監(jiān)測等方面的研究中。

2.1 eDNA應(yīng)用于南大洋魚類研究

近年來, eDNA條形碼技術(shù)被應(yīng)用于極地魚類的生物監(jiān)測研究中, 并實現(xiàn)了物種鑒定的標(biāo)準(zhǔn)化。所依賴的常用條形碼基因片段包括細(xì)胞色素C氧化酶I(COI)基因、葉綠體基因rbcL、18S核糖體RNA(18S ribosomal RNA, 18S rRNA)基因、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacers, ITS)基因、16S rRNA和28S rRNA等。Near等[30]使用線粒體16S rRNA的全基因序列對南大洋類胡蘿卜素魚類Performformes: Notothenioidei進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育研究發(fā)現(xiàn)南極魚亞目魚類的5個主要進(jìn)化分支分別是: 裸南極魚科、阿氏龍?科、龍?科、鱷冰魚科、南極魚科。

李淵等[31]利用形態(tài)學(xué)鑒定和基于線粒體COI基因的eDNA條形碼技術(shù)對南大洋Yelcho站周邊海域的魚類進(jìn)行物種鑒定, 從采集的8尾魚類樣品中成功鑒定出3個有效種, 有7尾是南極魚科魚類, 1尾裸南極魚科。結(jié)合兩種方法對南極魚類進(jìn)行鑒定確保了鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性和有效性。研究不僅糾正了條形碼參考數(shù)據(jù)庫中的錯誤序列, 一定程度上還反映出了南大洋魚類的物種組成和生物量均以南極魚科魚類為主[31]。

2.2 eDNA應(yīng)用于底棲生物研究

底棲生物是水生生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分, 亦是海洋環(huán)境質(zhì)量的重要指標(biāo), 對了解生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)具有重要意義[32]。按生活方式可分為底棲植物(微藻、大型海藻等)和底棲動物。以底棲藍(lán)藻為例, 藍(lán)藻群落生物量會在極地湖泊和池塘的底棲環(huán)境大量生長, 對固碳做出了重要貢獻(xiàn)[33]。

在弗雷塞爾湖底棲環(huán)境的研究中發(fā)現(xiàn)有大量的藍(lán)藻生物量積累。使用形態(tài)學(xué)和分子方法對南極維多利亞州南部弗雷塞爾湖的天然和人工微生物墊中藍(lán)藻的表型和基因型多樣性進(jìn)行分析[34]。其中分子方法指包括16S rRNA基因克隆庫, 變性梯度凝膠電泳(denatured gradient gel electrophoresis, DGGE)和測序[35], 同時結(jié)合光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果, 鑒定出8種形態(tài)性; 而分子工具則發(fā)現(xiàn)了15種系統(tǒng)型。分子結(jié)果表明南極藍(lán)藻多樣性遠(yuǎn)大于單獨依托傳統(tǒng)顯微鏡分析出的形態(tài)分型。因此, 分子工具能更完整地補充描述南極湖泊底棲中的藍(lán)藻多樣性。這也是首次采用PCR引物對16S rRNA基因和對藍(lán)藻序列特異的ITS進(jìn)行擴(kuò)增, 并進(jìn)行藍(lán)藻多樣性分析的多相分析的突破[34]。Destombe等[35]采用DNA條形碼技術(shù)對種在歐洲北大西洋和摩洛哥海岸兩種江蘺屬大型藻類進(jìn)行研究, 利用3種獨立標(biāo)記的條形碼cox2-cox3間隔區(qū)、葉綠體基因rbcL和ITS 2區(qū)域?qū)ζ洳町愡M(jìn)行遺傳分析, 證實了北大西洋存在兩個名為的并行分支物種已有200年的歷史[35]。研究同時證明多基因條形碼能更精確地描繪這兩種形態(tài)學(xué)物種并檢測假定的雜交的發(fā)生。劉晨臨和林學(xué)政[36]利用形態(tài)學(xué)和DNA條形碼對白令海海域和冰島附近海域的褐藻進(jìn)行鑒定, 并對其來源進(jìn)行分析。其中采自白令海海域的褐藻為孔葉藻亞種(), 來源于日本北海道, 另一種為瘤狀囊葉藻(), 常見于北大西洋沿岸。

Grant和Linse[37]應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)對南極海洋地區(qū)包括韋德爾海、羅斯海在內(nèi)十幾個區(qū)域的底棲無脊椎動物進(jìn)行物種鑒定和遺傳研究。研究發(fā)現(xiàn)這些水域中的無脊椎動物主要是甲殼綱、環(huán)節(jié)動物和軟體動物等3類, 該研究同時建議南極海洋地區(qū)還需要進(jìn)行更深入的DNA條碼研究, 來推動底棲動物的分子生態(tài)學(xué)研究。

