高偉華 李玉杰 楊鴻冉 李志超 楊振國 齊魯 董建文△ 王文波△

加味陽和湯是名家名方，是董建文教授從醫(yī)40余載的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，治療骨性關(guān)節(jié)炎取得了滿意的臨床療效[1]，而且通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，加味陽和湯可抑制膝骨關(guān)節(jié)炎兔關(guān)節(jié)軟骨的退變[2]，減輕軟骨細(xì)胞的退變，延緩膠原蛋白的紊亂[3]，但是對于其起效的分子機(jī)制尚不明確。骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(Bone Morphogenetic Protein-2，BMP2)是誘導(dǎo)骨組織形成的關(guān)鍵因子，對骨與軟骨的修復(fù)有明顯的促進(jìn)作用；Sry相關(guān)組蛋白9(Sox9)在軟骨內(nèi)成骨的過程中起了關(guān)鍵的作用，是調(diào)控軟骨細(xì)胞增殖和分化的核心，Sox9可促進(jìn)軟骨細(xì)胞的生成及發(fā)育成熟，還可促進(jìn)軟骨ECM的主要組成成分Ⅱ型膠原(Col Ⅱ)的表達(dá)[4]。這與加味陽和湯對于骨性關(guān)節(jié)炎治療的現(xiàn)代作用機(jī)制相似，因此通過實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，觀察加味陽和湯對于骨性關(guān)節(jié)炎中BMP2及Sox9表達(dá)的影響，以探討其治療骨性關(guān)節(jié)炎分子機(jī)制。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

60只6月齡雄性普通級(jí)健康新西蘭大白兔，體質(zhì)量(2.70±0.32)kg，由濟(jì)南跑馬嶺動(dòng)物繁殖中心提供，合格證號(hào)為SCXK(魯)2010005。飼養(yǎng)條件：室溫控制在15～25 ℃，相對濕度維持在45%～60%，動(dòng)物飼料均由濟(jì)南跑馬嶺動(dòng)物繁殖中心提供，動(dòng)物自由攝食和飲水，飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)為山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

加味陽和湯，藥物組成包括熟地黃21 g，肉桂9 g，鹿角膠12 g，海風(fēng)藤15 g，雞血藤15 g，麻黃3 g，川牛膝12 g，白芥子15 g等，由山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中藥制劑室統(tǒng)一煎制。

按照Meeh-Rubner公式：新西蘭兔所需藥物劑量=人所需藥物劑量×兔體表面積A，A=K×W2/3×10-4，W為兔體質(zhì)量，K為常數(shù)(家兔為10，人為10.6)，計(jì)算出大鼠給藥劑量作為大鼠與成人的等效劑量。兔每只2.5 kg每次服用生藥量為12 g，濃煎為20 mL。

其他藥物：3%戊巴比妥(山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，青霉素(魯抗制藥，H37020079)。

1.3 試劑與儀器

pH8.8及pH6.8的Tris-Cl，四甲基乙二胺，30%亞甲基雙丙烯胺溶液(Acr/Bis)，10%過硫酸銨(APS)，以上均從上海生物工程公司購買。

10 mL 10%分離膠配置：蒸餾水(dH2O) 4.2 mL，pH8.8 Tris堿2.5 mL，3.3 mL聚丙稀酰胺，10%過硫酸銨 50 μL，四甲基乙二胺5 μL。

5 mL 5%濃縮膠配置：dH2O 2.75 mL，pH6.8 Tris堿1.25 mL，聚丙稀酰胺0.83 mL，2%過硫酸銨200 μL，四甲基乙二胺5 μL。

轉(zhuǎn)移緩沖液10×：甘氨酸29 g，十二烷基硫酸鈉3.7 g， Tris堿58 g，dH2O，定容至1 000 mL。

洗膜緩沖液1 000 mL：緩沖生理鹽水(TBS)1×100 mL，吐溫20(Tween20) 1 mL，蒸餾水899 mL。

緩沖生理鹽水(TBS)10×1 000 mL：12.114 g Tris 堿+ 87.75 g NaCl 蒸餾水定容。

電泳緩沖液10×pH8.3：甘氨酸144 g，十二烷基硫酸鈉10 g，Tris堿 30.2 g，dH2O 800 mL，定容至1 000 mL。

青鏈霉素雙抗配制：青霉素、鏈霉素濃度均為100 IU/mL。首先配置母液，濃度為2×104lU/mL，采用400萬單位的青霉素1瓶，100萬單位鏈霉素4瓶，加入200 mL的雙蒸水中，攪拌溶解即可，-30 ℃保存；每次使用時(shí)在100 mL的培養(yǎng)基中加入0.5 mL母液，得到濃度便為100 IU/mL。

聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)相關(guān)試劑：SYBR(DBI公司，德國)，6×上樣緩沖液、TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、核酸均購自TAKALA公司。焦碳酸二乙酯(DEPC)水(碧云天)，瓊脂糖(上海生工)，Gel Red購自Biotium公司(美國)；PCR引物均由上海華大基因公司合成；異丙醇無水、氯仿、乙醇等試劑由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。

鼠抗兔單克隆抗體BMP2，COLL Ⅱ (武漢博士德生物技術(shù)有限公司)。一抗：兔抗大鼠、小鼠、人多克隆抗體(武漢博士德生物技術(shù)有限公司)。Tunel細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(顯色法)，Wanleibio免疫組化試劑盒?？乖迯?fù)液(0.01 mol/L，pH6.0 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液)，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG(Ⅱ抗)及高敏過氧化物酶復(fù)合物(SABC)，購自武漢博士德生物工程有限公司。

石蠟切片機(jī)(Leica公司)，石蠟包埋機(jī)(Sakura公司)，LKB超薄切片機(jī)、圖像數(shù)字分析儀(Bio-RAD公司)，微量加樣器(美國Eppendorf公司)；離心機(jī)(Thermo，美國)。

1.4 方法

1.4.1動(dòng)物分組及造模 將60只成年新西蘭大白兔隨機(jī)分為三組，正常組、實(shí)驗(yàn)組和模型組，每組20只。實(shí)驗(yàn)組和對照組均給以手術(shù)制作骨性關(guān)節(jié)炎模型。

造模方法：采用改良赫爾特法(Hulth法)造模[5]，采用3%戊巴比妥耳緣靜脈麻醉后，常規(guī)剃毛、碘伏消毒，切皮后將新西蘭大白兔一側(cè)膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶于關(guān)節(jié)線水平切斷并將內(nèi)側(cè)半月板切除，采用前抽屜試驗(yàn)確認(rèn)前交叉韌帶完全斷裂，外翻測試內(nèi)側(cè)副韌帶斷裂后逐層關(guān)閉傷口。

術(shù)后常規(guī)給予青霉素50萬單位肌注3 d，每天碘伏擦拭手術(shù)切口處防止感染。術(shù)后1周開始驅(qū)趕動(dòng)物，2次/d，30 min/次，4周后造模成功。

模型組和實(shí)驗(yàn)組：每天定時(shí)給予灌胃，實(shí)驗(yàn)組給以加味陽和湯灌胃，模型組給以等量鹽水灌胃，每周灌胃6 d，休息1 d，直至動(dòng)物被處死。

1.4.2取材方法及觀察指標(biāo) 各組于灌胃后第4，6，8周分別于拍片后處死6只動(dòng)物。解剖膝關(guān)節(jié)后，取股骨髁的一部分1 cm厚的組織塊于4%多聚甲醛溶液中固定，用于組織切片；其余部分及脛骨髁精確取材，將軟骨分離后置于凍存管內(nèi)，液氮儲(chǔ)存。用 Trizol液浸泡，液氮冷凍，用于實(shí)時(shí)PCR檢測。

1.4.3免疫組化監(jiān)測Ⅱ型膠原表達(dá)

1.4.3.1石蠟切片后常規(guī)脫蠟至水，于切片滴加3% H2O2，于濕盒中孵育，PBS洗2遍，每遍沖洗3 min；采用復(fù)合抗原修復(fù)液常溫修復(fù)10 min，PBS洗3遍，每遍沖洗5 min；而后用H2O2處理標(biāo)本10 min，再用PBS沖洗3遍，每遍5 min；隨后加入稀釋的一抗(1∶100)，置于保濕盒中，4 ℃下過夜孵育，而后用 PBS沖洗3次后，滴加HRP標(biāo)記的二抗，并置于保濕盒中37 ℃孵育20 min后，PBS沖洗3次，滴加3,3′-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽(DAB)，顯色。蘇木精復(fù)染，細(xì)自來水流水沖洗，1%鹽酸分化液分化，自來水細(xì)流水沖洗。脫水、透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡觀察。

1.4.3.2實(shí)時(shí)PCR 監(jiān)測軟骨組織中BMP2和Sox9的表達(dá)情況 采用RNeasy Lipid Tissue Mini Kit試劑盒提取軟骨總RNA，按照說明書中的步驟操作，大體過程如下。勻漿處理：取出液氮中標(biāo)本，稱取50 mg，于液氮中將組織研磨成粉，然后加入1 mL溶液進(jìn)行研磨、勻漿、靜置、振蕩、孵育離心后，按照說明書進(jìn)行置換操作，吸出溶液總RNA稀釋液，進(jìn)行RNA濃度測定，行cDNA的合成、PCR引物序列擴(kuò)增(見表1)、 解凍模板、引物及SYBR。