2.3 eDNA應(yīng)用于浮游生物研究

浮游生物可分為浮游動物和浮游植物。通過eDNA技術(shù), 不僅有助于準(zhǔn)確地了解浮游生物生態(tài)和功能的多樣性、時空分布情況, 同時還可獲取物種間遺傳進(jìn)化信息, 尋找新的基因功能。

浮游動物是由原生動物和后生動物組成的生物群落, 主要有原生動物、輪蟲、枝角類和橈足類等四類。浮游動物生命周期短, 生長迅速, 對環(huán)境變化敏感, 常被用作指示物種。相比而言, 極地海域的浮游動物的種群演替深受海水、海冰變化的影響, 對于環(huán)境變動表現(xiàn)得更為敏感強烈, 常被用作研究全球氣候變化對極地生態(tài)系統(tǒng)影響的重要指標(biāo)[38]。DNA條形碼技術(shù)是對極地浮游動物進(jìn)行物種鑒定的一種常用方法。

在研究極地浮游動物生物多樣性分析中, 應(yīng)用eDNA宏條形碼技術(shù)可以極大地簡化分析步驟。程方平等[40]利用DNA條形碼技術(shù)驗證了南極海域DNA條形碼在浮游動物種鑒定的有效性, 研究中系統(tǒng)地比較分析了南極普里茲灣和南極半島周邊海域35種常見浮游動物的124條線粒體COI序列[39-40]。研究同時發(fā)現(xiàn)部分物種的種內(nèi)遺傳差異水平較高, 表明DNA條形碼還可用作相關(guān)物種的種群遺傳學(xué)研究[40]。此次研究新增的DNA條形碼數(shù)據(jù)以及新提供的兼并引物將推動南極浮游動物環(huán)境樣品的宏基因組學(xué)研究[40]。在北極海域的比較研究中也證實了DNA條形碼技術(shù)在極地浮游動物種類鑒定及相關(guān)研究中的可靠性[41-42]。Chain等[43]在對沿加拿大海岸線(北極)哈德遜灣和哈德遜海峽浮游動物的生物多樣性進(jìn)行大規(guī)模的時空評估中用到了eDNA宏條形碼技術(shù), 研究表明, 該技術(shù)為大規(guī)模生物多樣性調(diào)查提供了一種簡化而靈敏的方法。Heimeier等[44]基于16S rRNA、COI和18S rRNA基因擴(kuò)增的DNA條形碼技術(shù)結(jié)合傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法對南極羅斯海及附近水域浮游動物(無脊椎動物幼體)進(jìn)行了物種鑒定, 主要是棘皮動物、軟體動物、紐形動物和環(huán)節(jié)動物等4個門屬。研究同時說明了應(yīng)用分子工具可更好地補充形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果。

與浮游動物相似, 浮游植物也對環(huán)境變化極為敏感。浮游植物具有個體小、生長周期短、營浮游生活等特點。極地微型浮游植物較多是低等單細(xì)胞藻類, 是極地生態(tài)系統(tǒng)重要的初級生產(chǎn)者和食物網(wǎng)的基礎(chǔ)。世界上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了超過110多種極地微型浮游植物[45], 人們已經(jīng)開始應(yīng)用eDNA技術(shù)分析極地微型浮游植物多樣性[46]。浮游植物的種群結(jié)構(gòu)和生物量及其多樣性能及時地反映極地水域生態(tài)環(huán)境的變化[47]。傳統(tǒng)研究浮游植物的多樣性及分布情況的方法是基于顯微鏡技術(shù)的形態(tài)學(xué)方法, 目前從基因組水平(eDNA分析)對浮游植物進(jìn)行研究相較于傳統(tǒng)方法有明顯的優(yōu)勢[48]。Eiler等[49]利用16S rRNA基因作為標(biāo)記的NGS技術(shù)和顯微鏡技術(shù)對南極及周邊區(qū)域的49個湖泊的浮游植物多樣性分析發(fā)現(xiàn): 雜種動物門(phylum)含量最高, 其次是藍(lán)藻(Cyano-bacteria)、隱藻(Cryptophyta)、綠藻(Chlorophyta)等。并且NGS技術(shù)的分辨率更高。

對環(huán)境的變化響應(yīng)最為直接敏感的一類是廣泛分布在海冰、湖水、冰川融水和積雪表層的極地微藻。目前使用基因組學(xué)測序?qū)O地微藻的研究仍處于基礎(chǔ)階段[50]。第一個完成全基因組測序的極地微藻是南極擬脆桿藻[51], 研究發(fā)現(xiàn)差異等位基因在不同環(huán)境下表達(dá)的豐度是不同的, 通過這些分析可以估測許多極地微藻的來源與溫帶藻類不同[50]。

浮游生物的個體大小差異大, 依據(jù)不同粒徑分級, 浮游生物類群可分為微型以及微微型浮游生物, 它們體積微小, 種類繁多, 難以檢測且許多種類缺乏明顯的形態(tài)學(xué)特點。針對北冰洋、南極附近水體中的微微型浮游生物, 研究者使用分子生物學(xué)技術(shù)對其多樣性進(jìn)行研究, 獲取了大量的微微型真核浮游生物的基因序列[52-53]。吳月等[54]利用eDNA技術(shù)對楚科奇海海域5個站位22個水層的樣品進(jìn)行微微型真核浮游生物的種群結(jié)構(gòu)和空間分布分析, 研究中通過對擴(kuò)增的18S rRNA高突變V4區(qū)基因片段序列進(jìn)行高通量測序分析, 得出: 各綱的分布存在明顯差異, 相對豐度大于1%的微微型真核浮游生物有6個綱, 分別為不等鞭毛類的金藻綱、溝鞭藻綱、中鼓藻綱、青綠藻cladeII、旋毛綱和銀耳綱, 其中自養(yǎng)型微微型真核浮游植物在北冰洋海域約占85.2%, 具有絕對優(yōu)勢。

2.4 eDNA應(yīng)用于浮游細(xì)菌研究

分布在極地海洋各個水層的浮游細(xì)菌是極地生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分之一, 一定程度上維持著極地海洋生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性和生物多樣性。在環(huán)境樣品中發(fā)現(xiàn)新的16S rRNA基因序列, 為研究者們研究微生物多樣性提供一個渠道[55]。它是通過確定細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)而評價浮游細(xì)菌多樣性的方法[56]。Dobson等[57]于1993年利用PCR擴(kuò)增的16S rRNA基因直接測序成功識別出南極高鹽湖兩個新物種和證實了16S rRNA基因序列分析在系統(tǒng)發(fā)育研究上的巨大潛力。

Zeng等[58]對16S rRNA基因進(jìn)行454焦磷酸測序揭示了北極Kongsfjorden(Spitsbergen)和Chukchi Borderland兩個水域的浮游細(xì)菌的多樣性, 研究發(fā)現(xiàn)Kongsfjorden(Spitsbergen)的浮游細(xì)菌以γ-變形菌和擬桿菌為主, 而Chukchi Borderland地表海水樣品中的以α-變形菌和放線菌為主。同時2014年Zeng等[59]利用同樣454焦磷酸測序?qū)δ蠘O阿德雷灣及長城灣附近表層海水樣品中浮游細(xì)菌多樣性進(jìn)行分析, 發(fā)現(xiàn)阿德雷灣樣品細(xì)菌可劃分為18個門類, 長城灣樣品細(xì)菌分屬于11個門類, 其中擬桿菌門、變形菌門為優(yōu)勢細(xì)菌。

Ghiglione和Murray[60]以標(biāo)簽序列焦磷酸測序方法(基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的毛細(xì)管電泳-單鏈構(gòu)象多態(tài)性方法、PCR-DGGE和DGGE條帶測序、PCR標(biāo)記測序), 即通過擴(kuò)增浮游細(xì)菌的16S rRNA基因的可變V3區(qū)、高變V6區(qū)序列分析和DGGE分析研究南極沿海浮游細(xì)菌多樣性和種群結(jié)構(gòu)變化。同時對凱爾蓋朗群島(靠近南極)以及南極半島浮游細(xì)菌進(jìn)行系統(tǒng)型鑒定, 結(jié)合Simpson和Shannon指數(shù)預(yù)測物種豐富度。研究發(fā)現(xiàn): 兩個海域的浮游細(xì)菌主要類群比例有明顯不同, 但多樣性與以往研究相似, 且在南半球夏季的浮游細(xì)菌豐度顯著高于冬季。Cao等[61]利用基于16S rRNA基因的V1-V3可變區(qū)的焦磷酸測序分析研究南極半島北端表層海域浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和群落結(jié)構(gòu)的影響因子。研究中通過所獲浮游細(xì)菌的覆蓋度、豐富度和α多樣性指數(shù)等來評估水域浮游細(xì)菌多樣性, 發(fā)現(xiàn)最豐富的細(xì)菌群是α-變形菌, 其次是γ-變形菌。研究中檢測到的環(huán)境因素營養(yǎng)鹽、葉綠素、原位溫度和鹽度等指標(biāo)對浮游細(xì)菌多樣性和群落變化的影響相對較小[61]。M?ller等[62]通過對16S rRNA基因進(jìn)行焦磷酸測序及對培養(yǎng)菌株進(jìn)行16S rRNA基因測序, 研究北極高緯度雪中和淡水湖中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。通過兩個區(qū)域的細(xì)菌多樣性分析可知, 在極地冰雪中細(xì)菌豐度高于淡水湖, 但是極地雪中和淡水湖中發(fā)現(xiàn)的屬之間有很強的重疊。