1.4.4TUNEL監(jiān)測軟骨組織中軟骨細(xì)胞凋亡情況

石蠟切片后常規(guī)脫蠟至水后進(jìn)行TUNEL染色：

表1 引物序列

滴加0.1 % Triton X-100(0.1 %檸檬酸鈉鹽配制)50 μL，室溫放置8 min透化；然后PBS漂洗5 min，3遍；滴加3 % H2O250 μL，室溫放置10 min進(jìn)行封閉；然后PBS漂洗5 min，3遍；滴加TUNEL反應(yīng)液50 μL，保濕、避光、37 ℃孵育60 min，PBS漂洗5 min，3遍；切片取出，擦干周圍多余水分，加DAB底物50 μL，待顏色剛剛變深時(shí)迅速置于水中終止反應(yīng)。PBS漂洗，3×5 min；蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片。光鏡下觀察，計(jì)算壞死率：各組壞死率=(壞死細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。

2 結(jié)果

2.1 軟骨組織中Ⅱ型膠原表達(dá)情況

正常組Ⅱ型膠原表達(dá)量高，陽性染色分布于關(guān)節(jié)軟骨的各層，而模型組陽性染色分別不均勻，骨性關(guān)節(jié)炎時(shí)間越長陽性染色越淺，而實(shí)驗(yàn)組染色好于模型組，且分布較均勻，同一時(shí)間段內(nèi)實(shí)驗(yàn)組染色較好，且分布均勻(見圖1)。

2.2 軟骨細(xì)胞中BMP2及Sox9表達(dá)情況

結(jié)果顯示：BMP2在正常軟骨中少量表達(dá)，而在骨性關(guān)節(jié)炎的骨中有大量表達(dá)，骨性關(guān)節(jié)炎時(shí)間約久，BMP2的表達(dá)量越多，BMP2的表達(dá)量與骨性關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度表現(xiàn)出一致性，而同一時(shí)間段內(nèi)實(shí)驗(yàn)組的BMP2的表達(dá)量和模型組相比降低(見圖2a)。而Sox9表達(dá)量表現(xiàn)與BMP表達(dá)量不同。在正常組中均有大量表達(dá)，而在模型組中表達(dá)量明顯減少，骨性關(guān)節(jié)炎時(shí)間越長表達(dá)量越低，在同一時(shí)間段內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組均較模型組的表達(dá)量多，而比正常組表達(dá)量少(見圖2b)。

2.3 加味陽和湯對骨性關(guān)節(jié)炎兔軟骨組織細(xì)胞凋亡的影響

采用TUNEL法檢測各組軟骨組織中細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示：細(xì)胞核內(nèi)含有棕黃色顆粒的細(xì)胞為TUNEL陽性細(xì)胞，正常組軟骨中凋亡的軟骨細(xì)胞數(shù)量較少(圖3a)，而在模型組中同一時(shí)間段內(nèi)軟骨細(xì)胞凋亡數(shù)量較正常組明顯增加，骨性關(guān)節(jié)炎時(shí)間越久凋亡細(xì)胞數(shù)量越多，實(shí)驗(yàn)組經(jīng)治療后，細(xì)胞調(diào)亡數(shù)量減少(圖3b-h)。

圖1Ⅱ型膠原免疫組化染色圖片(×200)

圖2BMP2及Sox9表達(dá)量

圖3TUNEL法軟骨組織中細(xì)胞凋亡染色結(jié)果(細(xì)胞核內(nèi)含有棕黃色顆粒的細(xì)胞為TUNEL陽性細(xì)胞)(×200)

3 討論

骨性關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)是一種常見的慢性退行性骨關(guān)節(jié)疾病，60歲以上人群有膝骨性關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)者約61%[6]，隨著老齡社會(huì)的進(jìn)展，骨性關(guān)節(jié)炎對人類健康的影響越來越大。本病是整個(gè)關(guān)節(jié)功能喪失的疾病，病變涉及到軟骨的蛻變與重建、半月板、韌帶、滑囊及軟骨下骨的改變[7]。軟骨細(xì)胞作為軟骨內(nèi)唯一的細(xì)胞，在骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程的作用也越來越受到重視[8]。如何減少軟骨細(xì)胞的壞死，增強(qiáng)軟骨細(xì)胞的活力，是治療骨性關(guān)節(jié)炎的重要方面。在OA的藥物治療方面，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)缺乏有效的干預(yù)手段，而中醫(yī)、中藥在其預(yù)防和治療骨性關(guān)節(jié)炎方面起到了很好的作用[9-10]。但是其起效的機(jī)制尚不明確。