2.5 eDNA應(yīng)用于病毒研究

病毒構(gòu)成了地球上最豐富的生物實體并提供了大量的遺傳多樣性。它是指游離在水體中的各種病毒, 是水生微生物群落和生態(tài)系統(tǒng)的一個動態(tài)組成部分[63]。浮游病毒分為藻病毒、噬菌體、噬藻體, 除此以外還可發(fā)現(xiàn)一些動物病毒和人類病毒等。針對病毒的分子生物技術(shù)有PCR-DGGE、脈沖場電泳技術(shù)、隨機擴(kuò)增的多態(tài)性DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)、宏基因組文庫、克隆文庫等。從核酸水平上研究病毒動態(tài)分布和遺傳多樣性, 極大地促進(jìn)了浮游病毒群落結(jié)構(gòu)和生態(tài)學(xué)研究。eDNA技術(shù)為極地地區(qū)病毒群落結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性提供一個有潛力的新途徑。

在北極和南極海冰中都觀察到大量的病毒[64]。病毒遺傳多樣性的研究是以大量的相關(guān)遺傳信息為背景和基礎(chǔ)的, 目前已知的藻病毒、噬藻體等的全基因組序列還較少, 而南極病毒研究的主要限制是缺乏基因組序列數(shù)據(jù)。Alberto等[65]通過從南極Byers半島的Limnopolar Lake純化的2 000萬堿基對的病毒DNA進(jìn)行焦磷酸測序得到89 347個序列, 分析研究病毒群落的高度多樣性, 描述了約10 000種病毒基因型和夏季在Limno-polar Lake中發(fā)生的病毒的生態(tài)演替[66]。研究表明Limnopolar Lake中病毒群落以感染真核生物的病毒主導(dǎo)。同時Limnopolar Lake高度的遺傳豐富度表明, 在其他類群的生物多樣性較低的系統(tǒng)中, 可以發(fā)現(xiàn)較高的病毒多樣性[65]。進(jìn)一步對Limnopolar Lake的深入研究, 在整個光活躍月份和整個年度周期中更頻繁地評估病毒種群, 并結(jié)合對整個微生物群落組成的季節(jié)性動態(tài)進(jìn)行分析, 將病毒與宿主聯(lián)系起來, 說明病毒在南極水生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用[66]。

宏基因組技術(shù)在研究極地病毒上克服了多數(shù)浮游病毒種類無法培養(yǎng)的缺陷, 能直接對環(huán)境基因組序列進(jìn)行分析, 從而獲知生物基因序列信息以便進(jìn)行后續(xù)研究[67]。Daniel等[68]通過宏基因組學(xué)技術(shù)解析北極6個大型水體的病毒DNA, 分析了北極淡水病毒DNA群落結(jié)構(gòu)。在本次研究中提供了來自北極和南極的DNA病毒的深度序列數(shù)據(jù), 包括來自6個北極湖泊的病毒群落深度測序數(shù)據(jù), 并結(jié)合對來自世界各地一系列不同地理位置上已發(fā)表的淡水病毒DNA進(jìn)行了比較分析。結(jié)果表明了北極淡水病毒群落由未知和單鏈DNA病毒主導(dǎo), 揭示了一些具有雙極分布的病毒譜系及全球生物地理和病毒群落的連通性[65]; 北極地區(qū)病毒物種豐富度沒有降低, 說明病毒可能不遵循緯度多樣性梯度, 揭示了南、北兩極微生物生態(tài)系統(tǒng)之間的差異, 生物地理學(xué)和病毒群落的連通性不僅突出了極地環(huán)境的獨特性, 也突出了兩極微生物生態(tài)系統(tǒng)之間的差異[68]。Breitbart等[69]根據(jù)宏基因組學(xué)對從馬尾藻海、墨西哥灣、加拿大不列顛哥倫比亞、北冰洋的近岸水域收集到的短序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析, 研究發(fā)現(xiàn)浮游病毒群落里含有500~130 000個基因型, 其中很大一部分基因型在不同的地理區(qū)域中共同存在[70]。

3 結(jié)論

綜上所述, eDNA技術(shù)已廣泛應(yīng)用于極地水生態(tài)系統(tǒng)中魚類、底棲生物、浮游生物、浮游細(xì)菌、病毒的研究, 不限于極地生物群落多樣性、物種鑒定、生物監(jiān)測等課題。尤其基于第二代測序技術(shù)的發(fā)展, 使用eDNA技術(shù)獲取數(shù)據(jù)對極地生物進(jìn)行監(jiān)測分析的能力大幅提升, 所獲取的eDNA數(shù)據(jù)對評估一些物種的多樣性有重要參考意義, 并且使用eDNA技術(shù)能發(fā)現(xiàn)很多形態(tài)學(xué)難以識別的物種, 在分析種群結(jié)構(gòu)及其組成上可以反映出更為精確的結(jié)果, 比如物種的遺傳多樣性。隨著eDNA技術(shù)的改進(jìn), 基本解決了極地環(huán)境生態(tài)學(xué)研究上方法有限、采樣空間局限、數(shù)據(jù)信息處理慢及監(jiān)測結(jié)果不準(zhǔn)等一系列問題?？偠灾? eDNA技術(shù)在認(rèn)知極地的水生態(tài)系統(tǒng)中已扮演重要角色, 應(yīng)用上已漸趨成熟。

未來發(fā)展中, 可將eDNA技術(shù)與其他技術(shù)相結(jié)合, 以有效避免單一技術(shù)數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確造成的偏差。比如宏基因組文庫與克隆文庫結(jié)合分析能更準(zhǔn)確地反映微生物的多樣性[67]; 比如抽樣檢測[71]可盡可能避免eDNA技術(shù)在操作過程中出現(xiàn)的污染和陷阱, 提高結(jié)果的準(zhǔn)確度等。不斷擴(kuò)大eDNA技術(shù)的應(yīng)用范圍, 對極地巨大的生物資源進(jìn)行系統(tǒng)研究統(tǒng)計、完善充實數(shù)據(jù)庫、發(fā)展生物信息學(xué)工具、增加數(shù)據(jù)處理的可信度, 可繼續(xù)拓展eDNA技術(shù)在極地生物多樣性分析和環(huán)境保護(hù)中的應(yīng)用范圍, 使其進(jìn)一步應(yīng)用到食物網(wǎng)、能量流動、種群遺傳信息收集研究等方面[72]。

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PROGRESS OF APPLICATION OF eDNA TECHNOLOGY IN POLAR WATER ENVIRONMENTS

Liu Mengyue1,2, Zhao Wenyu1,2

(1Aquatic Resources Food Processing Engineering Technology Research Center of Hunan, School of Chemistry and Food Engineering, Changsha University of Science & Technology, Changsha 410004, China;2Key Laboratory of Dongting Lake Aquatic Eco-Environmental Control and Restoration of Hunan Province, School of Hydraulic Engineering, Changsha University of Science & Technology, Changsha 410004, China)

Environmental DNA (eDNA) technology has been applied to efficiently and accurately carry out research works involving species identification and diversity analysis of organisms in polar aquatic ecosystems (such as polar oceans, coastal waters, lakes, and streams). This is of great value for the development of biological resources in polar region, prediction of changes in the balance and stability of global aquatic ecosystems, and research on ecological issues in extreme habitats. In recent years, eDNA technology has developed rapidly, effectively addressing the disadvantages of traditional methods in the study of aquatic ecosystems, and improving the investigation of aquatic animals. This review describes progress in the application of eDNA technology in biodiversity analysis, species identification, population structure analysis, and other ecological research on aquatic organisms such as fish, benthic organisms, plankton, and viruses in polar aquatic environments. As a new biological survey method, eDNA technology can drastically accelerate the updating of modern biodiversity methodologies in the current molecular era, and has infinite prospects in polar aquatic biodiversity research.

eDNA, polar, water environment, aquatic organism, biodiversity

2020年1月收到來稿, 2020年2月收到修改稿

湖南省科技創(chuàng)新項目重點研發(fā)計劃(2018SK2011)、洞庭湖水環(huán)境治理與生態(tài)修復(fù)湖南省重點實驗室開放基金(2018DT02)、湖南省水生資源食品加工工程技術(shù)研究中心開放基金(2018KJY11)資助

劉夢月, 女, 1997年生。碩士, 研究方向為水環(huán)境生態(tài)學(xué)。E-mall: lmycs2020@163.com

趙文玉, E-mall: wenyuzh@csust.edu.cn

10. 13679/j.jdyj.20200004