Sox9是一個(gè)軟骨生成的重要調(diào)節(jié)因子，對于軟骨的發(fā)育到十分重要的作用，能夠調(diào)整軟骨的成熟與分化，維持軟骨的正常表型，促進(jìn)脊髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨的分化。是維持軟骨細(xì)胞形態(tài)及功能的重要因子[4]。研究表明正常的軟骨中Sox9呈現(xiàn)高表達(dá)，而在骨性關(guān)節(jié)炎中Sox9的表達(dá)量明顯減少[11]，筆者在實(shí)驗(yàn)中也觀察到這個(gè)現(xiàn)象，骨性關(guān)節(jié)炎越重Sox9的表達(dá)量越低。而加味陽和湯能夠調(diào)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎軟骨中Sox9的表達(dá)量。Sox9的高表達(dá)能夠在一定程度上緩解軟骨細(xì)胞的凋亡。Sox9的表達(dá)受到多方面的調(diào)控，雖然有的文獻(xiàn)觀察到BMP2能夠上調(diào)軟骨細(xì)胞中Sox9的表達(dá)從而促進(jìn)Ⅱ型膠原表達(dá)[12]，這與筆者的觀察結(jié)果不一致，這可能由于BMP2在骨性關(guān)節(jié)炎中的不同作用導(dǎo)致。

BMP2被認(rèn)為是BMP家族內(nèi)活性最強(qiáng)的因子，在骨生成過程中起到重要的作用，不僅參與了軟骨成骨的過程和滑膜關(guān)節(jié)的形成過程，并且在大鼠關(guān)節(jié)軟骨的形成和維持正常形態(tài)方面起到重要的作用[13]，然而BMP2在骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生及發(fā)展方面起到的作用目前仍有爭議[14]。研究表明正成人的軟骨中BMP2的表達(dá)量很少[15]，而且在不同時(shí)期骨性關(guān)節(jié)炎軟骨中的表達(dá)量也不盡相同，BMP2在骨性關(guān)節(jié)炎的增生骨贅[15]、滑膜及半月板[13]及血液中表達(dá)量明顯增高[16]，而且骨性關(guān)節(jié)炎時(shí)間越久BMP2的表達(dá)量越高[16]，這與筆者的觀察結(jié)果一致。而有的研究顯示高表達(dá)BMP2后并不能引起關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)的改變[17]；也有部分研究顯示BMP-2在正常軟骨的淺層表達(dá)，對于維持關(guān)節(jié)功能起到重要的作用[13]，BMP2的高表達(dá)在骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生過程中能夠促軟骨的修復(fù)，促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖[18]，能夠?qū)切躁P(guān)節(jié)炎的軟骨起到保護(hù)作用[14]。因此，筆者推測對于BMP2在維持骨性關(guān)節(jié)炎正常軟骨功能方面有重要的作用，在進(jìn)展期骨性關(guān)節(jié)炎的高表達(dá)可能與實(shí)驗(yàn)取材的部位(例如滑膜、軟骨及增生骨贅)不同及骨性關(guān)節(jié)炎的造模方法有關(guān)系，OA發(fā)病時(shí)不同實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)的BMP2不一致變化，可能是實(shí)驗(yàn)中僅觀察到BMP2變化的結(jié)果，但其在OA發(fā)病中的作用還需要進(jìn)一步研究來明確。

筆者在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)了BMP2與骨性關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度存在一定的關(guān)聯(lián)性，BMP2對于維持關(guān)節(jié)功能有重要的作用，而對于BMP2在進(jìn)展期關(guān)節(jié)炎的表達(dá)增高可能與骨性關(guān)節(jié)炎期間的骨贅及滑膜增生及細(xì)胞外基質(zhì)退變有關(guān)系。筆者推測加味陽和湯能夠改善骨性關(guān)節(jié)炎的分子機(jī)制：可能通過下調(diào)膝關(guān)節(jié)中BMP2的表達(dá)量，從而減緩骨性關(guān)節(jié)炎期間的骨贅及滑膜增生及細(xì)胞外基質(zhì)蛻變以及上調(diào)骨性關(guān)節(jié)炎軟骨中Sox9的表達(dá)量，促進(jìn)Ⅱ型膠原的表達(dá)，以減少軟骨細(xì)胞的凋亡；但BMP2及Sox9在骨性關(guān)節(jié)炎中的相互關(guān)系仍需要進(jìn)一步研究。